CXCR1+ 中性粒细胞浸润协调 EGFR 突变非小细胞肺癌对第三代 EGFR-TKI 的反应

尽管第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 (EGFR-TKI) 是 EGFR 突变型非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的标准治疗方法，但人们对其反应或耐药性的预测因素知之甚少。在这里，我们整合了接受第三代 EGFR-TKI 治疗的 EGFR 突变型 NSCLC 患者的治疗前和耐药后肿瘤样本的单细胞 RNA (scRNA) 测序、bulk RNA 测序、多重免疫荧光和流式细胞术数据。我们发现，耐药样本的 CXCR1+ 中性粒细胞浸润明显比治疗前样本丰富 (P < 0.01)，这与其他亚型的中性粒细胞不同，并显示出免疫抑制特性。空间分析显示耐药样本中增多的CXCR1+中性粒细胞主要浸润到肿瘤核心，中性粒细胞与肿瘤细胞的平均距离由33μm显著缩短至19μm。scRNA和bulk RNA测序数据的深入分析表明耐药样本中CXCR1+中性粒细胞与肿瘤细胞的相互作用增多，并激活了肿瘤细胞中的TNF-α/NF-κB信号通路。体外和体内实验验证了CXCR1+中性粒细胞通过激活肿瘤细胞中的TNF-α/NF-κB信号通路导致第三代EGFR-TKI耐药。重要的是，治疗前 CXCR1+ 中性粒细胞浸润丰度较低的患者的无进展生存期 (11.8 vs. 7.5 个月；P = 0.019) 和总生存期 (33.0 vs. 23.5 个月；P = 0.029) 显著长于浸润丰度较高的患者。总之，这些发现表明 CXCR1+ 中性粒细胞浸润与 EGFR 突变型 NSCLC 患者第三代 EGFR-TKI 的疗效相关。

非小细胞肺癌 (NSCLC) 是肺癌的主要组织学亚型，约占肺癌总病例的 85%。尽管过去十年系统性治疗取得了重大进展，但 NSCLC 仍然是全球癌症相关死亡的主要原因。在这些可用的各种治疗策略中，分子靶向治疗，特别是酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)，已成为驱动基因变异的晚期 NSCLC 病例的标准一线治疗。这些药物靶向对肿瘤生长和存活至关重要的异常信号通路。值得注意的靶点包括表皮生长因子受体 (EGFR)、间变性淋巴瘤激酶 (ALK)、ROS 原癌基因 1 受体酪氨酸激酶 (ROS1)、ret 原癌基因 (RET) 和 b-raf 原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶 (BRAF) V600E。与传统治疗相比，具有这些特定基因变异的患者靶向治疗后的客观反应率 (ORR) 更高，无进展生存期 (PFS) 延长，总体生存期 (OS) 增加，生活质量得到改善。

EGFR突变是晚期非小细胞肺癌最常见的致癌变异之一，在非吸烟者和东亚人群中尤为常见。多项II/III期临床试验表明，第三代EGFR-TKI作为EGFR突变型非小细胞肺癌患者的一线治疗，其疗效优于第一代EGFR-TKI。此外，对于接受第一代和第二代EGFR-TKI治疗后出现EGFR T790M突变的患者，第三代EGFR-TKI作为二线或以上治疗，其疗效也优于常规化疗。在我们之前的研究中，我们报道了一种新型第三代EGFR-TKI，SH-1028。与野生型EGFR-TKI相比，其敏感性大约高出198倍。在关键的 II 期临床试验中，SH1028 显示出令人满意的疗效和可耐受的毒性，客观缓解率 (ORR) 为 60.4%，中位无进展生存期 (PFS) 为 12.6 个月。这些令人鼓舞的结果为进一步的临床研究奠定了基础。最近，SH-1028 在 III 期临床试验 (NCT04239833) 中进行了评估，将其作为晚期 EGFR 突变 NSCLC 的一线治疗与第一代和第二代 EGFR-TKI 进行了比较。试验结果令人信服，与对照组 (中位 PFS：9.8 个月) 相比，SH-1028 显示出显著更长的 PFS (中位 PFS：19.3 个月)。基于这些结果，SH-1028 已获得中国国家药品监督管理局 (NMPA) 批准，作为晚期 EGFR 突变 NSCLC 患者的一线治疗药物。尽管第三代 EGFR-TKI 已成为 EGFR 突变 NSCLC 患者的标准治疗方案，但并非所有患者都能从中获益。耐药性的必然性仍然是一个重大问题。目前，已报道的耐药机制可分为三大类：继发性 EGFR 改变、旁路信号通路激活以及表型或组织学转化。然而，迄今为止，这些机制的详细特征尚不明确，确定用于预测第三代 EGFR-TKI 治疗效果的可靠标志物值得进一步研究。

针对 PD-1 或 PD-L1 的免疫疗法（PD-1 阻断）单独使用或与细胞毒性化疗联合使用已在晚期 NSCLC 患者的治疗中取得了巨大成功。这些疗法通过阻断抑制 T 细胞活化的抑制信号来增强抗肿瘤免疫反应。然而，它们在 EGFR 突变型 NSCLC 中的有效性有限。在 EGFR-TKI 治疗进展后，无论是单独使用 PD-1 阻断，还是与化疗或 EGFR-TKI 联合使用均未产生实质性的临床益处。最初的解释将这种较差的反应归因于 EGFR 突变型肺癌的冷肿瘤免疫微环境 (TME) 特征，包括低免疫原性、PD-L1 表达的异质性、细胞毒性 T 细胞浸润少等。肿瘤细胞可以募集免疫细胞和基质细胞，操纵它们的功能来建立免疫抑制环境，保护它们免受免疫介导的消除。相反，肿瘤微环境可以影响肿瘤细胞生物学并改变药物敏感性。因此，肿瘤细胞与其周围细胞之间的动态相互作用会影响它们对治疗的反应。最近的一项研究进一步报告称，治疗前和 TKI 耐药后的样本中抗肿瘤细胞浸润或细胞毒性没有显著变化。由于关于 TKI 诱导的肿瘤微环境重塑的研究有限且样本量有限，EGFR-TKI 在治疗反应性肿瘤中的免疫学作用以及对 EGFRTKI 耐药前后肿瘤免疫微环境特征的动态变化在很大程度上仍未确定。

