β-Elemene 通过 TFEB 介导的 GPX4 降解诱导 EGFR 宽型非小细胞肺癌铁死亡

肺癌是世界上最致命的肿瘤，肺癌的发病率在中国所有肿瘤中排名第一。到目前为止，肺癌的五年生存率为 <19%，死亡率 没有下降。目前还没有有效的长期治疗方法。在肺癌类型中，NSCLC 占 80% 以上。大多数有症状的患者被发现处于晚期。约 18% 的晚期患者可以接受手术治疗，其余大部分患者仍需要药物治疗。尽管 EGFR 靶向治疗开创了 NSCLC 治疗的新时代，但关键的不足 — 低反应率和耐药性影响了临床疗效。EGFR 突变型患者将获得实质性的益处，而 EGFR 野生型患者则无法获得任何益处，占 NSCLC 病例的 75%-80%。此外，早期耐药性和较差的生存率是 EGFR 野生型 NSCLC 患者的主要障碍。因此，为 EGFR 野生型 NSCLC 患者寻找有前途的治疗策略是必要的。干扰多种生物过程可以提高 NSCLC 治疗的疗效，包括自噬、铁死亡等。最近，人们非常关注铁死亡，这是一种受调节的细胞死亡，由铁依赖性脂质过氧化驱动。

自十年前发现铁死亡以来，许多研究已经说明了铁死亡对抗癌的积极作用。在肿瘤细胞和免疫细胞中诱导铁死亡可以抑制肿瘤发生和进展。相反，铁死亡逃避可能促进癌症的发展和转移 。癌细胞的生理机能依赖于铁。癌细胞对铁的添加性更强，铁和 ROS 负荷高，因此，它们容易受到铁和脂质过氧化的增强，这容易导致铁死亡。因此，靶向铁死亡是治疗 NSCLC 的一种很有前途的策略。

由于磷脂过氧化物酶 GPX4 是对抗铁死亡的最强大防御，因此抑制 GPX4 因触发铁死亡而引起了相当大的关注 。GPX4 是一种硒蛋白，具有通过抑制复杂的氢过氧化物来破坏脂质过氧化链反应的独特功能。通过小分子 RSL3 和 erastin 抑制 GPX4 导致脂质过氧化和随之而来的铁死亡的强烈增加 。GPX4 可以泛素化和降解以触发铁死亡 。靶向蛋白质的泛素化作为分子信号将这些蛋白质转移到溶酶体进行降解。TFEB 是溶酶体的主要调节因子，通过促进溶酶体生物发生的基因转录来激活溶酶体。最近，TFEB 被认为是信号网络的枢纽，使其成为癌症治疗的可成药靶点。抗癌药物诱导的 TFEB 激活可能有助于溶酶体介导的铁死亡负调节因子（如铁蛋白）的降解，从而触发铁死亡。尽管最近报道了 CMA 介导的 GPX4 降解但 TFEB 对 GPX4 泛素化和溶酶体降解的调节尚未阐明。

与靶向治疗药物的开发不同，一些天然产物的开发不是基于它们对特定靶向蛋白的作用，而是基于它们有希望的抗癌效果和低毒性。许多天然产物已被证明可抑制 NSCLC，但无 EGFR 突变。例如，银杏素对 EGFR 野生型NSCLC有很好的效果。Shikonin 和 Marsdenia tenacissima 提取物通过使 EGFR 野生型 NSCLC 细胞对吉非替尼疗法敏感来增强抗癌功效。此外，患有 EGFR 野生型晚期 NSCLC 的老年患者可能从中草药中获得更大的生存获益 。

β-ELE来源于温玉锦姜黄，是榄香烯的主要成分，已获得中国国家药品监督管理局批准，并在中国临床上广泛用于 NSCLC 治疗。多项研究表明 β-ELE 的抗肺癌作用以及导致抗癌作用的潜在信号通路 。纳米技术用于提高 β-ELE 的稳定性和生物利用度。脂质纳米颗粒 （LN） 的早期版本成功用于制造 Elemene 脂质体，该脂质体含有 85% 的 β-ELE，在中国临床上被广泛用作抗癌药物。随后具有更好稳定性的 LN，如纳米结构脂质载体 （NLC） 和固体脂质纳米颗粒 （SLN） 也被开发用于携带 β-ELE。最近，据报道，基于亚锡的新型纳米载体纳米片携带β-ELE，以提高其靶向和抗癌活性。然而，β-ELE 的靶标并未完全说明，尤其是基于配体 - 蛋白质结合测定。阐明天然来源的抗癌药物诱导的机制将发现有助于抗癌作用的新分子事件，这将为NSCLC 提供有效的治疗策略。例如，拓扑异构酶 I 抑制剂作为抗癌药物的发现和应用是由于对源自中国树的天然产物喜树碱 Camptothecin 的机械研究 。阐明微管作为紫杉醇的抗癌靶点，紫杉醇是一种源自红豆杉树的天然化合物，短叶红豆杉，开启了微管抑制剂抗癌应用的新时代。因此，确定 β-ELE 可以靶向的靶点和过程将为新型有效的抗癌方法提供胶水。最近，据报道 β-ELE 可诱导肺癌铁死亡。基于蛋白质-配体结合表面等离子体共振（SPR） 的“金”标准测量，我们发现 β-ELE与TFEB具有结合亲和力。TFEB 对 GPX4 降解和随之而来的铁死亡事件的上游调节仍处于起步阶段。天然化合物β-ELE 均对 TFEB 和铁死亡有影响，使用β-ELE 研究 TFEB 对 GPX4降解和铁死亡的影响将有助于阐明TFEB介导的GPX4 溶酶体降解过程不明确，可开发为铁死亡诱导和抗NSCLC治疗的新策略。

试剂和抗体

β-ELE购自LKT Labs Co.， Ltd（美国明尼苏达州圣保罗，纯度≥98%）。将β-ELE溶于无水乙醇（E7148，美国默克，纯度≥99.5%）中，并稀释至所需浓度。抗体的使用如下：GAPDH（60004–1，Proteintech）、PCNA（2586，Cell Signaling Technology）、溶质载体家族 7 成员 11 （SLC7A11）（12691，Cell Signaling Technology）、磷酸化 TFEB （Ser122）（86843，Cell Signaling Technology）、核纤层蛋白 B1（13435，Cell Signaling Technology）、泛素 （P4D1）（3936，Cell Signaling Technology）、FTH（4393，Cell Signaling Technology）、磷酸化 TFEB （Ser211）（37681，Cell Signaling Technology）、14–3-3（8312， Cell Signaling Technology）、GPX4（ab125066，Abcam）、LAMP1（sc-20011，Santa Cruz Biotechnology）、TFEB（ab267351，Abcam）、Ferritin（ab75973，Abcam）。

SPR 检测

在带有 GE 系列 S CM5 传感器芯片的GE Life Sciences Biacore S200 中进行 SPR 分析。简而言之，TFEB（OriGene，MD，USA） 通过其胺基共价固定在芯片表面。蛋白质的固定水平约为 4200 RU。不同浓度的 β-ELE（从50μM到 3.125 μM 的2倍稀释液）飞过芯片表面，并实时监测它们与 TFEB 的相互作用。使用不含固定蛋白和无化合物溶液的参考通道减去任何非特异性信号。整个系统在 10 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、0.05% P20、2% DMSO 和 25 °C 的受控温度下运行。使用 GE Biacore S200 控制软件分析数据。

分子对接

AutoDock Vina （Vina，版本 1.1.2） 在本研究中用作分子对接程序。可采用半柔性对接方式操作，对接准确率达 78%。β-ELE （CID：6918391） 的 3D 结构是从 PubChem 的化学数据库中检索的。蛋白质 TFEB 的 3D 结构由中国科学院大学的 Pengfei Fang 博士友情提供。TFEB 蛋白为受体，β-ELE 为配体。使用 AutoDock Vina 4.2 版 （ADT4.2） 进行对接计算。蛋白质和配体上样于 ADT 中。受体蛋白用水溶剂化，仅加入极性氢。在 ADT4.2 中建立受体网格框 （X、Y、Z 维度），并生成蛋白质的 pdbqt 文件。蛋白质-配体复合物通过 PyMOL 软件 （PyMOL Molecular Graphics System， Version 4.3.0 Schrödinger， LLC， San Diego， CA， USA） 进行可视化和分析。

