STX11的过表达通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路中的成纤维细胞激活来减轻肺纤维化

摘要

成纤维细胞的激活在特发性肺纤维化（IPF）的发生和发展中起着重要作用，这是一种渐进性、不可逆且具有纤维化的肺部疾病。然而，IPF中成纤维细胞激活的潜在机制仍然难以捉摸。在这里，我们展示了在特发性肺纤维化(IPF)患者的肺组织、博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化小鼠以及活化的成纤维细胞中，STX11和SNAP25的表达水平均有所下调。STX11或SNAP25的上调通过促进自噬抑制了TGF-β1诱导的人类肺成纤维细胞（HLFs）的激活。然而，当使用氯喹（CQ）阻断自噬时，它们未能抑制成纤维细胞的激活。此外，STX11或SNAP25可以抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖和迁移。在体内，STX11的过表达在小鼠BLM诱导的肺纤维化中发挥了保护作用。STX11和SNAP25相互促进对方的表达。共免疫沉淀（Co-IP）实验表明STX11与SNAP25相互作用。从机制上讲，STX11-SNAP25相互作用激活了成纤维细胞的自噬，并进一步通过阻断PI3K/AKT/mTOR通路抑制了成纤维细胞的激活。总体而言，结果表明STX11-SNAP25相互作用显著抑制了肺纤维化，通过促进成纤维细胞的自噬和通过阻断PI3K/ATK/mTOR信号通路抑制成纤维细胞激活。因此，STX11成为IPF的有前景的治疗靶点。

引言

特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性、进行性和致命的间质性肺病，病因不明，其特征是反复的肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞增殖和分化为肌成纤维细胞(即激活的成纤维细胞)，以及肺间质中大量的细胞外基质积聚。激活的成纤维细胞是IPF发展的关键效应细胞。它们表现出强大的收缩能力，并且能够产生并释放大量的胶原蛋白蛋白，随后导致肺组织的破坏和异常修复。IPF患者在诊断后的中位生存时间为2-3年，5年生存率低于40%。尽管进行了大量研究，但目前还没有有效的药物可用。已经开发并批准了两种药物，尼达尼布（一种酪氨酸激酶抑制剂）和吡非尼酮，用于治疗IPF患者。它们有助于减缓肺功能下降，但未能阻止或逆转疾病进展并降低IPF患者的死亡率。因此，揭示IPF的发病机制并开发针对该病的分子靶向药物至关重要。

溶胶态N-乙基马来酰胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白是常见的融合因子，有助于货物在细胞内的运输和膜融合。SNARE复合体由四螺旋的卷曲线圈组成。Qa、Qb和Qc-SNARE模式属于SNARE家族，包括来自syntaxin（STX）和synaptosome associated protein25（SNAP-25）家族（包括SNAP23、SNAP25、SNAP29和SNAP47），而R-SNARE模式则存在于囊泡相关膜蛋白（VAMP）中。STX11是SNARE家族成员，在免疫系统中高度表达，包括脾脏、胸腺和淋巴结。它在各种器官中也广泛表达，肺部的表达相对较高，而心脏、肝脏和肾脏组织的表达较低。STX11与细胞生物学活性以及疾病的发生和发展密切相关。例如，Kinoshita等人报告称，它通过与巨噬细胞中的SNAP-23合作，调节TLR4刺激依赖性运输到质膜上，这与微生物病原性和免疫反应有关。STX11突变导致家族性嗜血性淋巴细胞增多症类型4，这是一种危及生命的疾病，其特征是严重的过度炎症。Kogl等人发现，在感染淋巴细胞性脉络膜炎病毒后，STX11缺陷小鼠的杀伤性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的去颗粒化和细胞溶解活性显著降低，并表现出全套的噬血性淋巴组织细胞增多症临床症状。基于GEO公共数据库的数据挖掘，我们发现IPF肺中STX11水平下降。然而，其在IPF中的作用尚未被探索。

