标题：新辅助和辅助奥希替尼治疗IA期至IIIA期EGFR突变型非小细胞肺癌
杂志：Journal of thoracic oncology
摘要
引言：对于携带表皮生长因子受体（EGFR）突变的IB期至IIIA期非小细胞肺癌（NSCLC）患者，术后三年辅助奥希替尼治疗已成为标准治疗方案。然而，在围手术期中，新辅助奥希替尼治疗的作用尚未明确，目前正在通过Neo ADAURA研究（NCT04351555）进行探讨。
方法：本研究为单中心的探索性试验，纳入携带激活性EGFR突变（包括第19号外显子缺失和L858R突变）的临床IA期至IIIA期非小细胞肺癌（NSCLC）患者（根据AJCC第8版分期标准）（NCT04816838）。患者接受两周期（28天/周期）新辅助奥希替尼治疗后进行手术切除，并随后进行为期3年的辅助奥希替尼治疗。主要研究终点是新辅助治疗2个周期后的客观缓解率（ORR）。次要研究终点包括病理完全缓解率（pCR）和主要病理缓解率（MPR）。探索性目标包括通过纵向循环肿瘤DNA（ctDNA）检测（Signatera）评估其与新辅助奥希替尼治疗反应的相关性。
结果：本研究共纳入25例患者，均接受了新辅助奥希替尼治疗，并完成了R0切除的手术。客观缓解率（ORR）为44%（n=11），均为部分缓解（PR）。在新辅助奥希替尼治疗后，14例患者（56%）显示疾病稳定（SD）。主要病理缓解率（MPR）为24%（n=6），而病理完全缓解率（pCR）为0%。所有患者均未接受辅助化疗。中位随访时间为31个月（范围：13.8–38.6个月），但中位无病生存期（DFS）尚未达到。6例患者（30%）在基线时ctDNA检测呈阳性，在接受1周期的新辅助奥希替尼治疗后实现了ctDNA清除。在新辅助治疗期间未观察到3级不良事件（AEs）。
结论：两周期新辅助奥希替尼治疗未达到其主要终点客观缓解率（ORR）。然而，对于可切除的EGFR突变型非小细胞肺癌（NSCLC）患者，新辅助奥希替尼是一种可行的治疗策略，并具有可控的安全性特征。
正文内容：
引言
在非小细胞肺癌（NSCLC）中，EGFR基因突变在西方人群和东方人群中的致癌驱动突变比例分别占10%–15%和30%–40%。奥希替尼是一种第三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI），已被用于不可切除的III期NSCLC患者的巩固治疗、IV期转移性NSCLC的治疗，以及可切除NSCLC患者的辅助治疗。此前，包括在RADIANT研究中的厄洛替尼以及在CTONG1103和IMPACT研究中使用的吉非替尼等第一代TKI，在作为辅助治疗时均未能显示总生存期（OS）的获益。目前，对于携带EGFR活化突变（包括第19号外显子缺失和L858R突变）的IB-IIIA期NSCLC患者，辅助奥希替尼治疗3年仍是标准治疗方案。
尽管辅助奥希替尼治疗改善了无病生存期（DFS）和总生存期（OS），但仍有部分患者在完成3年的治疗后出现局部区域复发或远处复发。在转移性病例中接受奥希替尼治疗的患者中，已识别出多种获得性靶点相关和非靶点相关的耐药机制。然而，在辅助治疗后复发患者中的耐药机制尚未被充分报道。有学者推测，尽管手术能够显著减少肿瘤负荷，但可能仍然存在对辅助奥希替尼耐受的残存癌细胞。在早期且可切除的EGFR突变型NSCLC中，癌细胞如何在治疗条件下逃避免疫凋亡的机制，尤其是在辅助治疗背景下，目前尚未被完全阐明。