细胞培养

A549 细胞购自美国典型培养物保藏中心 （ATCC， USA）。NCI-H460 和 SPC-A-1 细胞来自中国科学院细胞库（中国上海）。使用罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 1640（Gibco，Thermo Fisher Scientific， Inc.）和 10% FBS（Gibco，Thermo Fisher Scientific， Inc.）、100 U/mL 青霉素和 100 mg/L 链霉素（HyClone，美国）在 5% CO 中培养 NSCLC 细胞2在 37 °C 时。每 1 或 2 天更换一次培养基，解冻后将 NSCLC 细胞扩增至第 10 次传代（对数期），然后用于进一步研究。

建立 TFEB 敲除细胞

编号 A549TFEB KO细胞是通过 CRISPR/Cas9基因组编辑系统建立的。The TFEBKO基于CRISPR 质粒的 CRISPR 质粒由 WZ Biosciences（中国山东）设计和生产。单向导 RNA （sgRNA）序列为 5′-GCGGGAGCGCATGCAGCAAC-3′ 以破坏 TFEB基因。要生产慢病毒，需要 7 × 105将 HEK 293 T 细胞接种在 6cm培养皿中，第二天使用 Lipo3000 转染试剂（L3000015，Invitrogen）用 6 μg CRISPR 质粒、5 μg psPAX2 和 2.5 μg pMD2.G 转染。8小时后，去除含有转染试剂的培养基，加入新鲜培养基。转染后 48 小时收获上清液悬浮液，并储存在 -80 °C。为了构建敲除细胞，将 A549 细胞以 5 × 10 的密度接种到 6 孔板中5细胞，随后感染 TFEBKO质粒编码慢病毒整整两天。然后在含有 20 μg/mL 嘌呤霉素（Biosharp， China） 的培养基中筛选 A549 细胞 2 周，并使用 western blot 技术鉴定基因是否敲除。

蛋白质印迹分析

用冰冷的 PBS（pH 7.4） 洗涤处理过的细胞或新鲜组织两次，并在含有100 mM HEPES、150 mM NaCl、1mM EGTA、1 mM EDTA、1% Triton、1% NP-40、3 mM 苯扎脒、10 mM NaF、1 mM Na 的RIPA 缓冲液中裂解3画外音4、10 μg/mL 抑肽酶和10μg/mL 亮肽素（pH 7.5）。将收集的细胞裂解物在冰上孵育并涡旋混合 3 次，每次 5 分钟。将细胞裂解物在 4 °C 下离心（12,000 × g） 30分钟。使用BCA 蛋白检测试剂盒（ThermoFisher， USA） 的 BCA 检测定量全细胞裂解物中的蛋白质浓度。将细胞裂解物在样品上样缓冲液（10% 甘油、5% β-巯基乙醇、2% SDS、50 mM Tris-HCl，pH 6.8、0.05% 溴酚蓝）中于 95 °C 煮沸 10 分钟。制备分离凝胶和浓缩胶。总共在 4-20% 十二烷基硫酸钠 （SDS） - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 上分离 20 至 60 μg 蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜（Millipore，Bedford，MA，USA）。然后在室温下用 5% 脱脂牛奶的 TBST 溶液封闭 1 h，然后在 4 °C 下与一抗孵育过夜。第二天，将膜与二抗（Cell Signaling Technology，USA）在 24 °C 下孵育 1 小时。免疫反应性信号是在添加 ECL 试剂 （Beyotime， Shanghai， China） 后产生的，并由 ChemiDoc 成像系统 （Bio-Rad， USA） 记录。蛋白质条带的灰度水平通过 Image Lab 软件 （Bio-Rad， USA） 获得。

RNA 分离和定量实时 PCR

通过 RNA-easy 分离试剂 （R701-01/02， Vazyme， China） 提取总 RNA。使用 NanoDrop 2000（Thermo，美国）定量后。根据制造商的方案，使用 Hiscript III 逆转录酶（R302-01，Vazyme，中国）进行 cDNA 合成。使用合成引物 （Tsingke Biological Technology， China） 和 SYBR green 预混液 （Q121-02， Vazyme， China） 进行 qPCR。根据 2-ΔΔCT方法。ACTB 用作 mRNA 的内参基因。总反应体积为 10 μL。扩增程序包括在 95 °C 下激活酶 30 秒，然后在 95 °C 下变性 15 秒，在 60 °C 下退火和延伸 30 秒，在 72 °C 下 30 秒。

使用以下引物：5'-AAAGCCTTCGCATCTCAGAATAA' （S） 和 5'-GGCAGACTTGGGGATGTAGTA' （AS） 用于SLC26A11;MCOLN1 的 5'-GCCTTCCGAC ACCTCTTCC' （S） 和 5'-CCACGGA CATACGCATACCG' （AS）;GLA 的 5'-TTGGATACTACGACATTGATGCC' （S） 和 5'-TTCTGCCAGTCCTATTCAGG G' （AS）;GPX4 的 5'-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC' （S） 和 5'-CCGAACT GGTTACACGGGAA' （AS）;ACTB 的 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC' （S） 和 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT' （AS）。

细胞毒性测定

细胞 （3 × 103/孔）接种在 96 孔板中。完全粘附到板上后，更换培养基，用 β-ELE （120 μg/mL） 处理细胞 24 小时。对于 CCK8 测定，加入20 μL CCK8 溶液（Solarbio，Beijing，China），孵育 4 小时后在 450 nm 处测量吸光度。对于 MTT 测定，向每个孔中加入 20 μL MTT 溶液（5 mg/mL，Sigma Aldrich）。在黑暗中孵育后取出液体。向每个孔中加入 150 μL DMSO，并摇动板 15 分钟以促进晶体溶解。通过酶标仪（Thermo Fisher Scientific，美国）测量 570 nm 处的吸光度。处理细胞相对于未处理细胞的 OD 值表示为细胞活力的百分比。

脂质 ROS 测定

将 NSCLC 细胞接种在 6 cm 培养皿中并孵育 12 小时以使细胞达到指数生长期，然后用 β-ELE （120 μg/mL） 处理或不处理 24 小时。向每个孔中加入含有 10 μM BODIPY 581/591 C11（D3861，Invitrogen）的新鲜培养基，用于脂质过氧化测量。在 37 °C、5% CO 下孵育 30 分钟后2，弃去培养基，用 PBS twise 洗涤细胞。将细胞重悬于 1 ml PBS 中，密度为 0.5 × 106细胞/mL。将细胞悬液转移至Falcon 5 ml 12 × 75 mm聚苯乙烯圆底管（BD Falcon货号352054）中。通过流式细胞术 （Exc = 488 nm，Em = 510） （BD Bioscience，美国） 测量每个样品 10,000 个细胞的荧光强度，并使用 Flowjo v10 软件分析结果。

溶酶体酸化测量

LysoTracker™ Red DND-99 （L7528， Thermo Fisher Scientific） 是一种红色荧光染料，用于标记和追踪活细胞中的酸性细胞器，使用它估计溶酶体内的 pH 值。用 β-ELE （120 μg/mL） 处理或未处理 NSCLC 细胞 24 小时后，向每个孔中加入含有 50 nM LysoTracker™ Red DND-99 的新鲜培养基进行溶酶体酸化测量。将细胞在 PBS 中洗涤，然后在 4 °C 下加入 4% 多聚甲醛 （PFA）（Sangon Biotech，中国）10 分钟，然后用 PBS 洗涤。用 DAPI 染色细胞核 5 分钟。用 TBS 洗涤细胞并在荧光显微镜下观察 （Olympus FLUOVIEW FV3000）。对于活细胞 Lyso-Tracker 流式细胞术分析，将细胞接种在 6 cm 培养皿中，并在细胞生长至约 70% 汇合后用或不用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 24 小时。24 小时后，用 50 nM Lyso-Tracker Red DND-99 处理细胞 30 分钟。用 PBS 洗涤两次后，加入用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA（HyClone，美国）进行的胰蛋白酶消化。用 PBS 洗涤后，在 561 nm 激发下通过流式细胞术 （BD Bioscience， USA） 分析细胞。