自噬（源自希腊语“自我吞噬”）是一个关键的细胞过程，它回收细胞质中的长寿命蛋白质和细胞器以维持细胞稳态。自噬与多种生理和病理过程相关联。在生理条件下，需要一个恒定的基础自噬水平来维持细胞稳态。例如，基础自噬水平通过清洁受损的线粒体来减缓细胞衰老，减少反应性氧物种的产生并维持细胞的生理活动。而异常的自噬会导致一系列疾病，包括哮喘、慢性阻塞性肺病和IPF。例如，张等人报告称InclAPF（IncRNA抑制肺纤维化的自噬），也称为LINC00941，通过抑制自噬过程中自吞噬体与溶酶体之间的融合，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化以及肌成纤维细胞的增殖和迁移，加速了肺纤维化的进展。另一项研究表明，IPF肺组织中的白细胞介素-37（IL-37）水平降低，而IL-37的过度表达通过抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）信号通路并增强IPF成纤维细胞中的自噬作用，缓解了小鼠由博莱霉素（BLM）引起的肺纤维化。因此，自噬与肺纤维化的进展密切相关。内体-溶酶体融合是自噬过程中的一个关键步骤。溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）是晚期内体/溶酶体的标志物。Offenhauser及其同事发现GFP-STX11主要位于标记有LAMP1的晚期内体中，并得出结论STX11通过与巨噬细胞中的Vti1b结合，调节内体与溶酶体之间的融合。然而，STX11是否通过调节自噬影响IPF的发生和进展仍不清楚。

在本研究中，我们检查了IPF患者和BLM诱导的肺纤维化小鼠以及激活的成纤维细胞中STX11和SNAP25的表达。然后，我们进一步探讨了STX11和SNAP25在成纤维细胞向肌成纤维细胞分化中的作用和潜在机制。我们还研究了STX11过度表达是否缓解了小鼠由BLM引起的肺纤维化。此外，我们使用重组人STX11蛋白进一步确定了STX11在人类肺成纤维细胞（HLF）激活中的作用，并发现它也抑制了TGF-β1诱导的α-SMA、纤维连接蛋白和胶原蛋白I的表达，表明STX11抑制了TGF-β1诱导的HLF激活。我们的研究旨在阐明STX11对成纤维细胞激活的贡献及其潜在机制，以及识别治疗IPF的新潜在治疗靶点。

结果

IPF患者和BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中STX11的表达水平降低

为了探索STX11在肺纤维化中的表达，我们在GEO数据库中筛选了与IPF相关的数据库。如补充图1a-f所示，与对照组相比，IPF组STX11的表达水平显著降低（GSE10667、GSE24206、GSE32537、GSE53845、GSE72073、GSE110147）。尽管在GSE21369和GSE35145数据集中没有观察到统计学显著性，但其IPF组中的表达水平呈现下降趋势（补充图1g、h）。此外，我们对GEO数据库中的STX11表达数据进行了一项荟萃分析。如补充图1i所示，IPF组中STX11的表达水平明显较低（SMD=-1.88，95%CI：-2.59至-1.18，p<0.0001）。我们进一步验证了临床样本和小鼠肺组织中的STX11表达。Westernblot显示，与健康对照组（HC）肺组织相比，人类IPF肺组织中STX11的表达水平降低（图1a,b）。同时，我们在小鼠气管内注入BLM以诱导肺纤维化。H&E结果显示损伤的肺泡结构、累积的胶原蛋白、增厚的间质隔、BLM组Ashcroft评分增加，表明BLM确实诱导了小鼠的肺纤维化（图1c，d）。然后我们检查了其在小鼠肺组织中的表达。在BLM组中观察到STX11表达的降低（图1e-g）。总体而言，这些结果表明肺纤维化中STX11的表达减少，这表明它可能参与了肺纤维化的进展。

图1 IPF和对照组肺组织（临床标本和小鼠）中STX11的表达。a，b 通过蛋白质印迹法检测人类IPF组织和正常人类肺组织中的STX11蛋白表达。c 对BLM组和对照组小鼠肺组织切片进行H&E染色。d 使用Ashcroft评分评估小鼠肺组织的纤维化程度。免疫荧光（e）和蛋白质印迹（f，g）测定用于检测小鼠肺组织中STX11的表达（原始放大倍数×200，标尺条：100μm）。数据表示为平均值±标准误（n=5或6）。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001