随着靶向治疗在围手术期治疗中的应用日益突出，对于奥希替尼在围手术期治疗中耐药机制的临床意义的深刻理解仍是一个未被满足的需求。目前，奥希替尼作为新辅助治疗的应用正在III期NeoADAURA研究中进行评估，该研究针对II-IIIB期N2 NSCLC患者（NCT04351555）。近期的一项II期前瞻性临床试验评估了奥希替尼作为围手术期治疗的疗效和安全性，结果显示其主要病理缓解（MPR）率为14.8%，且未观察到病理完全缓解（pCR），提示奥希替尼作为新辅助治疗在诱导病理完全缓解方面存在一定的局限性。然而，导致肿瘤不能显著退缩的内在机制尚未被阐明。此外，与针对无EGFR或ALK突变患者采用化疗联合围手术期免疫检查点抑制剂的治疗方案相比，奥希替尼的MPR和pCR率相对较低。
本文报道了接受两周期（每周期28天）新辅助奥希替尼治疗后进行手术切除，并随后接受为期3年辅助奥希替尼治疗的患者的临床疗效（NCT04816838）。
方法
试验设计与患者招募
本研究为单中心试点研究。纳入对象为经组织学或细胞学确诊的、携带激活性EGFR突变（外显子19缺失或L858R突变）的可手术切除的临床IA-IIIA期非小细胞肺癌（NSCLC）患者。对于III期患者，要求通过支气管镜超声引导下的纵隔淋巴结病理评估进行肿瘤分期。
一般纳入标准包括：年龄大于18岁，东部肿瘤协作组（ECOG）体能状态评分为0或1，骨髓及器官功能正常，以及符合RECIST 1.1标准的可测量病灶。排除标准包括：存在基础间质性肺病、活动性第二恶性肿瘤或无法控制的系统性疾病的患者。所有患者在入组前均需进行多学科讨论以评估手术切除的可行性，手术切除的可行性由胸外科医生最终决定。
肿瘤分期评估包括对比增强CT、正电子发射断层扫描（PET）以及脑部磁共振成像（MRI）。肿瘤反应采用实体瘤疗效评价标准（RECIST v 1.1）进行评估，具体为在新辅助奥希替尼治疗8周后通过胸部CT检查评估，随后术后每2个月评估一次，持续至1年；之后每隔3个月评估一次，持续至4年。随访期间的脑部MRI评估并非必需。
不良事件（AEs）及临床意义明确的实验室异常按照美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准（NCI-CTCAE）4.3版本进行分级。本研究严格遵循研究方案开展，所有患者均签署了书面知情同意书。研究遵循《赫尔辛基宣言》相关伦理原则，并获得机构伦理委员会（IRB: 4-2020-1335）的批准。
治疗方案
患者接受新辅助奥希替尼治疗，剂量为80 mg，每日口服一次，以28天为一个周期，持续2个周期。患者在手术当天或术前最多3天，根据研究者的判断停止用药。术后计划给予辅助奥希替尼治疗，剂量为80 mg，每28天为一个周期，持续3年。辅助化疗为可选项，由研究者根据具体情况决定是否实施。
研究目标与终点
本研究的主要目标是基于RECIST 1.1标准，通过评估客观缓解率（ORR），探讨2个周期新辅助奥希替尼治疗对携带EGFR突变的早期可切除非小细胞肺癌（NSCLC）患者的临床疗效。次要目标包括病理完全缓解率（pCR）、主要病理缓解（MPR）、无病生存期（DFS）、事件生存期（EFS）、总生存期（OS）以及治疗相关不良事件（TRAEs）。pCR定义为切除肿瘤标本中无活性肿瘤细胞（0%）；MPR定义为切除肿瘤标本中残留活性肿瘤细胞比例少于10%。DFS定义为从根治性手术开始至肿瘤复发、进展或死亡的时间间隔；EFS定义为从影像学复发、进展或死亡的时间间隔；OS定义为从首次接受新辅助奥希替尼治疗至因任何原因导致死亡的时间间隔。探索性目标包括通过Signatera ctDNA检测评估EGFR突变、其他热点突变以及变异等位基因频率（variant allele frequencies, VAF）的变化情况。
统计分析