免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察

将 A549 细胞接种在盖玻片上。用或不用 β-ELE （120 μg/mL） 处理细胞 24 小时。用 PBS 洗涤盖玻片并在室温下在 4% PFA（Sangon Biotech，中国）中固定 15 分钟，然后封闭 （1 × PBS/5% BSA/0.3% Triton™ X-100）1 小时。随后，将细胞与抗 GPX4 （1：250） 和抗 LAMP1 （1：250） 抗体在 4 °C 下孵育过夜，然后与 Alexa Fluor 546 偶联的山羊抗小鼠二抗二抗或 Alexa Fluor 488 偶联的山羊抗兔与 DAPI 在室温下孵育 1 小时。用 PBS 洗涤 3 次后，使用抗褪色封固剂（S2100，SolarBio，中国北京）封片染色细胞，并使用共聚焦激光扫描显微镜（Olympus FLUOVIEW FV3000）捕获图像。使用 Olympus Fluoview FV31S-DT 软件观察共定位系数。

LIP 检测

进入活细胞后，钙黄绿素乙酰氧基甲酯 （CA-AM， YEASEN） 被酯酶水解 成钙黄绿素 （CA） 并发出荧光。其荧光在与细胞 LIP 结合时以随机计量方式淬灭。添加高亲和力螯合剂，例如去铁酮（DFP，MedChemExpress），它可以从其与 CA 的复合物中去除铁，从而增加细胞发出的荧光。细胞 （3 × 105/well） 生长在 6 cm 的培养皿中。收集 β-ELE （120 μg/mL） 处理和未处理的细胞，然后用 PBS 洗涤两次。用 0.5 μM CA-AM 在 37 °C 下孵育细胞 15 分钟。用 PBS 洗涤细胞并添加 100 μM 的铁螯合剂 DFP 或不处理。收集细胞并通过流式细胞术 （BD Bioscience， USA） 分析（激发 488 nm，发射 517 nm）。使用 FlowJo 软件（美国）分析细胞。平均荧光强度 （MFI） 随着游离铁含量的降低而增加。如前所述，铁螯合的大小计算为β-ELE （120 μg/ mL） 处理前后的ΔMFI （MFI CA-AM / DFP - MFI CA-AM）。

免疫沉淀 （IP）

使用 Lipo3000 转染试剂 （L3000015， Invitrogen） 用指定的质粒 （GPX4 或 TFEB） 转染 A549 细胞。用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 24 小时后，收获细胞并用含有蛋白酶抑制剂混合物 （Roche） 的 IP 裂解缓冲液（1% NP-40、150 mM NaCl、25 mM Tris pH 7.4、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS）裂解。将 500 μL 冷却 IP 缓冲液（1% NP-40、150 mM NaCl、25 mM Tris pH 7.4、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS 和蛋白酶抑制剂混合物）中的 1 mg 总蛋白与 20 μL 抗绿色荧光蛋白 （GFP） 纳米珠一起孵育，并在旋转器上于 4 °C 缓慢摇动过夜。离心 300 × g 5 分钟后，用裂解缓冲液洗涤沉淀 3 次，将珠子在 2 × 样品上样缓冲液中煮沸以进行蛋白质印迹。

GFP 纳米珠制备

编码带有 His 标签的抗 GFP 纳米抗体的 DNA 在大肠杆菌 BL21 细胞中表达。细胞在 37 °C 下振荡 （250 rpm） 生长，当 OD 值达到 0.6-0.8 时加入 0.5 mM 异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG），然后在 18 °C 下振荡。16 小时后，以 4000 × rpm 离心 20 分钟收获细胞。将细胞沉淀悬浮于含有 500 μL 苯甲基磺酰氟（PMSF，1 mM）的 50 ml 洗涤缓冲液（20 mM HEPES（CAS：7365–45-9，MW：238.31）、15 mM NaCl，PH 7.0）中，并使用高压匀浆器（JN-02C，JNBIO，中国）在 1,000 bar 下裂解 5 次。通过在 35000 × g 离心 30 分钟来去除细胞碎片。将上清液上样到用 30 mM 咪唑预平衡的 Ni-NTA （Qiagen） 色谱柱上。将混合物在 4 °C 下旋转 1 小时，洗涤珠子以用洗涤缓冲液去除未结合的蛋白质。在缓冲液（20 mM HEPES，150 mM NaCl，PH 7.0）中依次用低浓度 （30 mM） 和高浓度 （500 mM） 的咪唑洗脱抗 GFP 纳米抗体，并用 100 kDa 分子量截留浓缩器 （Milipore） 浓缩。

在 4 °C 下将 1 mg：100 μL 抗 GFP 纳米抗体溶液与 NHS 活化的琼脂糖浆液 （GE Healthcare） 的比例孵育，以将抗 GFP 纳米抗体偶联到树脂上过夜。然后用 10 倍柱体积的封闭缓冲液 （0.1 M Tris-HCl pH 8.0） 洗涤树脂以去除未结合的纳米抗体，然后在 25 °C 下孵育 2 小时以淬灭未反应的 NHS 位点。封闭完成后，用洗涤缓冲液（bufer 1：0.1 M Tris-HCl pH 8.0、0.5 M NaCl 和 bufer 2：0.1 M 乙酸钠、0.5 M NaCl，pH 4.0）洗涤树脂六次。通过 IP 测定测量 GFP 纳米珠和与靶蛋白的相互作用。将抗 GFP 树脂储存在储存缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0,150 mM NaCl）中并储存在 4 °C 下。

动物实验

A549 和 A549TFEB KO 细胞逆向病毒感染编码 GFP 和萤火虫荧光素酶的融合蛋白报告基因构建体。然后用嘌呤霉素筛选稳定表达荧光素酶报告基因的细胞。4-5 周龄雄性 NOD/SCID 小鼠 （18-20 g） 购自上海 SLAC 实验动物有限公司 （中国上海）。用 1.25% 三溴乙醇 （125 mg/kg） 麻醉小鼠并置于左侧卧位。

用手术剪刀小心地在右胸部区域做一个小切口 （3-5 mm），然后去除软组织以露出胸骨肋间隙和肋间隙。注射部位由标记物确定（在第五和第六肋之间，右腋前线）。A549-luci 或 A549TFEB KO-luci 细胞 （1 × 106） 注射到右肺。肿瘤注射后，观察小鼠 45 至 60 分钟，直至完全恢复。5 d后，将 miece 分为 4 组 （一组 6 组），每天通过尾静脉注射给予赋形剂或 β-ELE （120 mg/kg） 治疗。每周观察每只小鼠的肿瘤大小。简而言之，在异氟醚麻醉前，小鼠腹膜内注射每 10 g 50 μL 荧光素溶液 （30 mg/mL 原液），并通过 Biospace Lab Photon Imager Optima（法国 Nesles-la-Valee）检测荧光辐射。Biospace Lab Photon Imager Optima 配备了一台高灵敏度的制冷型 CCD 相机。使用异氟醚腔对小鼠进行麻醉，然后将其放置在成像仪内（原位模型的腹侧朝上），其鼻子位于异氟醚鼻锥中以保持麻醉。图像采集后，常规进行 1 分钟，将小鼠放回笼子中。信号采集的时间曲线可确保在荧光素处于饱和状态时采集信号。使用 Biospace 提供的 M3 Vision™ 软件对数据进行分析。给药后第 21 天，处死小鼠，将肿瘤组织样品分别在 -80 °C 下冷冻或固定在 4% PFA 中用于 IF 或 IHC。