TGF-β1诱导的成纤维细胞激活中STX11表达下降

成纤维细胞激活在IPF的发病机制中起着关键作用。为了建立一个成纤维细胞激活的细胞模型，我们用TGF-β1处理了人类肺成纤维细胞（HLFs）。qPCR和westernblot结果显示，与对照组相比，TGF-β1组中ACTA2（编码α-SMA的基因）、fibronectin（编码纤维连接蛋白的基因）和COL1A1（编码胶原蛋白I的基因）的表达增强（补充图2a-e）。这些数据证实了TGF-β1对HLFs的激活。然后我们在用TGF-β1处理的HLFs中识别了STX11的表达。在TGF-β1组中，STX11的mRNA和蛋白质表达显著下降（图2a-d），这表明HLF激活下调了STX11的表达，STX11可能参与了成纤维细胞激活。

STX11的过表达通过促进自噬减弱成纤维细胞激活

为了揭示STX11在成纤维细胞激活中的作用，我们用慢病毒（LV）稳定过表达STX11在HLFs中。与LV-NC组相比，LV-STX11组中STX11的mRNA和蛋白质表达水平显著上调（图2e-g）。STX11的强制表达显著降低了TGF-β1诱导的α-SMA、fibronectin和胶原蛋白I的表达（图2h-l）。此外，我们进一步利用重组人STX11蛋白确定了STX11在HLF激活中的作用，并发现它也抑制了TGF-β1诱导的这些成纤维细胞激活标志物的表达，表明STX11抑制了TGF-β1诱导的HLF激活（补充图3）。同时，我们研究了STX11在HLF迁移中的作用。如图2m,n所示，TGF-β1促进了HLF的迁移。而STX11抑制了TGF-β1诱导的HLF迁移。我们还探讨了STX11在HLF增殖中的作用。Ki-67蛋白已被广泛用作细胞增殖标志物数十年。因此，为了反映HLF的增殖，我们使用免疫荧光法检测Ki-67的表达。pcDNA-STX11质粒被用来在HLF中过表达STX11。如补充图4所示，TGF-β1促进了HLF的增殖；而STX11抑制了TGF-β1诱导的HLF增殖。为了探索STX11是否通过促进自噬抑制HLF激活，我们检查了HLF的自噬相关标志物（LC3II/I和p62）以及成纤维细胞激活标志物（a-SMA、纤维连接蛋白和胶原蛋白I）在有无自噬抑制剂（氯喹、CQ）的情况下。如图2o-r所示，STX11的过表达导致a-SMA、纤维连接蛋白、胶原蛋白I和p62的蛋白质表达减少，以及LC3II/LC3I的比例增加。为了进一步确定STX11在自噬中的作用，我们将串联标记的mCherry-GFP-LC3腺病毒转染到HLF中，以监测LC3的亚细胞定位。如补充图5所示在pcDNA-STX11组中，自噬体数量增加，表明STX11过表达促进了HLFs的自噬。

CQ可以增加酸性溶酶体的pH值，并在溶酶体中灭活酸性水解酶，从而抑制细胞内自噬溶酶体的融合和降解。因此，用CQ处理的细胞导致LC3 II/LC3I和p62的积累，表明自噬受阻。正如预期的那样，CQ处理增加p62和LC3 II/LC3I的蛋白表达，表明CQ可以抑制HLFs中的自噬（图2s-u）。此外，CQ治疗促进了成纤维细胞激活标志物的蛋白表达（图2s-v）。这些发现表明STX11通过激活自噬抑制了成纤维细胞向肌成纤维细胞的差异分化。

图 2  STX11 在成纤维细胞自噬和活化中的作用。HLFs 经 10 ng/ml TGF-β1 处理 48 小时。a 采用 qPCR 检测 STX11 的 mRNA 表达。b、c 采用 Western 印迹检测 STX11 的蛋白表达。d 采用免疫荧光检测 STX11 的蛋白表达（原始放大倍数×200，标尺：100 μm）。HLFs 感染携带 STX11 的慢病毒并经 TGF-β1 处理 48 小时。采用 qPCR（e）和 Western 印迹（f、g）检测 STX11 的表达。STX11 过表达的 HLFs 经 10 ng/ml TGF-β1 处理 48 小时。通过 qPCR（h - j）和 Western 印迹（k、l）检测α-SMA、纤维连接蛋白和 COL1A1（胶原蛋白 I）的表达。m、n 采用 Transwell 检测 HLFs 的迁移能力（原始放大倍数×100，标尺：200 μm）。o - r 采用 Western 印迹检测 STX11 过表达的 HLFs 中成纤维细胞活化标志物（α-SMA、纤维连接蛋白、胶原蛋白 I）和自噬相关标志物（LC3II/I、P62）的表达。s - v STX11 过表达的 HLFs 经最终浓度为 10 mM 的氯喹（CQ）刺激 48 小时。采用 Western 印迹检测 HLFs 中成纤维细胞活化标志物和自噬相关标志物的表达。GAPDH 用作内参。数据表示为均值±标准误（n = 3 或 5）。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；NS，无显著性