样本量的计算基于此前CTONG 1103试验中使用厄洛替尼的新辅助治疗数据。历史对照数据显示，接受新辅助双药化疗的患者的客观缓解率（ORR）为34%（P0 = 34%）。本研究采用单组二项分布设计，假设奥希替尼组的ORR为65%或更高（P1 = 65%）。在双侧显著性水平α = 0.05和统计功效为87%的条件下，共招募25例患者参与研究。采用描述性统计方法评估患者的基线特征。安全性和疗效分析针对所有入组患者进行。无病生存期（DFS）、事件生存期（EFS）及总生存期（OS）的估算采用Kaplan-Meier方法。数据分析使用统计软件包SPSS 27.0版本（IBM公司，美国伊利诺伊州芝加哥；RRID:SCR_002865）和GraphPad Prism 10.0软件（GraphPad软件公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥；RRID:SCR_002798），双侧p值<0.05时认为具有统计学显著性。瀑布图和柱状图通过R语言中的ggplot2包（RRID:SCR_014601）绘制。在分析不同EGFR突变状态下临床特征差异的柱状图中，组间显著性检验采用Fisher精确检验。
个性化、肿瘤特异性的ctDNA检测
在新辅助奥希替尼治疗前、C2D1（第2周期第1天）、手术当天（奥希替尼治疗8周时）、术后每两个月（直至术后1年），以及随后两年内每三个月，均对患者进行循环肿瘤DNA（ctDNA）评估。个性化、肿瘤特异性的ctDNA分析依据先前描述的方法，通过研究用途限制的定制化检测（Signatera™ RUO，Natera公司）对存档样本进行检测。具体而言，在22名患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织及匹配的正常血液样本上，于癌症中心完成全外显子测序（WES），并将数据共享至Natera公司。最终成功为其中20名患者设计了Signatera检测方案。从WES结果中选取多达16个患者特异性体细胞单核苷酸变异（SNVs），用于多重PCR（mPCR）分析。针对个性化SNVs设计的mPCR引物用于追踪相应患者血浆样本中的ctDNA。血浆样本中检测到≥2个超出预设置信阈值的SNVs时，被定义为ctDNA阳性。ctDNA浓度以每毫升血浆中平均肿瘤分子数（MTM/mL）报告。ctDNA清除的定义为：在ctDNA阳性时间点之后检测出ctDNA阴性，且在随后的所有检测时间点中持续为阴性状态。
全外显子测序的文库制备与测序
使用DNeasy Blood & Tissue试剂盒（Qiagen公司，德国希尔登；RRID:SCR_008539）从所有样本中提取基因组DNA（gDNA）。通过琼脂糖凝胶电泳和PicoGreen双链DNA检测（Invitrogen公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆；RRID:SCR_008410）评估gDNA的浓度和纯度。从组织样本（新辅助治疗前：22份样本；新辅助治疗后：25份样本）以及匹配的正常血液样本中，使用SureSelect v6试剂盒（Agilent Technologies公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉；RRID:SCR_013575）构建外显子文库，并在NovaSeq 6000测序平台（Illumina公司，美国加利福尼亚州；RRID:SCR_010233）上进行测序。
突变检测平台
测序读取的序列比对至人类基因组参考序列（hg19）。突变检测使用Illumina Dragen平台（v3.10）完成。对于体细胞突变的检测，在全外显子测序（WES）中采用匹配的正常样本与肿瘤样本数据进行分析。提取非同义变异，并筛选Cosmic数据库中的基因。体细胞突变的筛选标准为：突变等位基因频率（MAF）> 0.01。所有突变均通过Oncotator进行注释。拷贝数变异（CNV）通过CNVkit（etal/cnvkit）进行分析，定义拷贝数>5为扩增，<1为深度缺失。
研究结果