为了研究这些问题，我们对可以预测第三代 EGFR-TKI 疗效的生物学参数进行了全面的研究。我们还旨在阐明与 EGFR 突变 NSCLC 对 TKI 耐药相关的肿瘤免疫微环境内的动态变化和功能。对接受第三代 EGFR-TKI 的 EGFR 突变 NSCLC 患者治疗前和耐药后的肿瘤样本进行了单细胞 RNA (scRNA) 测序、bulk RNA 测序、多重免疫荧光 (mIF) 和流式细胞术。还进行了体外和体内实验以验证临床肿瘤样本的结果。我们的研究结果共同表明，CXCR1 + 中性粒细胞浸润及其动态变化与第三代 EGFR-TKI 在 EGFR 突变 NSCLC 患者中的疗效有关。CXCR1 + 中性粒细胞的存在通过与肿瘤细胞相互作用促进了耐药性的产生。这种关联凸显了 CXCR1+ 中性粒细胞浸润作为治疗反应的预测生物标志物和克服 EGFR-TKI 治疗耐药性的治疗目标的潜力。

材料与方法

1.伦理批准和同意参与

该研究方案获得了本中心伦理委员会和机构审查委员会的批准，并遵守了《赫尔辛基宣言》、《良好临床试验规范》和中国相关法律法规。

2.患者纳入

本研究纳入了 25 名携带 T790M 突变的 NSCLC 患者（图 1a）。他们均于 2019 年 4 月至 2022 年 2 月期间在我们中心接受了 SH-1028 治疗。研究纳入的参与者符合以下关键资格标准：(i) 通过组织学或细胞学分析确诊为局部晚期或转移性 NSCLC，(ii) 年满 18 岁，(iii) 拥有至少一个根据《实体肿瘤疗效评估标准》1.1 版 (RECIST v.1.1) 定义的可测量病变，(iv) 东部肿瘤协作组 (ECOG) 体能状态评分在 0 至 2 之间，(v) 在接受第一代或第二代 EGFR-TKI 治疗后出现疾病进展，以及 (vi) 提供书面知情同意书。此外，患者参与需要确认肿瘤组织或胸腔积液细胞中存在获得性或原发性 EGFR T790M 突变。如果患者满足以下任何一项标准，则被视为不符合条件：(i) 之前接触过第三代 EGFR-TKI；(ii) 在首次服用 SH-1028 之前的 14 天内接受过细胞毒性化疗或其他抗癌药物；(iii) 在开始 SH1028 治疗前 14 天内或 5 个半衰期内接受过研究药物；(iv) 骨髓和器官功能不足；(v) 有对 SH-1028 任何成分产生超敏反应的病史。

3.数据收集

符合条件的参与者的数据是从电子病历中收集的，符合治疗期间患者随访数据的标准要求，包括治疗反应和临床结果。基线特征包括年龄、性别、吸烟状况、基于 WHO 分类的肺癌组织学和 EGFR 变异状况。EGFR 变异通过 ADx-ARMS EGFR 检测方法（厦门艾默生诊断有限公司）确定。治疗开始后一个月评估肿瘤反应，随后每两个月评估一次，与 RECIST v.1.1 一致。治疗反应的评估包括完全缓解 (CR)、部分缓解 (PR)、疾病稳定 (SD) 或疾病进展 (PD)。最后一次随访的截止日期为 2023 年 2 月 13 日。

4.转录组分析

在治疗前和出现耐药性时获取肿瘤活检组织，共计50个样本进行全转录组测序（图1）。使用RNeasy试剂盒（Qiagen，美国）从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中分离RNA，并使用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，美国）和Agilent 2100 Bioanalyzer确认其质量。该RNA用于构建cDNA文库，然后进行RNA测序。质量评估后，36个样本符合进一步分析的标准（17个来自治疗前样本，19个来自耐药性样本）。利用CIBERSORT算法通过基因表达数据估计肿瘤微环境中22种免疫细胞类型的相对比例。应用X-cell算法验证CIBERSORT算法的结果。我们使用 DESeq2 算法识别了治疗前和耐药肿瘤样本之间的差异表达基因 (DEG)，调整后的 P 值 < 0.05 和 | log2(倍数变化)| > 1.2 被认为具有统计学意义。对于每个基因，表达分数等于基因的表达水平。随后使用 clusterProfiler 对 DEG 进行基因本体 (GO) 富集和京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 通路分析。我们对所有预先排序的基因进行了基因集富集分析 (GSEA)。错误发现率 (FDR) < 0.05 的GO 术语、KEGG 通路和 GSEA 富集分数被认为是显著富集。我们使用 STRING (https://string-db.org/) 和 Cytoscape 软件进行蛋白质-蛋白质相互作用。

5.多重免疫荧光

使用多重免疫荧光 (mIF) 评估成对治疗前和治疗后肿瘤组织中 CD66b、PD-L1、CD8、PD-1、CXCR1 和 PanCK 的表达水平。染色程序采用 BOND RX 全自动染色机（德国韦茨拉尔的 Leica Biosystems 公司）执行，图像采集通过 Vectra Polaris 系统（马萨诸塞州沃尔瑟姆的 PerkinElmer 公司）进行。采用了一系列一抗，包括抗 CD66b（ab197678，Abcam）、抗 PDL1（13684S，Cell Signaling Technology）、抗 CD8（ab237709，Abcam）、抗 PD-1（A20217，ABclonal）、抗 CXCR1（ab124344，Abcam）和抗 PanCK（ab234297，Abcam）。在每个染色周期后，进行热诱导表位修复以消除一抗和二抗。PanCK 阳性区域被指定为肿瘤区域，而 PanCK 阴性区域被确定为基质区域。由经验丰富的病理学家选择代表性感兴趣区域。以 20 倍分辨率捕获多个视野作为多光谱图像。这些图像中的细胞识别是通过 Qupath 软件中的监督机器学习算法实现的。两位经验丰富的病理学家针对每个病例精心优化和验证了染色阈值和表型算法的准确性。