免疫组化

用 4% PFA 的 PBS 溶液固定肿瘤样品，在 OCT 化合物中快速冷冻，并以 6 μm 的厚度连续切片。使用增殖细胞核抗原 （PCNA） 抗体进行 IHC 以可视化细胞。使用荧光显微镜 （DS-Ri1， Nikon， Japan） 收集 6 张视野图像。使用 Image Pro Plus 软件分析 PCNA 的 IOD 指数。

道德声明

所有动物实验均按照国家研究委员会实验室护理和使用指南进行，并经杭州师范大学实验动物伦理委员会批准。（批准号：2021–1123）。

统计分析

使用 GraphPad Prism 8.0.1 进行统计分析。数据重复至少 3 个独立实验，并以平均值 （SEM） 的 ± 标准误差表示。两组和多组之间的显著差异可以分别通过双尾 t 检验和单因素方差分析来确定。通过统计学评估统计学意义，P < 0.05。*，P 值为 < 0.05;**， P < 0.01;，P < 0.001。

β-ELE 与 TFEB 结合并诱导 TFEB 激活

我们之前的研究发现，阻断溶酶体活性可以逆转 β-ELE 诱导的抗癌作用。因此，我们认为它可能对溶酶体生物发生过程中的关键调节因子产生影响。TFEB 是溶酶体生物发生的主要调节因子，因此，我们首先应用 SPR 测定来观察 β-ELE 是否与 TFEB 具有结合亲和力。SPR 传感图显示，结合反应曲线呈剂量依赖性，KD 值为 8.296E-5 M，而载体没有结合反应，这表明 β-ELE 与 TFEB 具有结合亲和力（图 1A、B&D）。到目前为止，在已报道的研究中，尚未应用蛋白质-配体结合实验来研究 β-ELE 的结合蛋白，因此，这是首次发现潜在的靶向蛋白 TFEB 可以与 β-ELE 结合。为了更深入地了解 β-ELE 和 TFEB 之间的结合相互作用，Autodock Vina 进行了分子对接模拟。β-ELE 与 Thr308、Asn309、Leu312 和 Trp313 的 TFEB 残基相互作用，平均结合能为 -5.0 kcal/mol，这表明 β-ELE 和 TFEB 之间具有直接结合的潜力（图 1C）。这些残基位于 TFEB 的 ZIP 区，负责 TFEB 激活和核易位，因此，我们在 β-ELE 处理的 NSCLC 细胞中观察到 TFEB 的激活。

图 1.β-ELE 与 TFEB 结合并诱导 TFEB 激活。（A） 不同浓度的 β-ELE （50 μM、25 μM、12.5 μM、6.25 μM、3.125 μM） 流过固定有 TFEB 蛋白的 CM5 芯片表面。交互曲线实时记录在传感图中。（B） （A） 中的结合曲线。（C） 通过 Autodock Vina 程序对 β-ELE 到 TFEB 的 HLH-ZIP 区域的分子对接模拟。它显示了 β-ELE （以橙色和棒状模型显示）与 TFEB 活性位点残基 （灰色） 的相互作用。 位于 308、309、312、313 位的氨基酸与 β-ELE 形成 H 键（氢键表示为灰色虚线，它们的距离以埃标记）。（D） 具有 TFEB 的 HLH-ZIP 区域的车辆的感觉图。（E） β-ELE 在 A549、NCI-H460 和 SPC-A-1 细胞上处理 6 、 12 、 24 和 48 h ，Western blot 分析 TFEB 、 p-TFEB （Ser122） 、 p-TFEB （Ser211） 和 14-3-3 的蛋白表达。（F） β-ELE 在 A549、NCI-H460 和 SPC-A-1 细胞上处理 12 、 24 和 48 小时，Western blot 检测细胞核和胞质溶胶中 TFEB 的蛋白表达。α-微管蛋白作为细胞质标志蛋白，Lamin B1 作为核标志蛋白。（G） β-ELE 在 A549、NCI-H460 和 SPC-A-1 细胞上处理 24 h，通过免疫荧光观察 TFEB （红色荧光） 在细胞核 （蓝色荧光） 中的定位。棒 = 10 μm。数据以来自三个独立实验的 SEM ±平均值表示。

TFEB 在 S122、S211 位点的去磷酸化导致 TFEB 的激活和核转位。为了观察 β-ELE 对 TFEB 活化的影响，我们首先检测了 TFEB 的磷酸化水平。β-ELE （120 μg/mL） 显著降低 TFEB 在 S122、S211 及其结合蛋白 14-3-3 位点的磷酸化水平 （图 1E&S1A），这表明 β-ELE 可能促进 TFEB 的去磷酸化，从而增加其核转位和活化。为了观察内源性 TFEB 响应 β-ELE 处理的核转位， 对 A549 、 SPC-A-1 和 NCI-H460 细胞进行了亚细胞分级分离和蛋白质印迹。β-ELE （120 μg/mL） 处理 12 h、24 h 和 48 h 后，这三种细胞系细胞核中 TFEB 的蛋白表达均显著增加（图 1F&S1B）。这些结果表明，β-ELE 诱导 TFEB 核易位，免疫荧光法对 A549 、 SPC-A-1 和 NCI-H460 细胞的免疫荧光测定进一步证实了这一点。在胞质溶胶和细胞核中均观察到 TFEB 的荧光强度。在对照组中，荧光主要位于胞质溶胶中，在细胞核中观察到微弱的信号，如 DAPI 信号的共定位所示。应用 β-ELE （120 μg/mL） 24 小时可显著提高细胞核中 TFEB 荧光强度（图 1G）。为了发现 TFEB 核易位的增加是否由于 TFEB 总量的增加而增加，我们检测了 TFEB 的 mRNA 和蛋白水平。β-ELE 对 TFEB 的 mRNA 和蛋白水平没有明显影响 （图 S1C&1E），这表明 TFEB 核易位的增加不是由于 TFEB 的增加。所有这些数据表明，β-ELE 可以激活 A549、SPC-A-1 和 NCI-H460 NSCLC 细胞上的 TFEB。

β-ELE 调节溶酶体生物发生

TFEB 可以促进溶酶体生物发生，β-ELE 诱导的 TFEB 激活是否可以因此激活溶酶体尚未报道。为了检查 β-ELE 对溶酶体的影响，我们观察了 NSCLC 细胞溶酶体功能的变化。首先，LysoTracker 染色显示 A549、SPC-A-1 和 NCI-H460 细胞中 β-ELE 的平均荧光强度急剧增加，表明溶酶体酸化增强（图 2A、D&G）。流式细胞术证实了这些现象，在所有这三种 NSCLC 细胞中都观察到荧光向更高强度的转变和平均荧光强度 （MFI） 的显着增加（图 2B、E&H）。其次，我们观察了参与溶酶体生物发生的基因表达，包括溶酶体水解酶和辅助蛋白 GLA、溶酶体膜蛋白 MCOLN1 SLC26A11。β-ELE 的应用显著增加了这些基因的 mRNA 表达（图 2C、F&I）。由于它们都受 TFEB 的转录调控，因此 mRNA 水平的上调可能是由于 TFEB 的激活，从而激活溶酶体。

图 2.β-ELE 促进溶酶体生物发生。（A、D、G） β-ELE 在 A549 （A）、NCI-H460 （D） 和 SPC-A-1 （G） 细胞上处理 24 小时。 用 LysoTracker Red （50 nM） 染色 30 分钟后，通过共聚焦显微镜检测荧光信号。（B、E、H） β-ELE 在 A549 （B）、NCI-H460 （E） 和 SPC-A-1 （H） 细胞上处理 24 小时。然后用 LysoTracker Red （50 nM） 加载细胞 30 分钟。通过流式细胞术测量每个样品 10,000 个细胞的荧光强度。（C、F、I） β-ELE 在 A549 （C）、NCI-H460 （F） 和 SPC-A-1 （I） 细胞上处理 24 h，通过实时 PCR 测定编码 MCOLN1、SLC26A11 和 GLA 的 mRNA 量。用 ACTB 对 mRNA 进行归一化。n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