NORA是一项单中心的“治疗窗口”研究，纳入了25例携带EGFR激活突变（包括外显子19缺失和L858R突变）的早期、可切除IA-IIIA期非小细胞肺癌（NSCLC）患者。这些患者接受了新辅助奥希替尼治疗。研究的入组时间为2021年6月至2022年3月（补充图S1）。
患者人口学特征及基线特征
研究中患者的中位年龄为64岁（范围：59-66岁），其中17例（68%）为女性（表1）。大多数患者为从未吸烟者（n=19，占76%）。根据疾病分期，IA期和IB期患者分别占32%（N=8）和28%（N=7），其次是IIA期（N=4，占16%）、IIB期（N=4，占16%）以及IIIA期（N=2，占8%）。所有患者均接受了PET扫描和脑部MRI检查，此外有11例患者（44%）进行了纵隔分期的经支气管超声引导针吸活检（EBUS）。所有患者的组织学类型为腺癌。其中，EGFR外显子19缺失突变（Ex19del）和L858R突变分别存在于40%（N=10）和60%（N=15）的患者中。
新辅助奥希替尼的临床疗效
所有患者均完成了2个周期的新辅助奥希替尼治疗。研究的主要终点未达到，观察到的客观缓解率（ORR）为44%（n=11），均为部分缓解（PR），另有56%（n=14）的患者病情稳定（SD）（图1）。不同EGFR突变类型（Ex19del和L858R）间的ORR无显著差异（补充图2A）。
所有患者均接受了R0切除（表1）。经过新辅助奥希替尼治疗后，有20例（80%）患者的病理T分期下降，3例（12%）患者出现淋巴结降期（补充表S1）。尽管辅助化疗是可选的治疗方案，但所有患者均未接受以铂类为基础的辅助化疗。研究者认为，在手术前应用奥希替尼，并在术后继续使用奥希替尼作为辅助治疗，而非细胞毒化疗，更符合治疗逻辑。最常见的手术方式为肺叶切除术（n=21，占84%）（补充表S2）。术后并发症发生率为20%（n=5），包括1例患者出现气漏时间延长（>5天）、3例乳糜漏以及1例肺炎。延迟性并发症（>30天）包括肺动脉栓塞（n=2）及胸腔积液（n=1）。微小病灶残存率（MPR）为24%（n=6），无患者达到完全病理缓解（pCR）。不同EGFR突变类型（Ex19del和L858R）间的MPR无显著差异（补充图2B）。肿瘤床中残留的存活肿瘤、坏死及基质比例如图1所示。病理学回归率超过50%的患者占68%（n=17）。
中位随访31个月的疗效评估
在中位随访31个月（范围：13.8–38.6个月）期间，中位无病生存期（DFS）、无事件生存期（EFS）和总生存期（OS）均未达到（补充图3）。在无病生存期方面，不同EGFR突变类型（Ex19del和L858R）、TP53突变状态、客观缓解率（ORR）、微小病灶残存率（MPR）以及病理消退（>50% 或<50%）之间均未观察到统计学显著差异（补充图4）。
截至数据截止日期（2024年8月9日），96%（N = 24）的患者继续接受奥希替尼作为辅助治疗。其中一例患者（YUHS 013）因在辅助治疗期间出现不耐受而中止治疗，并发生疾病复发。该患者在两侧肺部均检测到复发病灶（补充表S3）。由于转移部位无法通过CT引导的针吸活检（NAB）或支气管镜到达，未能对该患者进行再次活检。此外，在不同EGFR突变类型（Ex19del和L858R）之间，客观缓解率（ORR）和微小病灶残存率（MPR）同样未表现出显著差异（补充图3 A、B）。
不良反应评估