6.流式细胞术

使用 CD66b 微珠（130-104-913，MACS）从新鲜血液中分离中性粒细胞。然后用制造商推荐浓度的相应抗体对分离的细胞进行染色，温度为 4 °C，染色 45 分钟，然后用 PBS 清洗。使用 CD66b-APC（ab275586，Abcam）和 CXCR1-Alexa Fluor 700（FAB330N，R&D Systems）进行染色以标记靶细胞。对于小鼠模型，使用 Ly6g 微珠（130-120-337，Miltenyi）从肿瘤中分离中性粒细胞。然后用制造商推荐浓度的相应抗体对分离的细胞进行染色，温度为 4 °C，染色 45 分钟，然后用 PBS 清洗。使用 Ly6g-Alexa Fluor 647（127610，Biolegend）和 CXCR1-PE（566383，BD Pharmingen）进行染色以标记靶细胞。

7.单细胞测序

手术切除后 3 小时，使用 Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v3（10X Genomics）进行分析。使用 CellRanger 3.1.0 为每个样本生成原始基因表达矩阵，然后以 GRCh38 为参考在 R 4.3.1 中映射，并使用 Seurat（V4.0）转换为 Seurat 对象。使用 PercentageFeatureSet(object, pattern = “^MT-”) 函数评估线粒体基因百分比，并排除线粒体基因百分比超过 20% 的细胞。在排除黑名单中的基因后，使用 FindVariableFeatures 编制了一份具有高度可变基因（HVG）的前 3000 个基因列表。进行 Harmony以整合所有细胞（V0.1.0）。然后进行聚类分析，并使用标记基因注释细胞组。

8.细胞状态的轨迹推断

使用 Monocle2 (V2.14) 推断中性粒细胞的细胞谱系轨迹，其中标记基因的 q 值 < 0.001 由differentialGeneTest 函数计算得出。Monocle 用于推断细胞排序后的分化轨迹

9.单细胞代谢定量

为了确定中性粒细胞中的主要代谢途径，我们使用 scMetabolism 程序量化了主要代谢亚型。所有其他参数均设置为默认值。

10.细胞间相互作用分析

我们利用 Cellchat 推断不同细胞类型之间的细胞间相互作用。该方法通过分析基因表达估计这些细胞亚群之间潜在的相互作用信号，并使用置换检验确定显著性。基于置换检验，从两个细胞亚群中提取出 P 值 0.01 的显著配体-受体对。

11.细胞培养

H1975 和 PC-9 细胞系来自上海科学院（上海，中国）。H1975_OR 和 PC_9OR 细胞由我们实验室构建。这些细胞用 RPMI 1640 培养基（Gibco，美国）培养。在完全培养基（Gibco，美国）中，使用 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。通过负选择磁珠（70907，BEAVER）从 BALB/C-Nude 小鼠的肿瘤样本中收获中性粒细胞。CXCR1-PE（566383，BD Pharmingen）首先与 PE 标记磁珠（130-048-801，Miltenyi）结合并孵育，然后利用该复合物进行中性粒细胞分选，从而促进 CXCR1+ 和 CXCR1- 中性粒细胞群的分离。所有细胞均在含有 5% 二氧化碳的环境中维持在 37°C 下。

12. 酶联免疫吸附测定（ELISA）

收集中性粒细胞培养基，在 4 °C 下以 1000 × g 离心 10 分钟。然后去除细胞以获得上清液。向每个孔中加入 300 μL 1x 洗涤缓冲液，静置 40 秒，然后弃去液体。我们重复此洗涤三次。向空白孔中加入 100 μL 标准/样品稀释缓冲液，向其他孔中加入 100 μL 标准或样品。将板密封并在 37 °C 下孵育 2 小时。使用前 15 分钟制备生物素化抗体工作溶液（100×）。孵育后，弃去液体，洗涤孔，加入 100 μL 抗体溶液，密封并在 37 °C 下孵育 1 小时。我们在使用前 15 分钟制备链霉亲和素-HRP（100×）。弃去液体，再次洗涤，加入100 μL链霉亲和素-HRP，密封，37 ℃ 孵育30 min。预热酶标仪。弃去液体，洗涤，加入100 μL TMB 底物，37 ℃ 避光孵育15～20 min。加入50 μL 终止液，5 min 内测定。

13.免疫印迹

使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的 RIPA 缓冲液 (Epizyme) 裂解细胞样品。使用二辛可宁酸 (BCA) 蛋白质测定试剂盒 (Epizyme) 测定蛋白质浓度。将细胞裂解物 (15-30 g) 应用于含有 0.1% 十二烷基硫酸钠 (SDS) 的聚丙烯酰胺凝胶，然后转移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜 (Epizyme)。在室温下用封闭液 (Epizyme) 封闭 30 分钟后，将膜在 4 °C 下与在商业抗体稀释剂 (Epizyme) 中稀释的抗体一起孵育过夜。使用以下一抗：GAPDH 兔 mAb (A19056, ABclonal)、波形蛋白兔 mAb (A19607, ABclonal)、E-钙粘蛋白兔 mAb (A22333, ABclonal)、NF-kB p65/RelA 兔 mAb (A19653, ABclonal)、磷酸化-NF-κB p65/RelAS536 兔 mAb (AP1294, ABclonal)。

14.细胞活力测定

前一天将细胞一式三份接种到 96 孔板中，然后用不同浓度的奥希替尼处理另外 72 小时。处理期结束后，使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8, Beyotime) 试剂对细胞进行染色，并在孵育一小时后使用 Varioskan Flash (450 nm, Thermo) 进行分析。减去空白对照荧光后，我们对荧光信号进行归一化以得出生长率。

15.动物模型

这项研究使用来自 SLAC LABORATORY（上海，中国）的五周龄雄性裸鼠。这些小鼠接受皮下注射 5 × 10^6 个细胞，并进行监测，直到肿瘤变得可见。在 H1975_OR 和 PC-9_OR 异种移植模型中，一旦肿瘤体积达到 200 mm3，就根据实验设计用 PBS、奥希替尼（2.5 mg/kg 体重，每日通过口服管饲法给药）和/或瑞帕利辛（25 mg/kg 体重，每两天腹膜内给药）对小鼠（每组 n = 4）进行治疗。