STX11与SNAP25相互作用

我们利用STRING数据库来探索与STX11相互作用的分子，并分析显示STX11可能与SNAP25、STXBP6、UNC13D和FHL2有关（图3a）。我们在STX11过表达的HLFs中检测到了这些基因的mRNA表达。如图3b-d所示，STX11图2 STX11在成纤维细胞自噬和激活中的作用。HLFs用10 ng/mlTGF-β1处理48小时。使用qPCR检测STX11的mRNA表达。b、c使用Westernblot检测STX11的蛋白表达。d使用免疫荧光检测STX11的蛋白表达（原始放大倍数为200，比例尺：100μm）。HLFs感染携带STX11的慢病毒并处理TGF-β148小时。qPCR（e）和Westernblot（f,g）检测STX11的表达。STX11过表达的HLFs用10 ng/mlTGF-β1处理48小时。通过qPCR（h-j）和Westernblot（k,I）检测a-SMA、纤维连接蛋白和COL1A1（胶原l）的表达。m,n使用Transwell实验确定HLFs的迁移能力（原始放大倍数为100，比例尺：200μm）。o-r使用Westernblot实验确定HLFs中成纤维细胞激活标志物（α-SMA、纤维连接蛋白、胶原I）和自噬相关标志物（LC3II/l、P62）的表达。s-v STX11过表达的HLFs用氯喹（CQ）以最终浓度10 mM刺激48小时。Westernblot实验用于检查HLFs中成纤维细胞激活标志物和自噬相关标志物的表达。使用GAPDH作为内部对照。数据表示为平均值±标准差（n=3或5）。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；NS，无显著性。图3 STX11与SNAP25之间的关系。a使用STRING在线工具识别与STX11相互作用的蛋白质。qPCR(b)和western blot(c,d)分析用于检测SNAP25的表达。qPCR(e)和western blot(f,g)分析用于检查在用pcDNA-NC或pcDNA-SNAP25转染的HLFs中STX11的表达。qPCR(h)和westernblot(i,j)分析用于探索在用si-NC或si-SNAP25转染的HLFs中STX11的表达。k进行免疫荧光实验以检测HLFs（原始放大倍数为x200，刻度尺：100μm）中STX11和SNAP25的表达。i通过免疫荧光染色显示HC和IPF肺切片中的STX11（绿色）、SNAP25（红色）和DAPI（蓝色）的代表性图像（刻度尺=100μm）。m进行免疫荧光实验以检测小鼠肺组织（原始放大倍数为x200，刻度尺：100μm）中STX11和SNAP25的表达。n在HLFs中STX11和SNAP25的相互免疫沉淀。使用GAPDH作为内部对照。数据表示为平均值±标准差（n=5）。**p<0.01;***p<0.001促进SNAP25在mRNA和蛋白水平上的表达。接下来，我们确定了在SNAP25敲减或过表达的HLFs中STX11的表达。有趣的是，我们发现SNAP25的上调也促进了STX11的表达（图3e-g）；相反，SNAP25的下调抑制了STX11的表达（图3h-j）。我们进一步研究了STX11是否与SNAP25相互作用。首先，我们通过免疫荧光同时检测了小鼠肺组织和HLFs中STX11和SNAP25的表达。我们在人类肺组织、小鼠肺组织和HLFs中发现了STX11和SNAP25之间的共定位荧光（图3k-m），表明STX11和SNAP25之间存在潜在的相互作用。然后，我们进行了共IP实验来验证STX11是否能够与SNAP25结合。结果显示，STX11蛋白或SNAP25蛋白可以相互拉下，这表明STX11和SNAP25之间存在相互作用并形成了一个复合体（图3n）。