β-ELE 促进 NSCLC 中 GPX4 溶酶体降解

考虑到 β-ELE 可以促进 TFEB 介导的溶酶体激活，并且铁死亡的负调节因子可以通过溶酶体降解而降解，因此，我们假设 β-ELE 可以降解铁死亡的负调节因子。由于 β-ELE 诱导的 TFEB 和溶酶体的激活在 A549 上最为明显，因此我们选择该细胞系进行机制研究。在这里，我们发现 β-ELE 显着降低铁死亡 GPX4 的关键负调节因子。为了研究 GPX4 的下降是由于转录或转录后调控的变化，我们首先检测了 GPX4 mRNA 水平的变化，在 β-ELE 处理的 A549 细胞中没有发现明显变化（图 3A）。因此，GPX4 的下降不是由于转录引起的。然后，我们在 β-ELE 处理的 A549 细胞中应用蛋白酶体抑制剂 MG132 或溶酶体降解抑制剂 BafA1 和 CQ。MG132 不能显著逆转 GPX4 的下降，而 BafA1 和 CQ 均强烈减弱 β-ELE 诱导的 GPX4 下降（图 3B&S2A），这表明 β-ELE 可能诱导 GPX4 的溶酶体降解。由于需要泛素化过程将蛋白质转移到溶酶体进行降解，因此我们观察到 GPX4 的泛素化。免疫沉淀测定表明，在 β-ELE 处理的 A549 细胞中，多泛素化链以时间依赖性方式增加（图 3C&S2B）。接下来，我们纯化溶酶体组分以观察 GPX4 在溶酶体中的分布。β-ELE 显著增加了溶酶体中 GPX4 的量，而溶酶体游离部分的 GPX4 含量降低（图 3E&S2C），免疫染色法进一步证实，β-ELE 处理后 GPX4 和 LAMP1 的共定位增加了约 2 倍（图 3D&F）.所有这些数据都表明 β-ELE 促进了 GPX4 溶酶体的降解。β-ELE 的力学研究很少关注溶酶体降解，因此，这一结果为 β-ELE 诱导的抗癌作用机制提供了新的视角，并为我们找出其结合蛋白 TFEB 与 GPX4 溶酶体降解的关系铺平了道路。

图 3.β-ELE 促进 NSCLC 细胞中 GPX4 的降解。（A） 在不同时间点（24、48 小时）用 β-ELE （120 μg/mL） 处理的 A549 细胞中通过 qPCR 定量 GPX4 mRNA 水平。用 ACTB 对 mRNA 进行归一化，“ns”表示没有统计学差异。（B） 在预处理或不预处理蛋白酶体抑制剂 MG132 （1 μM） 或溶酶体降解抑制剂 BafA1 （160 nM）、CQ （20 μM） 后，用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 A549 细胞 1 h。western blot 检测 SLC7A11 和 GPX4 蛋白水平的变化。（C） 用 GPX4-GFP（10 μg/10 cm 培养皿）转染 A549 细胞，然后用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 6、12 和 24 h。收获细胞并用 RIPA 缓冲液裂解，然后通过 GFP-nanobeads 对细胞裂解物进行免疫沉淀 （IP），并按照指示使用抗体（GPX4、泛素）进行蛋白质印迹分析。（D） β-ELE （120 μg/mL） 在 A549 细胞上处理 24 h，免疫荧光检测 LAMP1 和 GPX4 的共定位。代表 GPX4 的绿色荧光信号分布在细胞质和细胞核中，代表 LAMP1 的红色荧光信号主要分布在细胞质中。棒 = 10 μm。（E） 用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 A549 细胞 24 h。 收集溶酶体和无溶酶体的细胞裂解物，Western blot 检测 GPX4 蛋白水平。LAMP1 和 GAPDH 分别用作溶酶体和非溶酶体组分的加载对照。（F） （D） 中的共定位系数由奥林巴斯 Fluoview FV31S-DT 软件计算。每个点代表 SEM ±平均值，n = 4，*P < 0.05。

TFEB 促进 β-ELE 处理的 NSCLC 中 GPX4 溶酶体降解

β-ELE 促进 GPX4 的溶酶体降解，考虑到 β-ELE 诱导的溶酶体活化与 TFEB 呈正相关，因此，TFEB 可能是 β-ELE 处理的 NSCLC 细胞中 GPX4 减少的上游调节因子。TFEB 对 GPX4 降解的作用尚未说明，这可能是抗癌药物（如 β-ELE）触发的抗癌过程中的新型生物事件。为了观察 TFEB 在 β-ELE 诱导的溶酶体降解中的作用，我们建立了 TFEB 敲除 A549 细胞系 A549TFEB KO (图 S3A).为了进一步确认这一点，我们在 A549 或 A549 上应用了 β-ELETFEB KO细胞。结果表明，β-ELE 诱导的 GPX4 水平降低在 A549 中明显逆转TFEB KO细胞，TFEB 的过表达恢复了 GPX4 的减少 （图 4A&S3B）。TFEB 的去磷酸化会增加其活性，反之亦然。接下来，我们生成了在 TFEB 的 S122 和 S211 位点具有丝氨酸-丙氨酸突变的质粒 （TFEBS122A、S211A 系列）模拟 TFEB 的去磷酸化，以及 S122、S211 突变或 S122 和 S211 双突变的质粒 （TFEBS122D 系列、 TFEBS211D 系列和 TFEBS122D、S211D 系列） 模拟 TFEB 的磷酸化。β-ELE 诱导的 GPX4 降低在 TFEB 中显著促进S122A、S211A 系列转染的 A549 细胞（图 4B&S3C）。相反，当 A549 细胞转染 TFEB 时，GPX4 的减少明显逆转S122D、S211D 系列 (图 4B&S3C）。这些结果进一步表明，TFEB 促进了 β-ELE 处理的 NSCLC 细胞中 GPX4 的下降。为了研究 β-ELE 诱导的 GPX4 泛素化是否与 TFEB 有关，我们在 A549 细胞上共转染 TFEB 和 GPX4，并通过免疫沉淀观察与 GPX4 结合的泛素链的变化。同时，我们还在 A549 上转染了 GPX4TFEB KO细胞。结果显示，β-ELE 处理后，与 GPX4 单转染相比，与 GPX4 结合的泛素链显著增加（图 4C&S3D），而 A549 中与 GPX4 结合的泛素链减少TFEB KO细胞与 A549 细胞中的细胞比较（图 4D&S3E）。我们进一步比较了溶酶体中 GPX4 的含量与应用于 A549 或 A549 的 β-ELETFEB KO细胞。我们的结果表明，敲除 TFEB 会降低溶酶体 GPX4 （图 4F&S3F）。通过免疫荧光实验发现，β-ELE 处理后 A549 细胞中 GPX4 的绿色荧光减弱，而 LAMP1 的红色荧光增加，表明 β-ELE 处理降低了 GPX4 的表达并激活了溶酶体。同时，GPX4 和 LAMP1 的共定位增加，表明 β-ELE 促进了 GPX4 的溶酶体分布（图 4E）。为了进一步证明 TFEB 对溶酶体中 GPX4 分布的影响，我们对 A549 施用 β-ELETFEB KO细胞，发现 GPX4 的荧光强度与施用 β-ELE 的 A549 细胞相比增强，LAMP1 的红色荧光减弱，表明 β-ELE 诱导的 GPX4 降解和溶酶体活化在 TFEB 敲除后受到抑制。同时，在 A549 中，β-ELE 诱导的 LAMP1 和 GPX4 共定位的增加减弱TFEB KO细胞（图 4E&G）。这些现象表明，TFEB 敲除可能通过减少 GPX4 的溶酶体分布来减少 GPX4 的溶酶体降解，从而抑制 β-ELE 处理的 A549 细胞中 GPX4 的减少。