16.使用DAOSLIMIT对肿瘤进行活体成像

为了研究活体小鼠中的 CXCR1+ 中性粒细胞，我们利用清华大学（北京，中国）开发的光学仪器 DAOSLIMIT 进行了长达一小时的活体成像。按照图中所示的医学建模方案准备小鼠，然后进行 DAOSLIMIT 成像。通过肿瘤血管将 WGA（5 μg，W11261，Thermo Fisher）、Ly6G（3 μg，127610，BioLegend）、CXCR1（3 μg，566383，BD Pharmingen）和磷酸盐缓冲盐水（PBS，60 μL）注入小鼠体内。在整个 DAOSLIMIT 成像过程中，使用 37 °C 体温控制装置来维持小鼠的生理状态。在数据收集方面，我们使用 sLFdriver 软件从随机选择的肿瘤区域捕获 DAOSLIMIT 数据，然后使用我们定制的 MATLAB 工具进行分析和可视化。

图1.研究设计和患者的临床结果。a 患者入组、样本采集和多组学分析流程图（图形模型图使用 Figdraw 创建）。b 纳入患者的客观缓解率、无进展生存期和总生存期。FFPE，福尔马林固定石蜡包埋；PR，部分缓解；SD，病情稳定；PFS，无进展生存期；OS，总生存期

.统计学分析

临床病理特征以数字和百分比形式总结。必要时，使用卡方检验或 Fisher 精确检验比较分类变量。Mann-Whitney U 检验分析连续变量。PFS 被定义为从开始 SH1028 治疗到全身进展（包括颅内进展）或死亡（以先发生者为准）的时间跨度，测量值在最后一次肿瘤评估日期截尾。OS 被确定为从开始 SH-1028 治疗到因任何原因死亡的日期或最后一次随访日期（以较早者为准）的持续时间。使用 Kaplan-Meier 曲线分析结果差异，并辅以双侧对数秩检验进行统计评估。所有统计分析均使用 R（v4.2.3）和 Qupath（v5.0）进行。双侧 P 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。

结果

1.纳入患者的基线特征

本研究首先纳入了 25 名接受 II 期临床试验（NCT03823807，图 1a）的 EGFR T790M 突变 NSCLC 患者。中位年龄为 64 岁，范围从 43 岁到 78 岁。其中大多数（60%）为男性，68% 被确定为当前或曾经吸烟者。所有患者均经病理证实为腺癌，其中绝大多数（84%）为 IV 期疾病。只有一名患者完全具有 EGFR T790M 突变，而其余患者具有其他 EGFR 亚型突变，主要是 EGFR 外显子 19 缺失（52%）。在一些病例中观察到转移的存在，其中脑（n = 7）或骨（n = 8）是最常见的部位（补充表 1）。总体 ORR 为 76%（图 1b）。在 41.9 个月的随访期内，中位 PFS 和 OS 分别为 8.4 个月和 27.9 个月（图 1b）。

2．耐药样本具有免疫抑制微环境和更高的中性粒细胞浸润

为了阐明耐药后肿瘤免疫微环境特征的动态变化，我们首先对可用的高质量样本进行了批量 RNA 测序。经过严格的质量控制和选择，确定了 17 个治疗前样本和 19 个治疗后样本（17 个为配对样本，其基线特征列于补充表 1 中）。在耐药样本中，观察到 856 个基因显著上调，53 个基因下调。在这些差异表达基因 (DEG) 中，总共发现了 208 个免疫相关基因（图 2a）。其中 12 个基因表达增加，其中关键的是 CXCR1、CXCR2 和 CSF3，它们在中性粒细胞的功能和生命周期中起着至关重要的作用（图 2b）。为了揭开生物通路改变的神秘面纱，我们根据基因本体论 (GO) 和京都基因和基因组百科全书 (KEGG) 进行了富集分析。这些 DEG 显著地表现出诸如细菌防御反应、质膜介导的细胞间粘附、髓系白细胞活化和体液免疫反应等功能（补充图 1a）。KEGG 通路分析表明，在耐药性过程中，几种通路上调，包括神经活性配体-受体相互作用、JAK-STAT 信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用以及补体和凝血级联等。然而，只有少数通路被发现富含下调的基因（补充图 1b）。此外，基因集富集分析（GSEA）还显示了与肿瘤进展和 EGFR-TKI 耐药性相关的几个标志性基因集的上调，包括上皮-间质转化、血管生成、缺氧和通过 NF-κB 的 TNF-α 信号传导。同时，我们观察到干扰素α反应的下调，共同描绘出一幅免疫抑制微环境的图景（图2c）。

使用 CIBERSORT，我们检查了预处理和耐药样本之间的免疫浸润差异。22 种免疫细胞类型的比例差异很大（图 2d、e）。值得注意的是，我们观察到耐药样本中的中性粒细胞浸润显著增加（P = 0.004），同时静息 CD4 记忆 T 细胞浸润显著减少（P < 0.001；图 2f 和补充图 2）。这些结果通过使用 Xcell 得到证实，确认了耐药样本中中性粒细胞浸润的增加（P = 0.048；补充图 3a）。

为了验证耐药样本中中性粒细胞浸润增加，我们进行了苏木精和伊红 (HE) 染色，以选择高质量样本进行 mIF 染色（图 2g）。其中 10 个既有充分预处理又有耐药组织的样本被确定为适合进行 mIF 分析。与预处理样本相比，耐药样本中的中性粒细胞 (P < 0.01) 和 CXCR1 表达细胞 (P < 0.05) 显著增加。在耐药样本中还检测到 PD-L1 表达水平显著增加（P < 0.05），进一步表明耐药肿瘤中出现了免疫抑制肿瘤微环境（图 2h）。

图2 治疗前和耐药后配对肿瘤样本的转录组学和多重免疫荧光分析。a 火山图显示细胞因子的表达谱。b 差异表达细胞因子的蛋白质相互作用图。c 使用标志基因集进行 GSEA 富集分析。d 治疗前和耐药样本之间 22 种免疫细胞浸润丰度的比例比较。e 治疗前和耐药样本中 22 种免疫细胞的热图。f 治疗前和耐药样本之间 22 种免疫细胞浸润丰度的比较。g 治疗前和耐药样本之间 CD66b+、CD8+、PD-1+、PD-L1+、CXCR1+ 和 PanCK+ 细胞的多色免疫荧光染色。h 治疗前和耐药样本之间 CD66b、CD8、PD-1、PD-L1、CXCR1 和 PanCK 表达的配对比较。ns，P > 0.05；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001 CXCR1+ 中性粒细胞浸润。