图 3 STX11 与 SNAP25 的关系。a 使用 STRING 在线工具鉴定与 STX11 相互作用的蛋白。qPCR（b）和蛋白质印迹（c，d）检测 SNAP25 的表达。qPCR（e）和蛋白质印迹（f，g）检测转染 pcDNA-NC 或 pcDNA-SNAP25 的 HLFs 中 STX11 的表达。qPCR（h）和蛋白质印迹（i，j）检测转染 si-NC 或 si-SNAP25 的 HLFs 中 STX11 的表达。k 免疫荧光检测 HLFs 中 STX11 和 SNAP25 的表达（原始放大倍数×200，标尺：100 μm）。l 免疫荧光染色显示 HC 和 IPF 肺组织中 STX11（绿色）、SNAP25（红色）和 DAPI（蓝色）的代表图像（标尺 = 100 μm）。m 免疫荧光检测小鼠肺组织中 STX11 和 SNAP25 的表达（原始放大倍数×200，标尺：100 μm）。n HLFs 中 STX11 和 SNAP25 的相互免疫共沉淀。GAPDH 用作内参。数据表示为平均值 ± 标准误（n = 5）。**p < 0.01；***p < 0.001

SNAP25的过表达减弱成纤维细胞的激活和增殖

我们在博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化小鼠肺组织和转化生长因子-β1(TGF-β1)激活的成纤维细胞中检测到SNAP25的表达。在BLM组中发现SNAP25的表达减少（图4a-c）。同样地，其在TGF-β1激活组中的表达低于对照组（图4d-g）。这些结果表明SNAP25可能参与肺纤维化和成纤维细胞的激活。

为了评估 SNAP25 在成纤维细胞活化中的作用，我们将 pcDNA-SNAP25 或 SNAP25 siRNA 转染到 HLFs 中。PcDNA-SNAP25 显著促进了 HLFs 中 SNAP25 的表达（图 4h-j）。如图 4k–o 所示，SNAP25 过表达的 HLFs 中成纤维细胞活化标志物的表达显著减少。同时，SNAP25 过表达抑制了 HLFs 的迁移（图 4p, q）。我们还探讨了 SNAP25 在 HLF 增殖中的作用。如补充图 6 所示，TGF-β1 促进了 HLFs 的增殖；而 SNAP25 过表达抑制了 TGF-β1 诱导的 HLF 增殖，证明 SNAP25 过表达阻碍了成纤维细胞的活化、增殖和迁移。

相比之下，通过siRNA下调SNAP25（补充图7a-c）增加了成纤维细胞活化标志物的表达，并促进了HLF迁移（补充图7d-j）。这些结果表明，SNAP25沉默促进了成纤维细胞的活化和迁移。

为了探究SNAP25是否通过促进自噬来抑制HLF活化，我们在有或没有CQ的情况下检测了自噬相关标志物和HLF的成纤维细胞活化标志物。如图4r–u所示，SNAP25过表达导致α-SMA、纤维连接蛋白、胶原蛋白I和p62的蛋白表达减少，LC3II/LC3I增加。为了进一步确定SNAP25在自噬中的作用，我们将串联标记的mCherry-GFP-LC3腺病毒转染到HLF中以监测LC3的亚细胞定位。如补充图8所示，pcDNA-SNAP25组中观察到自噬体增加，表明SNAP25过表达促进了HLF的自噬。

CQ处理增加了HLFs中p62和LC3 II/LC3 I的蛋白表达，表明自噬被阻断（图4v–x）。此外，CQ处理后成纤维细胞活化标志物的蛋白表达增加（图4v–y）。这些发现表明SNAP25通过激活自噬抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。