图 4.TFEB 促进 β-ELE 处理的 NSCLC 中的 GPX4 降解。（A） A549 和 A549TFEB KO细胞用或不用 TFEB （10 μg/10 cm 培养皿） 质粒转染 24 h，然后用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 24 h。western blot 检测 TFEB 和 GPX4 蛋白水平。（B） 转染或不使用 TFEB 的 A549 细胞S122A、S211A 系列（10 μg/10 cm 培养皿），TFEBS122D、S211D 系列（10 μg/10 cm 培养皿），然后用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 24 小时。S122A 和 S211A 是 TFEB 的去磷酸化模拟突变，而 S122D 和 S211D 是 TFEB 的磷酸化模拟突变。western blot 检测 TFEB 和 GPX4 蛋白水平。（C、D）A549 细胞与 GPX4-GFP （10 μg/10 cm 培养皿） 和 TFEB （10 μg/10 cm 培养皿） （C） 共转染 A549 细胞TFEB KO用 GPX4-GFP （10 μg/10 cm 培养皿） 转染细胞 （D），然后用 β-ELE 处理 24 h。用 RIPA 缓冲液裂解细胞，然后通过 GFP 纳米珠对细胞裂解物进行 IP，并按指示使用抗体 （TFEB、GPX4） 通过蛋白质印迹进行分析。（E） A549 和 A549TFEB KO用 β-ELE （120 μg/mL） 处理细胞 24 h，免疫荧光检测 GPX4 和 LAMP1 的共定位。棒 = 10 μm。（F） A549 细胞和 A549TFEB KO 用或不用 β-ELE （120 μg/mL） 处理细胞 24 h。收集溶酶体和无溶酶体的细胞裂解物，并通过 western blot 测量 GPX4 的蛋白水平。LAMP1 和 GAPDH 分别用作溶酶体和非溶酶体组分的加载对照。（G） （E） 中的共定位系数由奥林巴斯 Fluoview FV31S-DT 软件计算。每个点代表 SEM ±平均值。n = 3，***P < 0.001。

β-ELE 诱导 NSCLC 铁死亡

GPX4 的减少可诱导铁死亡。由于直接或间接的铁死亡诱导需要下调 GPX4，因此它是参与铁死亡的关键负调节因子。铁死亡的两个关键特征是脂质 ROS 和细胞内铁的增加。评价 β-ELE 对 NSCLC 细胞铁死亡诱导的影响。我们首先观察了 β-ELE 处理的 NSCLC 细胞中的脂质 ROS 和易感铁池。β-ELE 显著增加了脂质 ROS （图 5A&B），以及 A549 中的易感铁池 （图 5C&D）。在 NCI-H460 （图 S5A、B、C&D） 和 SPC-A-1 细胞 （图 S6A、B、C&D） 中也发现了类似的现象，但易感铁池的增加不如 A549 明显，这与 TFEB 和溶酶体活化的变化一致。接下来，我们观察了铁死亡所涉及的关键因素。β-ELE 的时间依赖性降低 GPX4 的表达，在 12 h、24 h、48 h 观察到显著降低，而铁蛋白和 FTH 的明显下降仅在 48 h 观察到，在 A549 中未发现 SLC7A11 的显著变化（图 5E&S4）。在 NCI-H460（图 S5E&G）和 SPC-A-1 细胞（图 S6 E&G）中也发现了这种现象，但是，GPX4 的降低也不如 A549 明显。GPX4 在所有这三种细胞系中的强劲下降表明 GPX4 下降可能导致 β-ELE 介导的铁死亡。为了进一步证实 β-ELE 诱导的铁死亡诱导，我们应用了两种铁死亡抑制剂 ferrostatin-1 和 liproxstatin-1 来研究 β-ELE 诱导的细胞毒性对 NSCLC 细胞的影响。在这三种细胞系中，铁死亡抑制剂都急剧减弱了 β-ELE 诱导的细胞活力降低，这种现象在 A549 细胞系中最为明显（图 5F、S5F 和 S6F）。β-ELE 可通过 EGFR 突变型 NSCLC 的铁死亡诱导促进靶向治疗药物 [35]，然而，其在 EGFR 宽型 NSCLC 铁死亡中的单一作用尚未阐明。这些数据表明，β-ELE 可以诱导 NSCLC 细胞的铁死亡，这种现象在 A549 中最为明显，以及 TFEB 和溶酶体的激活。

图 5.β-ELE 诱导 A549 细胞中的铁死亡。（A） A549 细胞用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 24 小时，并用 BODIPY™ 581/591 C11 （10 μM） 染色 30 分钟。氧化后，其最大激发波长从 581 nm 变为 500 nm，最大发射波长从 591 nm 变为 510 nm。流式细胞术检测脂质过氧化水平。（B） 通过 FlowJo 计算 （A） 的脂质过氧化水平。（C） 用 β-ELE 处理 A549 细胞 24 小时，向细胞中加入a终浓度为 0.5 μM 的 CA-AM，然后加入铁螯合剂去铁酮 （DFP， 100 μM） 1 小时或不处理。检测荧光酶标仪 （Exc = 488 nm，Em = 525 nm） 检测平均荧光。（D） LIP 的量通过每个样品的平均荧光差异来反映 （C） 中含有或不含有去铁酮。（E） β-ELE 处理 A549 细胞 6 、 12 、 24 和 48 h，Western blot 检测 SLC7A11 、 GPX4 、 Ferritin 和 FTH 的蛋白水平。使用 GAPDH 作为上样对照。（F） 在存在或不存在铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1 （2 μM） 或 Liproxstatin-1 （50 nM） 的情况下，1 小时后用 β-ELE 处理 A549 细胞。MTT 法检测细胞活力。每个点代表 SEM ±平均值。n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

TFEB 促进 β-ELE 诱导的 NSCLC 铁死亡

β-ELE 均可诱导 GPX4 还原和铁死亡诱导，且 GPX4 溶酶体还原与 TFEB 呈正相关，因此，TFEB 可能是 β-ELE 诱导的铁死亡的上游调节因子。在这里，我们发现 β-ELE 诱导的细胞毒性和脂质 ROS 增强被 TFEB 敲除明显逆转（图 6A&B）。在转染 TFEB 的 β-ELE 处理的细胞中也发现了对细胞毒性的反向影响S122D 系列、 TFEBS211D 系列和 TFEBS122D、S211D 系列 (图 S7这些结果表明，TFEB 与 β-ELE 诱导的铁死亡呈正相关。为了进一步证实这种现象，我们在 β-ELE 处理的 A549 细胞中过表达 TFEB。β-ELE 诱导的细胞毒性和脂质 ROS 明显受到 TFEB 过表达的促进 （图 6C&D），以及 SLC7A11 和 GPX4 表达的下降 （图 6E&S7B），这表明 TFEB 过表达增强了 β-ELE 诱导的铁死亡。

图 6.TFEB 促进 β-ELE 诱导的 NSCLC 铁死亡。（A） 将 β-ELE （120 μg/mL） 应用于 A549 和 A549TFEB KO细胞 24 h，MTT 法检测细胞增殖抑制情况。（B） A549 和 A549TFEB KO用 Sh-GPX4（在含有 mCherry、基因 ID = 2879、HSH118768-LVRU6MP、GeneCopoeia 的 psi-LVRU6MP 载体中构建）转染细胞 8 小时，然后去除培养基并用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 24 小时。用 BODIPY™ 581/591 C11 （10 μM） 对细胞染色 30 分钟。用 3 次 PBS 洗涤细胞后，将细胞以 0.5 × 10 的密度重悬于 PBS 中6 cells/mL，流式细胞术检测脂质过氧化水平。（C） 用载体 （pcDNA3.1） 或 TFEB 转染 A549 细胞，然后用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 24 h，MTT 法检测对增殖的抑制作用。（D） 用 TFEB 或 GPX4 转染 A549 细胞，或用 GPX4 和 TFEB 共转染，然后用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 24 h，检测脂质过氧化的过程与 （B） 相同。（E） 用载体 （pcDNA3.1） 或 TFEB 转染 A549 细胞，然后用 β-ELE （120 μg/mL） 处理 24 h，Western blot 检测 TFEB 、 SLC7A11 和 GPX4 蛋白水平。使用 GAPDH 作为上样对照。（F） 转染和药物治疗与 （E） 相同。用 LysoTracker Red （50 nM） 染色 30 分钟后，通过流式细胞术检测荧光信号。每个点代表 SEM ±平均值。n = 3，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