3. scRNA 测序分析显示 CXCR1+ 中性粒细胞在耐药样本中富集

为了进一步研究中性粒细胞浸润在介导对 EGFR-TKI 的反应或耐药中的作用，我们对现实世界队列中 22 名接受第三代 EGFR-TKI 治疗的 EGFR 突变 NSCLC 患者的 34 个样本（22 个治疗前和 12 个耐药）进行了 scRNA 测序。补充表 2 提供了基线参数。经过质量控制，分析了 141,292 个细胞。无监督聚类根据典型标记基因确定了 10 个不同的细胞簇（图 3a），包括 B 细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、上皮细胞、内皮细胞、T 细胞、纤毛细胞、基质细胞、中性粒细胞和肥大细胞（图 3b）。我们首先比较了治疗前和耐药样本中每种细胞类型的细胞组成。耐药样本中中性粒细胞 (P < 0.01)、单核细胞 (P < 0.01) 和自然杀伤细胞 (P < 0.001) 的比例显著增加 (图 3c)。进一步分析中性粒细胞异质性涉及对 2,338 个中性粒细胞进行降维和聚类，根据差异基因表达确定三个亚簇 (CD52+、S100A12+ 和 CXCR1+) (图 3d、e)。值得注意的是，与治疗前样本相比，耐药样本中 CXCR1+ 中性粒细胞的比例显著增加 (P < 0.01)，而 CD52+ 中性粒细胞的比例显著减少 (P < 0.05) (图 3f、g)。流式细胞术证实耐药样本中 CXCR1+ 中性粒细胞显著增加（P < 0.001；图 3h 和补充图 4）。伪时间分析描绘了这些亚群的分化轨迹（图 3i），伪时间排序表明 CD52+ 中性粒细胞开始分化并随后向 S100A12+ 和 CXCR1+ 亚型分化（图 3j 和补充图 5）。

图 3 单细胞分析揭示治疗前和耐药样品中的中性粒细胞图谱。a 所有细胞类型的 UMAP 图。b 标记基因用于注释这些细胞组。c 治疗前和耐药中每种细胞的比例。d 中性粒细胞的 UMAP 图。e 高表达基因用于划分三个中性粒细胞亚群。f 治疗前和耐药中中性粒细胞的 UMAP 图。g 治疗前和耐药中每个亚群的比例。h 治疗前和耐药中 CXCR1+ 中性粒细胞变化的流式细胞术图。i 来自 Monocle 的中性粒细胞无监督转录轨迹。j 基于转录轨迹的伪时间标记基因的表达。ns，P > 0.05；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001 CXCR1+ 中性粒细胞浸润。

4.阐明 CXCR1+ 中性粒细胞在 EGFRTKI 耐药中的作用

为了研究 CXCR1+ 中性粒细胞在 EGFR-TKI 耐药性中的作用，我们比较了不同中性粒细胞亚群的细胞因子谱（补充图 6a）。CD52+ 中性粒细胞表现出高 CCL5 表达，已知 CCL5 可以募集 T 细胞。相反，CXCR1+ 中性粒细胞表现出高水平的 PD-L1（CD274），表明具有免疫抑制作用。独特的是，只有 CD52+ 中性粒细胞表现出 MHC II 类分子的富集，例如 HLA-DQB1 和 HLA-DRA，而 CXCR1+ 和 S100A12+ 亚群主要表达 MHC I 类分子，包括 HLA-B 和 HLA-C（补充图 6b）。为了了解通路活性在肿瘤相关中性粒细胞亚群之间的差异，我们分析了通路变异，发现在 CXCR1+ 中性粒细胞中，正向调节免疫细胞功能（如 T 细胞增殖、迁移和活化）的通路显著下调（图 4a）。相反，与中性粒细胞活化、迁移和趋化性相关的通路上调（图 4a）。关键信号通路（如 NF-κB 和 JAK-STAT）在 CXCR1+ 中性粒细胞中也上调（图 4b），这通过 KEGG 分析得到证实（补充图 6c）。此外，在 CXCR1+ 中性粒细胞中，中性粒细胞胞外陷阱形成（补充图 6c）增加，而中性粒细胞胞外陷阱形成可促进肿瘤增殖和转移。标志性基因集的基因集变异分析 (GSVA) 揭示了三个亚群之间存在不同的通路谱，CXCR1+ 中性粒细胞表现出与缺氧、MTORC1、IL-2 和 IL-6 信号传导相关的特征。中性粒细胞亚群中的代谢途径活性也被量化（图 4c），显示在 CXCR1+ 中性粒细胞中酪氨酸、苯丙氨酸代谢和精氨酸生物合成显著富集。同时，CD52+ 中性粒细胞主要激活花生四烯酸代谢、谷胱甘肽代谢和色氨酸代谢，而戊糖磷酸途径和脂肪酸生物合成和降解在 S100A12+ 中性粒细胞中占主导地位（图 4c）。

考虑到耐药样本中 CXCR1+ 中性粒细胞显著增加，我们随后进行了 CellChat 分析，以阐明 CXCR1+ 中性粒细胞在肿瘤微环境中的作用。鉴于上皮细胞和 T 细胞之间的异质性，这些组被进一步细分和注释。使用 CopyKAT 算法将上皮细胞分为正常上皮细胞 (Normal-EP) 和肿瘤细胞 (补充图 7a、b)，T 细胞根据基因标记分为 CD8、CD4 和 Treg (补充图 7c、d)。CellChat 分析揭示了各种细胞类型之间的显著通信 (图 4d 和补充图 8)，特别注意到 CXCR1+ 中性粒细胞在传出和传入信号中都表现出较高的相互作用强度 (图 4e)。配体受体对分析显示，CXCR1+ 中性粒细胞与肿瘤细胞之间存在涉及 TGFA-EGFR 和 EGF-EGFR 的相互作用，这可能解释了由于 EGFR 持续激活而导致对第三代 EGFR-TKI 产生耐药性的原因（图 4f）。此外，耐药样本中的细胞相互作用强度更高（补充图 9a），通讯模式显示出不同程度的调节（补充图 9b）。耐药后，无论信号方向如何，CXCR1+ 中性粒细胞与肿瘤细胞的通讯都更有效 (补充图 9c)。此外，与治疗前样品相比，CXCR1+ 中性粒细胞在细胞通讯中的作用在耐药样品中变得更加明显 (补充图 9d、e)。分析了 CellChat 中富集的所有通路，发现在产生耐药性后，细胞通讯通路发生了显著变化，包括 EGF、IL-2 和 VISTA 在内的通路显著激活 (补充图 10)。此外，在耐药性中，CXCR1+ 中性粒细胞和肿瘤细胞之间与 EGFR 相关的配体-受体对显著增加，与 Treg 细胞的通讯也增加 (补充图 11)。最后，我们绘制了中性粒细胞分布密度图及其与肿瘤区域的空间接近度。结果显示，治疗前中性粒细胞主要包围肿瘤区域，但在耐药样本中浸润到肿瘤核心。CXCR1+中性粒细胞与肿瘤细胞的平均距离从治疗前样本的33μm显著减小到耐药样本的19μm（图4g）。