图 4  SNAP25 在成纤维细胞自噬和活化中的作用。a、b 采用Western印迹法检测小鼠肺中SNAP25的蛋白表达。c 采用免疫荧光法检测小鼠肺中SNAP25的蛋白表达（原始放大倍数×200，标尺：100微米）。HLFs经10 ng/ml TGF-β1处理48小时。qPCR（d）和Western印迹（e、f）法用于检测HLFs中SNAP25的表达。g 采用免疫荧光法检测SNAP25的蛋白表达（原始放大倍数×200，标尺：100微米）。HLFs转染pcDNA-NC或pcDNA-SNAP25 48小时。qPCR（h）和Western印迹（i、j）法用于鉴定SNAP25的表达。HLFs转染pcDNA-NC或pcDNA-SNAP25 24小时，然后用TGF-β1刺激48小时。qPCR（k-m）和Western印迹（n、o）法用于确定α-SMA、纤维连接蛋白和胶原蛋白I的表达。p、q 采用Transwell法确定HLFs的迁移能力（原始放大倍数×100，标尺：200微米）。r-u Western印迹法用于确定SNAP25表达增强的HLFs中成纤维细胞活化标志物（α-SMA、纤维连接蛋白、胶原蛋白I）和自噬相关标志物（LC3II/I、P62）的表达。v-y 过表达SNAP25的HLFs经最终浓度为10 mM的氯喹（CQ）刺激48小时。Western印迹法用于检测HLFs中成纤维细胞活化标志物和自噬相关标志物的表达。GAPDH用作内参。数据表示为平均值±标准误（n=3或5）。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001

STX11的强制表达通过上调SNAP25来减弱成纤维细胞活化

为了确定STX11是否通过上调SNAP25来抑制成纤维细胞活化，我们用慢病毒-STX11和SNAP25 siRNA处理HLFs。正如预期的那样，STX11的上调抑制了成纤维细胞活化标志物的表达，而这一过程可以通过下调SNAP25来逆转，这表明STX11通过上调SNAP25来抑制成纤维细胞活化（图5a，b）。

STX11-SNAP25复合物通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路减弱成纤维细胞活化

为了阐明STX11-SNAP25复合物抑制人肺成纤维细胞（HLFs）活化的机制，我们探索了相关信号通路。PI3K/AKT/mTOR通路在自噬中起着至关重要的作用。因此，我们探讨了它是否参与了STX11和SNAP25对成纤维细胞活化的抑制。蛋白质印迹法显示，该通路被转化生长因子-β1（TGF-β1）激活，而被STX11表达增强所抑制（图5c-f）。为了进一步确定STX11是否以依赖PI3K/AKT/mTOR信号通路的方式对成纤维细胞活化产生影响，我们用PI3K/AKT/mTOR激活剂胰岛素样生长因子-1（IGF-1）处理HLFs。STX11过表达引起的成纤维细胞活化标志物和相关PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的变化可以被IGF-1逆转（图5g-j）。综上所述，这些结果表明STX11通过抑制该通路来抑制成纤维细胞的活化。

我们还研究了 SNAP25 与 PI3K/AKT/mTOR 通路之间的关系。正如预期，强迫表达 SNAP25 抑制了该通路（图 5k–n）。然而，通过强迫表达 SNAP25 导致的磷酸化 AKT、磷酸化 mTOR、α-SMA、纤维连接蛋白和胶原蛋白 I 表达的减少，在用 IGF-1 处理后又再次升高（图 5o–r）。相反，下调 SNAP25 激活了该通路，这一情况被通路抑制剂 LY294002 所逆转（图 5s–v）。综合来看，这些数据表明 SNAP25 通过阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制成纤维细胞的活化。

图 5  STX11 和 SNAP25 对 PI3K/AKT/mTOR 通路的影响。a、b 过表达 STX11 的 HLF 细胞转染 si-NC 或 si-SNAP25 24 小时后，再用 TGF-β1 刺激 48 小时。通过 Western 印迹法检测α-SMA、纤维连接蛋白和胶原蛋白 I 的表达。c - f 在过表达 STX11 的 HLF 细胞中通过 Western 印迹法检测 PI3K/AKT/mTOR 通路相关蛋白的表达。g - j 强制表达 STX11 的 HLF 细胞预先用 100 ng/ml IGF-1 处理 1 小时，然后暴露于 TGF-β1 48 小时。利用 Western 印迹法检测 HLF 细胞中的蛋白表达。k - n 在过表达 SNAP25 的 HLF 细胞中通过 Western 印迹法检测 PI3K/AKT/mTOR 通路相关蛋白的表达。o - r 强制表达 SNAP25 的 HLF 细胞预先用 100 ng/ml IGF-1 处理 1 小时，然后暴露于 TGF-β1 48 小时。利用 Western 印迹法检测 HLF 细胞中的蛋白表达。s - v SNAP25 沉默的 HLF 细胞预先用 10 μM LY294002 处理 1 小时，然后暴露于 TGF-β1 48 小时。利用 Western 印迹法检测 HLF 细胞中的蛋白表达。数据表示为均值 ± SEM（n = 3 或 5）。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；NS，无显著性