GPX4 的减少可触发铁死亡。为了观察 β-ELE 诱导的铁死亡是否可以由 GPX4 直接触发，我们对 A549 中 GPX4 的水平进行了基因改变，然后应用 β-ELE。敲低 GPX4 显著增加 A549 中的脂质 ROS，而 A549 中的脂质 ROS 进一步增加TFEB KO细胞（图 6B），这可能是由于 A549 中 GPX4 的水平相对较高TFEB KO细胞和 GPX4 的还原要稳健得多。同时，由于 GPX4 敲低 A549 细胞中 GPX4 基础水平较低，因此与宽型 A549 细胞相比，β-ELE 诱导的 GPX4 降低要小得多，这可能是导致 GPX4 敲低 A549 细胞中 β-ELE 诱导的脂质 ROS 略有增加的原因（图 6B）。β-ELE 诱导的脂质 ROS 增加在 GPX4 敲低 A549 中被消除TFEB KO细胞，但在 GPX4 敲低的 A549 细胞中没有（图 6B），这表明 β-ELE 诱导的脂质 ROS 增加依赖于 TFEB，但不直接靶向 GPX4。

接下来，我们观察了 GPX4 在 β-ELE 处理的 NSCLC 细胞中 TFEB 介导的铁死亡中的作用，TFEB 过表达促进了 β-ELE 诱导的脂质 ROS 形成，而 GPX4 的过表达减轻了这种形成（图 6D）。有趣的是，GPX4 本身的过表达也会损害 β-ELE 诱导的脂质 ROS 形成，这比 GPX4 和 TFEB 共过表达的 β-ELE 处理的 NSCLC 细胞更明显（图 6D）。这可能是由于高水平的 TFEB 导致 GPX4 的下降，β-ELE 诱导的 GPX4 在 GPX4 的 NSCLC 细胞中下降，并且 TFEB 共过表达不如在 GPX4 单次过表达的细胞中那么明显。所有这些数据表明，在 β-ELE 处理的 A549 细胞中，TFEB 介导的铁死亡需要 GPX4 下降。

同时，TFEB 促进 β-ELE 诱导的溶酶体活性增加，其特征是 LysoTracker 染色细胞的平均荧光增加（图 6F）。溶酶体活性的阻断损害了 β-ELE 的抗癌作用（图 S7C）。所有这些都表明 TFEB 促进 β-ELE 诱导的 NSCLC 铁死亡，这也与溶酶体活性呈正相关。

敲除 TFEB 减弱 β-ELE 在原位 NSCLC NOD/SCID 小鼠模型中的抗癌作用

为了证实 TFEB 对 β-ELE 诱导的抗癌作用的作用，我们在用 A549-luci 或 A549 建立的原位 NOD/SCID 小鼠模型中评估了 β-ELE 的抗癌作用TFEB KO-Luci 细胞。给药后每周通过生物发光监测肿瘤生长。第 1 天时，生物发光在组间没有显着变化。随后在 A549-luci 和 A549 中检测到生物发光的增加TFEB KO-Luci 对照组，表明肿瘤生长迅速。β-ELE 从 7 天开始显着抑制肿瘤生长，其特征是生物发光急剧降低。抑制作用在第 21 天最明显，与 A549-luci 组相比，生物发光降低了 50% 以上。然而，在 A549TFEB KO-luci 小鼠，β-ELE 的抗癌作用不如 A549-luci 小鼠强，这表明 TFEB 敲除损害了 β-ELE 在体内诱导的抗癌作用（图 7A&B）。

图 7.敲除 TFEB 减弱了原位 NSCLC NOD/SCID 小鼠模型中 β-ELE 的抗癌作用。该研究使用了 4-5 周龄的雄性 NOD/SCID 小鼠。A549-luci 或 A549TFEB KO-luci 细胞 （1 × 106 在 100 μL 0.9% 生理盐水中）注射到每只小鼠的右肺中。5 d后，将小鼠分为4组（前组6只），通过尾静脉注射给予β-ELE（120 mg/kg）。给药后第 21 天，处死小鼠，将肿瘤组织样品分别在 -80 °C 下冷冻或固定在 4% PFA 中用于 IF 或 IHC。实验按照材料和方法中的描述进行。（A） β-ELE 给药后指定时间点（第 1 天、第 21 天）生物发光的代表性图像。（B） 小鼠的生物发光强度。信号以辐射度 （Ph/s） 表示。n = 6。（C） 免疫荧光检测 GPX4 和 LAMP1 在肿瘤中的共定位。棒 = 10 μm。（D） （C） 的共定位系数由奥林巴斯 Fluoview FV31S-DT 软件计算。n = 4。（E） 免疫组织化学染色分析。切片中的 PCNA 阳性细胞被染成棕色。细胞核被染成蓝色。显示了每组的代表性数字。（F） 随机选择每个肿瘤组织切片，通过 Image Pro Plus 软件计算阳性区域的平均 IOD 值，指示 PCNA 的表达量。棒 = 50 μm。每个点代表 SEM ±平均值。n = 6。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

为观察体内 TFEB 敲除后 GPX4 分布的变化，采用免疫组化荧光观察 LAMP1 和 GPX4 在小鼠肺组织肿瘤中的共定位。结合体外数据，TFEB 敲除减弱了 β-ELE 诱导的 LAMP1 和 GPX4 共定位的增加，这表明 TFEB 有助于 β-ELE 诱导的 GPX4 溶酶体分布和 GPX4 下降（图 7C&D）。为进一步证实 TFEB 在 β-ELE 诱导的抗癌作用中的作用，免疫组化检测肿瘤中 PCNA 的表达水平。PCNA 是一种 DNA 合成所必需的核非组蛋白，因此在 G1-S 相变过程中会注意到较高的表达水平。PCNA 在 A549-luci 和 A549 中的表达水平较高TFEB KO-luci 对照组 [图 7E&F]，而 β-ELE 处理组 PCNA 的表达较低。在 β-ELE 处理下，A549-luci 小鼠中 PCNA 的表达与 A549 相比降低了约 49%TFEB KO-luci 小鼠，这表明 β-ELE 诱导的对 PCNA 的抑制可能会受到 TFEB 敲除的影响（图 7E&F）。所有这些数据都表明，TFEB 促进了 β-ELE 诱导的 GPX4 溶酶体定位和抗癌作用。

多项研究表明 β-ELE 具有抗肺癌作用。然而，其抗肺癌作用的潜在靶点仍不清楚，基于蛋白-配体结合实验的 β-ELE 靶蛋白研究甚少。新出现的证据表明，TFEB 是癌症治疗的潜在靶点。然而，据报道 TFEB 对癌症生物学的双重功能使其如何影响肺癌的癌症发展仍不清楚。TFEB 是自噬、溶酶体生物发生、TAM 等的主要调节因子，它在铁死亡中的作用，一种很有前途的癌症治疗策略，仍处于起步阶段。由于天然抗癌剂的机制通常是多种多样且尚不完全清楚的，因此使用具有 TFEB 激活和铁死亡诱导功能的天然抗癌剂可能有助于我们了解 TFEB 介导的铁死亡调节过程中的新生物学事件。在这里，我们发现 β-ELE 与 TFEB 具有结合亲和力，分子对接显示结合位点可能位于 ZIP 区域，这对 TFEB 激活至关重要。β-ELE 均可触发 EGFR 野生型 NSCLC 中的 TFEB 激活和铁死亡。TFEB 在 β-ELE 处理的铁死亡中的作用在体外和体内通过几个方面进行了说明：（i） TFEB 与 β-ELE 诱导的铁死亡呈正相关;（ii） TFEB 与铁死亡负调节因子 GPX4 的蛋白表达呈负相关;（iii） TFEB 敲除损害了 GPX4 溶酶体易位和降解。（iv） β-ELE 的抗肺癌作用因体内 TFEB 敲除而受到影响。