图 4 CXCR1+中性粒细胞具有免疫抑制特性，在肿瘤微环境中发挥重要作用。a CXCR1+中性粒细胞的下调和上调途径。b 使用 GSVA 绘制的标志基因集热图。c 通过 scMetabolism 确定的中性粒细胞亚群代谢途径活性。d 通过 CellChat 分析检测到的细胞通讯。e 每种细胞类型的传出和传入相互作用强度。f CXCR1+中性粒细胞与肿瘤细胞之间的配体-受体对。g 预处理和耐药样本之间 CXCR1+中性粒细胞的空间分析 CXCR1+中性粒细胞浸润。

5. 早期疾病进展组显示CXCR1+ 中性粒细胞浸润较高的免疫抑制微环境

使用中位 PFS 作为截止值，我们将 19 名具有高质量样本的患者分为两组，即“长期受益”组和“早期疾病进展”组。在长期受益组中，我们检测到 653 个基因的上调和 431 个基因的下调。在这些 DEG 中，与早期疾病进展相比，长期受益组中的 CXCR1 显着下调（P = 0.045；图 5a）。STRING 分析表明 CXCR1 与其他差异基因表达的蛋白质之间存在紧密的相互作用（图 5b），暗示 CXCR1 可能在较差的治疗结果中发挥作用。GO 分析显示，在长期受益组中，信号受体激活剂活性、细胞外基质结构成分、生长因子活性和含胶原的细胞外基质均富集（补充图 12a）。KEGG 通路分析显示，长期获益组中细胞因子-细胞因子受体相互作用上调，趋化因子信号通路、造血细胞谱系等下调（补充图 12b）。与早期疾病进展组相比，标志基因集的 GSEA 显示，长期获益组中 p53 通路和干扰素反应上调，表明肿瘤内免疫被激活。相反，早期进展组中通过 NF-κB 和上皮-间质转化通路的 TNFα 信号传导上调，此前有报道称这与 EGFR-TKI 耐药有关（图 5c）。

接下来，我们比较了长期受益组和早期进展组之间免疫细胞浸润丰度的差异（图 5d、e）。CIBERSORT 分析显示，早期进展组样本的中性粒细胞浸润水平显著高于长期受益组（P = 0.029），而其他免疫细胞浸润丰度相似（图 5f 和补充图 13）。Xcell 分析证实了这一发现，证实早期进展组的中性粒细胞浸润更高（P = 0.037；补充图 3b）。mIF 分析显示，早期进展组样本的中性粒细胞计数（P < 0.05）和 CXCR1 表达细胞（P < 0.05）明显高于长期受益组。两组之间的 PD-L1、PD-1 和 CD8 表达水平相当（图 5g、h）。单细胞分析证实早期进展组 CXCR1+ 中性粒细胞增加 (P < 0.01)，而 CD52+ 和 S100A12+ 亚组无差异 (图 5i、j)。

6.CXCR1+ 中性粒细胞通过 TNF-α/NF-κB 介导对第三代 EGFR TKI 的耐药性

图 5 长期获益组与早期进展组样本的转录组和多重免疫荧光分析。a 火山图显示细胞因子的表达谱。b 差异表达细胞因子的蛋白质相互作用图。c 使用 Hallmarker 基因集进行 GSEA 富集分析。d 长期获益组与早期进展组 22 种免疫细胞浸润丰度比例比较。e 长期获益组与早期进展组 22 种免疫细胞热图。f 长期获益组与早期进展组 22 种免疫细胞浸润丰度比较。g 长期获益组与早期进展组 CD66b+、CD8+、PD1+、PD-L1+、CXCR1+ 和 PanCK+ 细胞多色免疫荧光染色。h 长期获益组与早期进展组 CD66b、CD8、PD-1、PD-L1、CXCR1 和 PanCK 表达比较。i 长期获益组与早期进展组中性粒细胞的 umap 图。j 长期受益组与早期进展组之间各亚组的比例。ns，P > 0.05；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001 CXCR1+中性粒细胞浸润。

6. CXCR1+ 中性粒细胞通过 TNF-α/NF-κB 介导对第三代 EGFR TKI 的耐药性

整合先前的多组学数据表明，CXCR1+ 中性粒细胞可能通过 TNF-α/NF-κB 信号通路导致对第三代 EGFR-TKI 的响应较差（图 2c、4a、b 和 5c）。为了验证这一点，我们使用两种众所周知的 EGFR 突变细胞系（H1975 和 PC-9）及其奥希替尼耐药细胞系（H1975_OR 和 PC-9_OR）进行了体外和体内实验。这四种细胞系在我们之前的研究中被广泛使用。体外实验表明，CXCR1+中性粒细胞与H1975或PC-9共培养显著降低了对奥希替尼的敏感性（IC50：0.017 vs. 1.064 μM，P < 0.05；0.012 vs. 1.491 μM，P < 0.05；图6a，b）。在共培养系统中添加瑞帕利辛（CXCR1和CXCR2的非竞争性变构阻断剂）显著逆转了耐药表型（图6a，b）。随后，我们利用H1975_OR和PC-9_OR细胞系建立EGFR突变型NSCLC异种移植。结果显示，奥希替尼或瑞帕利辛单药治疗不能显著减少肿瘤生长，但奥希替尼联合瑞帕利辛可以显著抑制肿瘤生长，且不影响体重（图 6c、d、e、f 和补充图 14）。流式细胞术和 DAOSLIMIT 对肿瘤的活体成像显示，瑞帕利辛显著降低 CXCR1+ 中性粒细胞的肿瘤内浸润（图 6g、h、i 和补充图 15），无论是否与奥希替尼联合使用。采用活体成像技术监测活体肿瘤内 CXCR1+ 中性粒细胞的动态，揭示出大量穿过肿瘤血管的浸润，而瑞帕利辛可有效减少这种浸润（补充视频 1 和 2）。