STX11的增强表达减轻了博来霉素（BLM）诱导的小鼠肺纤维化

为了探讨STX11在博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化中的作用，我们通过气管内滴注AAV-STX11到小鼠肺部。H&E和Masson染色显示，BLM组出现了肺纤维化（图6a，b）。AAV-STX11滴注后，STX11的表达明显升高，伴随着肺纤维化的减轻（图6a–c，g–h）。此外，与对照组相比，BLM组和BLM + AAV-NC组中那些与成纤维细胞活化相关的标志物的表达增加（图6d–f，g，i–k）。然而，与BLM + AAV-NC组相比，上述标志物在BLM + AAV-STX11组中的表达减少（图6d–f，g，i–k）。这些结果表明，STX11的过表达减轻了博来霉素（BLM）诱导的小鼠肺纤维化。

图 6 STX11 过表达抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。a 小鼠肺组织切片的 H&E 染色和 Masson 染色的代表性图像。b 基于 H&E 染色的 Ashcroft 评分被确定。c - f 通过 qPCR 检测 STX11、α-SMA、纤维连接蛋白和 COL1A1 的 mRNA 表达。g - k 通过蛋白质印迹检测 STX11、α-SMA、纤维连接蛋白和胶原蛋白 I 的蛋白表达。GAPDH 被用作内参。数据表示为均值 ± 标准误（n = 8）。*p < 0.05；**p < 0.01；*** p < 0.001；NS，无显著性

讨论

在本研究中，我们调查了STX11在IPF中的作用。基因表达组学（GEO）数据库是一个公共存储库，存档并免费分发各种疾病的基因表达数据集，包括肺癌和IPF。首先，我们发现IPF患者的肺组织（GEO数据库和临床样本）以及BLM诱导的肺纤维化小鼠中STX11显著下调。我们还发现，在活化的肺成纤维细胞中STX11也减少了。然后，STX11的过表达通过促进HLF自噬抑制HLF活化，并减轻了BLM诱导的小鼠肺纤维化的严重程度。此外，我们还使用重组人STX11蛋白阐明了STX11对人肺成纤维细胞活化的影响，发现它也抑制了TGF-β1诱导的成纤维细胞活化标志物的表达。同时，SNAP25的功能获得通过促进自噬抑制HLF活化。相反，SNAP25的丧失促进了HLF活化。通过STRING数据库和共免疫沉淀（co-IP）检测，我们确定STX11可以与SNAP25形成复合物，阻断PI3K/AKT/mTOR通路。我们的研究表明STX11是IPF的潜在治疗靶点。

STX11的异常表达与家族性噬血细胞淋巴组织细胞增生症4型有关。崔等人在第17和18篇报告中指出STX11是IPF（特发性肺纤维化）中的一个关键基因，但他们发现在正常组和IPF组之间的肺组织中其mRNA表达没有统计学显著性。我们推断他们研究中临床样本数量少（n=3）可能是原因。

众所周知，成纤维细胞是肺纤维化中的主要效应细胞。成纤维细胞的激活导致大量细胞外基质的沉积，从而导致肺纤维化。越来越多的研究表明自噬在成纤维细胞激活中至关重要。由于TGF-β1是一种诱导成纤维细胞激活的重要细胞因子，我们使用它来激活HLFs（人肺成纤维细胞）。

我们发现TGF-β1降低了HLFs中STX11的表达，表明STX11可能参与HLF的激活。先前的研究表明，STX11通过调节肝细胞中的脂解和脂噬作用来减弱脂肪甘油三酯脂肪酶的作用。Offenhaus及其同事证明，STX11主要位于LAMP1标记的晚期内体中，因此得出结论，STX11通过与Vti1b结合来调节巨噬细胞内体与溶酶体的融合。众所周知，内体-溶酶体融合是自噬过程中的一个重要步骤。STX11作为SNARE家族的一员，与自噬有关。我们发现，STX11过表达促进了自噬并抑制了HLFs的激活；此外，在用CQ（一种自噬抑制剂）阻断自噬后，HLFs再次被激活。这些发现表明，强制表达STX11通过促进自噬抑制HLF激活。此外，STX11的过表达随着SNAP25的增加抑制了HLF的激活。