在25名患者中，有12名（48%）患者在接受新辅助奥希替尼治疗期间经历了至少一种与治疗相关的不良事件（TRAE）（表2）。最常见的不良事件为1级皮疹（n=5，占20%）、厌食（n=4，占16%）和瘙痒（n=3，占12%）。大多数不良事件均为1级。在新辅助治疗期间，未发生3级不良事件，也未有患者因不良事件而需要减量或中止治疗。仅有1名患者（4%）因感染新冠病毒而暂停治疗。在辅助奥希替尼治疗期间，60%（n=15）的患者出现了治疗相关不良事件（TRAE），且主要局限于1级和2级，包括1级和2级的指甲改变（n=4，占16%）、1级皮肤干燥（n=3，占12%）以及1级皮疹（n=3，占12%）。此外，观察到3级中性粒细胞减少症（n=1，占4%）、贫血（n=1，占4%）及肌酸磷酸激酶（CPK）升高（n=1，占4%）。在辅助治疗期间，未出现4级或5级的治疗相关不良事件。在辅助奥希替尼治疗中，有4名患者（16%）因不良事件减量、8名患者（32%）因不良事件中断治疗，以及1名患者（4%）因疾病进展而终止治疗。
ctDNA 分析
为20名患者设计了个性化的ctDNA检测方案。其中5名患者中，有3名因组织标本不足无法进行全外显子组测序（WES），另有2名患者未能通过Signatera检测方案设计的质量控制参数（QC）。在新辅助治疗前，有6名患者（30%）检测到ctDNA阳性（包括2例I期患者、2例II期患者和2例III期患者）（图2）。经过1个周期的新辅助奥希替尼治疗后，所有患者的ctDNA均实现了完全清除。术后中期分析显示，在19名未发生复发的患者中，18名（95%）的ctDNA检测结果为阴性，表明ctDNA结果与疾病状态之间具有高度一致性。
在接受新辅助奥希替尼治疗的患者中，治疗前ctDNA阳性和阴性患者的客观缓解率（ORR，包括部分缓解和病情稳定）无显著差异（补充图2C）。
此外，一名患者（YUHS 003）在术后17.7个月、接受辅助奥希替尼治疗期间，ctDNA由阴性转为阳性。然而，截至数据分析日期，该患者在常规CT扫描中并未显示复发迹象。另一名患者（YUHS 013）在接受辅助奥希替尼治疗期间ctDNA检测结果始终为阴性，但在治疗中断后2.6个月发生复发。由于在治疗中断后及复发前未进行额外的ctDNA检测，无法获得更多时间点的ctDNA数据。目前，所有接受辅助奥希替尼治疗的患者的后续ctDNA检测分析仍在进行中。
共存突变分析
对新辅助奥希替尼治疗前（N=22）的样本进行全外显子组测序（WES）显示，CRLF2 和 P2RY8 突变分别存在于32%（N=7）的患者中（图3A）。此外，TP53 和RBM10 突变分别在14%（N=3）和9%（N=2）的患者中被检测到。在手术切除后的奥希替尼治疗样本（N=25）中，CRLF2 和 P2RY8 突变的检测率分别升高至36%（N=9），其次是TP53（24%，N=6）和 MUC16（16%，N=4）突变（图3B，补充图S5）。值得注意的是，TP53 突变在奥希替尼治疗后的样本中富集，且在 L858R 突变患者群体（N=4）中的比例高于E19del 突变群体（N=2）。
讨论
本研究报告了一个“机会窗口”试验的结果，该试验评估了新辅助奥希替尼治疗后手术切除以及术后辅助奥希替尼治疗在可切除IA-IIIA期EGFR突变型非小细胞肺癌（NSCLC）患者中的临床安全性和疗效。研究未达到其假设的主要终点，即客观缓解率（ORR）为65%或更高。经过2个28天周期的新辅助奥希替尼治疗，ORR为44%，低于此前报道的两项研究结果：在NEOS II期试验中，可切除II-IIIB期患者的ORR为71%；而在另一项针对III期EGFR突变型NSCLC的新辅助奥希替尼治疗后联合序贯放疗和/或手术的II期研究中，ORR高达95%。新辅助奥希替尼的ORR与上述研究结果的差异可能与以下因素有关：本研究中入组患者多数为早期（IA期和IB期，占32%）；此外，样本量不足也可能限制了对新辅助奥希替尼治疗在手术切除前作用的进一步验证。围手术期奥希替尼治疗的不良事件（AEs）具有可控性。在新辅助治疗期间未观察到任何3级不良事件，但在辅助治疗阶段观察到3例3级不良事件，分别为中性粒细胞减少、贫血和肌酸磷酸激酶（CPK）升高。仅有1例患者因无法耐受而永久停用辅助奥希替尼。与此前研究中报道的不良事件数据（腹泻和皮疹占比分别为52%和41%）相比，本研究中上述不良事件的发生频率明显较低。