为了检测治疗前后TNF-α/NF-κB信号通路的变化，我们首先用ELISA法测定了不同治疗组上清液中的细胞因子水平。观察到CXCR1+中性粒细胞分泌TNF-α增加，而瑞帕利辛显著抑制了这一分泌（P<0.01；图7a）。共培养后肿瘤细胞的大量RNA测序显示基因表达谱发生了显著变化（图7b）。NF-κB信号通路相关关键基因的热图分析显示，与CXCR1+中性粒细胞共培养的肿瘤细胞表现出与耐药组相似的基因表达模式，经瑞帕利辛治疗后恢复为未加工状态（图7c）。差异基因通路富集分析显示，与CXCR1+中性粒细胞共培养的肿瘤细胞中NF-κB和EMT通路显著上调，而瑞帕利辛治疗组该通路显著下调（图7d）。GSEA进一步证实瑞帕利辛能有效抑制CXCR1+中性粒细胞诱导的NFκB通路激活（图7e）。Western印迹分析也显示，与CXCR1+中性粒细胞共培养的肿瘤细胞中磷酸化的NF-κB和Vimentin表达增加，E-cadherin表达降低，加入瑞帕利辛后上述变化逆转（图7f，g）。EGFR突变NSCLC异种移植瘤的RNA-seq分析也显示治疗前后TNF-α/NF-κB信号通路和EMT相关标志物的变化相似（补充图16）。

图 6 CXCR1+ 中性粒细胞介导对第三代 EGFR TKI 的耐药性。a 相对生存曲线描述用所示浓度的奥希替尼处理的所示 H1975 的生存能力。b 相对生存曲线描述用所示浓度的奥希替尼处理的所示 PC-9 的生存能力。c 奥希替尼治疗或与瑞帕利辛联合治疗后来自 H1975_OR 的异种移植肿瘤的生长曲线。d 奥希替尼治疗或与瑞帕利辛联合治疗后来自 PC-9_OR 的异种移植肿瘤的生长曲线。e H1975_OR 小鼠模型实验过程中的体重变化。f PC-9_OR 小鼠模型实验过程中的体重变化。g H1975_OR 小鼠模型中 CXCR1+ 中性粒细胞比例的流式细胞术。h PC-9_OR 小鼠模型中 CXCR1+ 中性粒细胞比例的流式细胞术。i 表示 DAOSLIMIT 在 H1975_OR 和 PC-9_OR 小鼠模型中使用 CXCR1+ 中性粒细胞进行的活体肿瘤成像图像。OR，奥希替尼耐药性

图7 CXCR1+中性粒细胞分泌TNF-α激活肿瘤细胞NF-κB及EMT通路。a CXCR1+和CXCR1-中性粒细胞上清液中TNF-α水平。b PCA分析。c NF-κB相关关键基因表达热图分析。d 不同表达基因GO分析。e NF-κB信号通路GSEA富集分析。f H1975和H1975_OR组P-NF-κB、NF-κB、E-Cadherin、Vimentin、GAPDH蛋白表达的代表性Western印迹图。g PC-9和PC-9_OR组P-NF-κB、NF-κB、E-Cadherin、Vimentin、GAPDH蛋白表达的代表性Western印迹图。GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；OR，奥希替尼耐药性 CXCR1+ 中性粒细胞浸润。

7. 基线 CXCR1+ 中性粒细胞浸润水平与接受第三代 EGFR-TKI 治疗的患者的临床结果相关

为了评估中性粒细胞浸润是否能预测第三代 EGFR-TKI 的反应，我们将患者分为高危组（治疗前肿瘤样本 CXCR1+ 中性粒细胞浸润水平中位数≥）和低危组（治疗前肿瘤样本浸润水平中位数< ）。以治疗前样本中 CXCR1+ 中性粒细胞浸润水平中位数为截止值。低危组的 ORR 优于高危组（90% vs. 67%；P = 0.303；图 8a），但由于样本量非常有限，差异不具有统计学意义。低危组的中位 PFS 显著延长（中位 PFS：11.8 vs. 7.5 个月；P = 0.019；图 8b）。此外，与高危组相比，低危组患者的OS明显更好（中位OS：33.0 vs. 23.5个月；P = 0.029；图8b）。结合临床病理特征的多变量分析显示，基线CXCR1+中性粒细胞浸润水平与接受第三代EGFR-TKI治疗的晚期EGFR突变NSCLC的临床结果独立相关（补充图17和补充图18）。

图 8 基线 CXCR1+ 中性粒细胞浸润水平高与低患者的治疗结果比较。a 基线 CXCR1+ 中性粒细胞浸润水平高（高风险）与低（低风险）患者的客观缓解率比较。b 高风险组与低风险组患者的无进展生存期（左）与总生存期（右）比较。c 研究的图形摘要（图形摘要由 Figdraw 创建）。PR，部分缓解；SD，病情稳定；PFS，无进展生存期；OS，总生存期

讨论

EGFR激活突变被确定为可操作的驱动致癌基因，彻底改变了晚期NSCLC的治疗，建立了以生物标志物为主导的治疗模式。目前，第三代EGFR-TKI已成为常见EGFR突变患者一线治疗和获得性EGFR T790M突变患者二线及以上治疗的标准治疗。尽管第三代EGFR-TKI疗效显著，但并非所有药物都能获益，耐药性仍然是一个关键的基本挑战。许多研究已经阐明了耐药的潜在机制，包括靶标激酶的改变、通过上调下游蛋白激活信号通路和表型转化等。然而，其中近三分之一的耐药机制尚不明确。考虑到肿瘤免疫微环境的特征和成分在肿瘤增殖、转移和耐药性发展中的关键作用， 研究肿瘤免疫微环境的特征和成分与第三代 EGFR-TKI 在 EGFR 突变 NSCLC 患者中的疗效之间的关系具有很有价值的意义。