作为一个SNARE复合体，SNAP25在调节突触信号传递、神经递质释放、囊泡外渗和细胞间信号传导中至关重要。研究还表明SNAP25与囊泡融合和溶酶体运输有关。已有研究表明SNAP25在多种癌症中表达失调。例如，在肺癌中SNAP25上调，而在前列腺癌中则下调。在我们的研究中，STX11的过表达增强了SNAP25的表达，这表明SNAP25也可能参与HLF激活。为了解决这个问题，我们检测了BLM诱导的小鼠肺组织和TGF-β1激活的HLFs中SNAP25的表达。两项实验均发现SNAP25表达减少。此外，增强SNAP25表达抑制了成纤维细胞的激活，而下调其表达则促进了成纤维细胞的激活。研究还表明SNAP25与自噬有关。例如，Mu等人报告称核蛋白转录调节因子1（NUPR1）通过促进肿瘤细胞中SNAP25的表达来介导自噬溶酶体的外流。另一项研究发现，在尼曼-匹克C病特异性诱导的神经干细胞（NPC-iNSCs）中SNAP25缺乏，而在NPC-iNSCs中过表达SNAP25显著降低了p62和LC3-I/II的表达，表明上调SNAP25可以增强自噬。此外，Wang等人发现SNAP25促进了PTEN诱导的激酶1（PINK1）依赖的线粒体自噬，并抑制了caspase-3/GSDME依赖的焦亡，以发挥对术后认知功能障碍的神经保护作用。在这里，我们发现SNAP25的过表达促进了自噬并抑制了HLFs的激活。

STX、VAMP 和 SNAP-25 亚家族属于 SNARE 家族。SNARE 复合物在突触囊泡的钙依赖性外排和细胞内货物运输中至关重要，并促进膜融合。研究表明，STX1A 和 SNAP25 相互作用，在体外形成紧密复合物以发挥生物学作用。Nozawa 等人报道，STX6-VTI1B-VAMP3 复合物通过介导自噬体和循环内体的融合促进了异体自噬。有趣的是，我们在这里揭示了 STX11 和 SNAP25 促进了彼此的表达。此外，共免疫沉淀（co-IP）实验表明 STX11 能与 SNAP25 相互作用，表明它们形成复合物来发挥生物学作用。

PI3K/AKT/mTOR通路介导细胞增殖、分化、存活，并与肺纤维化密切相关。31,32 已经明确的是，PI3K由p85亚基和p110亚基组成。一旦PI3K被激活，其p85亚基转移到质膜上，P110亚基通过与p85亚基相互作用催化PIP2底物转化为PIP3。然后PIP3与AKT相互作用，在Thr308和Ser473位点磷酸化Akt蛋白。最终，AKT激活下游靶分子，包括mTOR。33,34 证据表明，该通路通过抑制肺成纤维细胞的自噬参与肺纤维化。35 例如，彭等人发现阿司匹林通过PI3K/AKT/mTOR依赖的自噬通路缓解肺纤维化。35 李等人报告称，duvelisib通过增强自噬并阻断PI3K/AKT/mTOR通路抑制肺成纤维细胞的活化，从而缓解肺纤维化。34 在我们的研究中，我们发现STX11和SNAP25复合物促进成纤维细胞自噬，从而通过抑制该信号通路抑制成纤维细胞的活化。

本研究存在一些限制。首先，STX11 和 SNAP25 相互调控的机制尚不清楚。其次，STX11 和 SNAP25 之间的具体结合位点需要在进一步的研究中加以确定。

总之，我们发现 STX11-SNAP25 相互作用通过阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制成纤维细胞活化（图 7）。这些结果不仅拓宽了我们对 IPF 发病机制和成纤维细胞活化调控机制的理解，而且可能为新型抗 IPF 分子靶向药物的开发提供见解。

图 7 研究示意图。STX11 与 SNAP25 形成复合物，阻断 PI3K/AKT/mTOR 通路并促进肺成纤维细胞的自噬，从而抑制肺纤维化的发生发展

翻译及审校：圣鹏飞