截至数据截止时，仅1例患者出现复发，且无病生存期（DFS）数据尚不成熟，无法根据EGFR或TP53突变状态进一步分析治疗结果。尽管病理学结局（如病理完全缓解[ pCR ]或主要病理缓解[ MPR ]）是否可作为总生存期（OS）的替代终点仍存在争议，但持存肿瘤细胞（即DTPs）的存在对于理解为何新辅助奥希替尼未能实现pCR具有重要意义。本研究结果与一项此前的II期研究一致，该研究同样纳入接受两周期（28天/周期）新辅助奥希替尼治疗的患者，且无一例患者实现pCR。类似地，在一项针对可切除II-IIIB期EGFR突变型NSCLC的IIb期研究中，接受6周新辅助奥希替尼治疗的40例患者中，仅1例（3.6%）实现pCR。本研究的初步结果显示，与上述针对奥希替尼的靶向治疗研究结果相似的治疗反应。上述结果进一步强调了探究干扰EGFR突变型NSCLC肿瘤退缩的内在机制的必要性。我们观察到，即使经过8周的奥希替尼治疗，肿瘤细胞仍然存在，并且在EGFR L858R和E19del突变患者中均未见病理完全缓解（pCR）。在早期可切除的EGFR突变型非小细胞肺癌（NSCLC）中，尽管接受了治疗，癌细胞如何逃避免疫凋亡的机制仍然知之甚少。药物耐受性持存细胞（DTPs）的生物学和免疫学基础研究受限于患者样本的获取不足。已有的临床前模型研究表明，高水平的YAP/TEAD通路活性可通过上皮-间质转化（EMT），使癌细胞以类衰老的休眠状态存活。为此，我们正在通过成对单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行更深入的分析，以探索相关机制。目前，对于初治且不可切除的EGFR突变型非小细胞肺癌（NSCLC），已探索出多种联合治疗策略。例如，加入细胞毒性化疗或采用Amivantamab进行前期MET抑制治疗，均显示出改善无进展生存期（PFS）的效果。在EGFR 19del或L858R突变的晚期NSCLC中，大约有5-10%的患者会发生组织学转化，包括转变为鳞状细胞肺癌。然而，据我们所知，目前尚未有关于新辅助奥希替尼治疗后发生组织学转化的公开报道。在本研究中，接受手术切除的标本中未观察到组织学转化现象。尽管当前药物研发更多聚焦于如抗体-药物偶联物（ADCs）等靶向治疗，但未来研究中，深入理解药物耐受性持存细胞（DTPs）的机制以及如何阻止肿瘤细胞通过这一通路进展仍然至关重要。进一步的研究有必要明确DTPs在NSCLC中的机制性作用，从而为更有效的治疗策略奠定基础。
结论
综上所述，对于可手术切除的IA-IIIA期EGFR突变型非小细胞肺癌（NSCLC）患者而言，新增两周期的新辅助奥希替尼治疗是一种可行的选择。本研究虽未达到客观缓解率（ORR）的主要研究终点，但未发生手术取消的情况，且围手术期奥希替尼的不良事件均可控。本研究的局限性包括样本量较小，以及未对奥希替尼治疗前后样本进行深入的单细胞RNA测序分析，因而未能明确新辅助奥希替尼治疗下病理反应缺乏的潜在机制。尽管在20例（80%）患者中观察到病理学T分期的降期，在3例（12%）患者中观察到N分期的降期，但无患者达到病理完全缓解（pCR）。这一现象提出了一个重要问题，即对于治疗后仍有残留病灶的患者，我们是否需要加强治疗。目前尚不清楚针对药物耐受性持存细胞（DTP）的治疗组合是否适用于EGFR突变型患者。本研究还强调了新辅助奥希替尼在一个周期（28天）内实现ctDNA清除的作用。在辅助治疗阶段，持续收集和分析ctDNA可能有助于进一步明确ctDNA监测在预测治疗反应中的作用。未来，将ctDNA整合生物标志物可能成为监测DTP状态及识别适合治疗强化的亚群患者的有力工具。