在本研究中，我们收集了来自 II 期临床试验的 25 名接受第三代 EGFR-TKI 治疗的 EGFR T790M 突变 NSCLC 患者的 50 份配对治疗前和耐药后肿瘤组织样本，以及来自现实世界队列的 22 名接受第三代 EGFR-TKI 治疗的 EGFR 突变 NSCLC 患者的 34 份样本（22 份治疗前和 12 份耐药样本）。我们进行多组学分析以剖析基线和对第三代 EGFR-TKI 治疗耐药后的肿瘤免疫微环境特征。与治疗前样本相比，我们首先观察到 CXCR1 和 CXCR2 的表达水平在耐药样本中显著增加，这些基因由各种免疫和非免疫细胞表达，包括中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞。

然后，我们分析了批量 RNA-seq 和 mIF 数据，发现耐药样本中中性粒细胞浸润明显增多。scRNA 测序进一步发现，耐药样本中 CXCR1+ 中性粒细胞显著增加，代表中性粒细胞分化的一个终点。与 CD52+ 和 S100A12+ 中性粒细胞相比，CXCR1+ 中性粒细胞表现出独特的特征，包括更高的 PD-L1 表达和更高的迁移、趋化性和活化性。此外，我们观察到负向调节各种免疫细胞（例如 T 细胞、巨噬细胞）的通路被激活。细胞通讯分析表明 CXCR1+ 中性粒细胞与各种细胞之间存在很强的通讯，特别是在耐药后与肿瘤细胞和 Treg 的通讯增强。值得注意的是，我们在 CXCR1+ 中性粒细胞和肿瘤细胞中发现了 EGFR 相关的配体受体对，这些对在耐药样本中进一步增强，可能通过持续的 EGFR 激活导致 EGFR-TKI 耐药。空间分析进一步表明，CXCR1+ 中性粒细胞与肿瘤细胞的平均距离从 33 微米显著缩短至 19 微米，并且耐药样本中 CXCR1+ 中性粒细胞增多，主要浸润到肿瘤核心。根据这种空间结构，Katey 等人发现中性粒细胞区分了一种与肿瘤进展相关的独特微环境。总体而言，这些结果表明，在对第三代 EGFR-TKI 产生耐药性后，CXCR1+中性粒细胞不仅数量增加，而且能够更深地渗透到肿瘤核心区域，从而促进免疫抑制性肿瘤免疫微环境的建立。

中性粒细胞作为抵抗微生物感染的第一道防线，具有协调适应性免疫反应和慢性炎症的能力。肿瘤相关中性粒细胞通过分泌各种生长因子、细胞因子和基质降解酶在肿瘤血管生成、侵袭和转移中发挥重要作用。然而，中性粒细胞也可以通过直接杀死肿瘤细胞或与其他免疫成分相互作用来启动抗肿瘤反应。中性粒细胞在肿瘤微环境中的双重功能表明它们具有异质性和对环境线索的反应可塑性。在我们之前的研究中，我们观察到奥希替尼可以显著增加 EGFR 突变肺癌小鼠模型的支气管肺泡灌洗液和肺组织中的中性粒细胞计数。Fang 等报道，神经丝重链（NEFH）突变与中性粒细胞浸润减少有关，在 TKI 治疗反应样本中富集。最近的一项研究表明，EGFR 突变肺癌中持久的奥希替尼反应需要适应性免疫，中性粒细胞含量显着降低，肿瘤内 T 细胞含量增加。这些发现共同强调了中性粒细胞在 EGFR-TKI 反应或耐药中的重要性。为了验证 CXCR1+ 中性粒细胞介导对第三代 EGFR-TKI 耐药的作用并揭示详细机制，我们使用两种众所周知的 EGFR 突变细胞系进行了体外和体内实验。结果表明，CXCR1+ 中性粒细胞可显着降低奥希替尼敏感性。RNA-seq和Western blot分析显示，TNF-α/NFκB信号通路和EMT相关标志物的表达在耐药组和与CXCR1+中性粒细胞共培养组中显著上调。这些影响可以被瑞帕利辛中和。这些结果共同表明CXCR1+中性粒细胞可能通过TNF-α/NF-κB信号通路导致对第三代EGFR-TKI的耐药（图8c）。

注意到CXCR1+中性粒细胞浸润在第三代EGFR-TKI耐药中的重要作用后，我们评估了中性粒细胞浸润丰度的预测价值。我们首先以中位PFS为界，将患者分为长期受益组和早期疾病进展组。我们发现早期疾病进展组患者的中性粒细胞浸润显著高于长期受益组。然后我们以治疗前样本中位CXCR1+中性粒细胞浸润水平为界，将患者分为高危组和低危组。结果显示，低危组患者的ORR在数值上高于高危组患者，PFS和OS显著延长。这些研究结果表明，基线中性粒细胞浸润水平与第三代EGFR-TKI对EGFR突变NSCLC患者的疗效相关，可以被视为一个潜在的预测生物标志物。

本研究有几个需要注意的局限性。首先，样本量小和回顾性可能会引入潜在偏差，包括选择偏差。因此，应谨慎解释结果，并有必要通过大规模前瞻性研究进一步验证。其次，鉴于中性粒细胞的寿命较短，其在 scRNA 测序中的比例相对较低，这对全面分析所有中性粒细胞亚群构成了挑战。第三，虽然体内和体外实验表明瑞帕利辛与第三代 EGFR-TKI 联合使用可有效逆转耐药表型，但这一发现在应用于临床之前值得仔细考虑。未来的研究应更深入地探讨 CXCR1+ 中性粒细胞浸润和耐药的潜在机制，并探索操纵中性粒细胞浸润及其相关分子机制的潜在治疗策略。

综上所述，本研究结果表明，治疗前肿瘤组织中 CXCR1+ 中性粒细胞浸润与第三代 EGFR-TKI 疗效相关，而治疗后肿瘤组织中 CXCR1+ 中性粒细胞浸润增加在介导 EGFR 突变 NSCLC 患者对第三代 EGFR-TKI 的耐药性方面发挥了作用，凸显了肿瘤微环境中 CXCR1+ 中性粒细胞的临床意义。我们的研究结果可能有助于识别更有可能从第三代 EGFR-TKI 治疗中受益的患者。

翻译及审校：陈宇韬

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