靶向 TFEB 是一种很有前途的癌症治疗方法。过去，大多数研究揭示了 TFEB 与癌症发展的正相关关系，然而，随着 TFEB 在各种癌症生物事件中功能的新发现，最近的研究中报道了 TFEB 在癌症发展中的消极作用.TFEB 的激活可以通过 TAM、TEM、EMT 和溶酶体降解抑制癌细胞转移和增殖。在 NSCLC 中，肿瘤组织中低水平的 TFEB 与患者的不良预后相关。因此，TFEB 的药理学激活显示出对癌症治疗的益处。在这项研究中，我们发现 β-ELE 可以结合并激活 TFEB，并且 TFEB 敲除损害了 β-ELE 在体外和体内的抗癌作用，这表明它对 NSCLC 肿瘤进展的负面影响。

TFEB 对 NSCLC 的调节主要取决于溶酶体活性。几项研究表明，抗癌剂通过 TFEB 介导的溶酶体激活诱导铁死亡铁死亡是一种程序性细胞死亡，其特征是铁和脂质氧化升高。铁死亡逃避可导致肿瘤进展和治疗耐药性。癌细胞具有高负荷的 ROS 和铁成瘾，这使它们容易发生铁死亡。由于细胞凋亡耐药是癌症治疗的关键不足，靶向溶酶体和铁死亡是提高抗癌效果的有前途的方法。几项研究报道，β-ELE 在非常高的浓度下可以诱导细胞凋亡，然而，在我们之前的研究中，细胞凋亡标志物在 120 μg/ml 的浓度下没有明显变化，自噬的关键蛋白也是如此（图 S8A）。而铁死亡诱导非常明显。考虑到 β-ELE 诱导的铁死亡伴随着 TFEB 和溶酶体激活，TFEB 介导的溶酶体激活可能是铁死亡诱导的关键过程。TFEB 介导的铁死亡机制尚不完全清楚。一项研究表明，TFEB 促进铁蛋白的溶酶体降解，铁蛋白是铁死亡的负调节因子，最终触发铁死亡。然而，TFEB 对铁死亡负关键调节因子 GPX4 的调节尚未阐明。在我们的研究中，β-ELE 诱导的铁死亡过程中变化最大的铁死亡调节因子是 GPX4。因此，TFEB 可能会促进 GPX4 降解以触发铁死亡。

GPX4 是铁死亡的关键负调节因子，因为铁死亡的诱导会直接或间接抑制 GPX4。最近的研究表明，GPX4 水平和活性的增强与肿瘤发生呈正相关。GPX4 抑制是触发铁死亡的有效方法。据报道，GPX4 可被伴侣介导的自噬 （CMA） 降解，最终在溶酶体中降解 GPX4。然而，TFEB 在 CMA 介导的自噬中的作用尚未完全阐明。考虑到 TFEB 是溶酶体生物发生的主调控，我们假设 TFEB 激活可以直接促进 GPX4 溶酶体降解。溶酶体降解需要靶蛋白的泛素化，尽管据报道 K63 和 K48 多泛素化都参与了这一过程，但大多数研究表明 K63 多泛素化链主要参与溶酶体降解。在这里，我们发现 GPX4 在 β-ELE 处理的 NSCLC 细胞中急剧下降，这不是由于转录变化，而是由于溶酶体降解增强，GPX4 的多泛素化链主要与 K63 相连（图 S8B）。TFEB 敲除减少 β-ELE 诱导的 GPX4 泛素化，其向溶酶体的易位，最终逆转了 GPX4 的衰落。这些现象表明，TFEB 与 β-ELE 处理的 EGFR 宽型 NSCLC 细胞中的 GPX4 溶酶体降解呈正相关。

在这项研究中，我们发现 TFEB 是 β-ELE 治疗 EGFR 宽型 NSCLC 细胞的潜在靶点。由于 TFEB 在肺癌中高度表达，并且报道的研究表明 TFEB 在肺癌进展中的负面影响，因此该策略似乎有望用于临床。此外，尚未报道 TFEB 促进 GPX4 溶酶体降解的直接证据。这是首次在天然抗癌剂 β-ELE 处理的 NSCLC 细胞中揭示这一现象，这将为 NSCLC 治疗策略开发和天然抗癌药物筛选提供线索。然而，β-ELE 如何与 TFEB 的 ZIP 区域结合，以及为什么 K63 多聚泛素化在这种翻译后修饰中占主导地位，仍需要进一步研究。

尽管 β-ELE 的抗肺癌活性是在十年前被发现的，但治疗靶点和机制仍不清楚。报道的研究主要集中在疗效研究和对一些致癌途径的影响。然而，基于蛋白质-配体结合的“金”标准测量的 β-ELE 的特殊结合蛋白，例如 SPR，尚未报道。此外，力学研究主要集中在报道的参与肺癌发展的信号通路，而溶酶体降解的力学研究很少。

天然化合物通常具有一些未知的抗癌机制，负责其抗癌活性。在这项研究中，我们使用 β-ELE 揭示了独特的抗癌机制，这可能会为开发一种解决 NSCLC 的新方法提供粘合剂。首先，蛋白质-配体结合实验 SRP 首次用于证明 β-ELE 与 TFEB 具有结合亲和力。其次，首次揭示 TFEB 促进 β-ELE 诱导的 NSCLC 铁死亡和抗癌作用，敲除 TFEB 减弱 β-ELE 诱导的原位 NSCLC NOD/SCID 小鼠模型的铁死亡和抗癌作用。第三，由于 TFEB 对 GPX4 的上游影响尚未阐明，对 β-ELE 介导的抗癌过程中生物学事件的观察有助于揭示 TFEB 增加 GPX4 溶酶体降解和随之而来的事件铁死亡的新过程，这可能是 NSCLC 治疗的新策略。

实际应用

本研究发现，溶酶体主调节因子 TFEB 介导的 GPX4 降解可能是 β-ELE 处理的 NSCLC 细胞中 TFEB 介导的铁死亡的潜在新机制。由于癌细胞可以逃避细胞凋亡，因此靶向溶酶体和铁死亡是有前途的抗癌策略。本研究中说明的新机制将扩大 β-ELE 作为溶酶体靶向抗癌剂的使用。此外，TFEB 介导的 GPX4 溶酶体降解可以开发为一种有前途的铁死亡诱导方法。

附录 A. 补充数据

补充图 8.图 S8.β-ELE 对自噬相关蛋白无明显影响，主要诱导 A549 细胞中的 K63-多泛素化。（A） A549 细胞处理 β-ELE 或 6 、 12 、 24 和 48 h 后，Western blot 分析 cleaved-PARP 、 Bcl-2 、 LC3 、 Atg7 、 Atg5 和 P62 的蛋白表达。（二）用 GPX4-GFP 和 HA-Ub-WT、GPX4-GFP 和 HA-K48-Ub、GPX4-GFP 和 HA-K63-Ub 共转染 A549 细胞。然后，将 β-ELE （120 μg/mL） 应用于细胞 24 小时。用 RIPA 缓冲液裂解细胞，然后通过 GFP 纳米珠对细胞裂解物进行免疫沉淀，并如图所示使用抗体通过蛋白质印迹分析。

（翻译及审校：梁嘉伟、李彦慧）