β-榄香烯通过靶向 GPX4 通路和诱导铁死亡来有效调节 GC 中的放疗耐药

发表杂志：Frontiers in Pharmacology

影响因子：IF=4.4

发表时间：2024.10.17

简介：β-Elemene 来源于姜黄 （Wenyujin），临床上认可可诱导细胞凋亡、抑制细胞周期进程和逆转各种癌症的化疗耐药性。然而，其对放射抗性胃癌 （GC） 的影响仍不清楚。

方法：在本研究中，通过多种低剂量辐射建立了抗放射线 GC 细胞系 （MKN45/IR 和 AGS/IR）。使用 CCK-8 和克隆形成测定评估 β-榄香烯对放射敏感性的影响，并测量铁死亡标志物如 ROS 、 MDA 和 Fe2+ 水平。此外，通过 qRT-PCR、Western blot、免疫荧光、免疫共沉淀和体内研究检测 β-榄香烯对 GPX4 的影响及其与 OTUB1 的相互作用。

结果：我们的研究结果表明，β-榄香烯与放疗联合时可逆转 GC 细胞的放射抗性并显着抑制细胞生长。β-Elemene 治疗提高了 ROS 、 MDA 和 Fe2+ 水平，增强了铁死亡，Ferrostatin-1 和去铁胺抑制研究证实了这一点。机制分析显示，β-榄香烯破坏 OTUB1-GPX4 相互作用，导致 GPX4 泛素化和降解增加，从而促进铁死亡。体内研究进一步表明，与单独放疗相比，β-榄香烯联合放疗显着抑制了肿瘤生长。

讨论：这些结果表明，β-榄香烯通过靶向 GPX4 通路和诱导铁死亡来有效调节 GC 中的放射抗性。这突出了它作为耐药性 GC 病例放疗辅助治疗的潜力。

胃癌 （GC） 是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，全球发病率排名第五，癌症相关死亡率排名第三（Ding 等人，2023 年;Qu et al.， 2023）。尽管诊断和治疗取得了进展，但晚期 GC 患者的预后仍然很差（Smyth 等人，2020 年）。放疗是 GC 治疗的基石，可诱导各种形式的 DNA 损伤;然而，其有效性经常受到辐射耐药性发展的阻碍（Meng 和 Lu，2024 年;Varghese et al.， 2024）。因此，克服这种抵抗力以提高放射治疗效果已成为研究的中心重点。

新出现的证据表明，铁死亡是一种以脂质过氧化为特征的铁依赖性细胞死亡形式，可以抑制对常规疗法耐药的恶性肿瘤的生长（Wang et al.， 2023;He et al.， 2023;Luo等人，2023 年）。例如，光动力疗法 （PDT） 通过增加 ROS 水平和诱导铁死亡来显着减少口腔鳞状细胞癌的生长（Zhu et al.， 2019）。同样，放疗已被证明会触发大量的铁死亡，从而有助于其抗癌作用。在 KEAP1 缺陷的肺癌细胞中，铁死亡和放射抗性是由 CoQ-FSP1 轴介导的，通过抑制该途径实现致敏（Koppula等人，2022 年）。与细胞凋亡、坏死和自噬不同，铁死亡具有独特的遗传、生化和形态学特征（Zhang等人，2019 年）。在临床上，放疗与化疗、靶向治疗或免疫治疗相结合通常是有效靶向癌细胞所必需的（Wang et al.， 2018）。值得注意的是，这些治疗的成功也可能与铁死亡的诱导有关，将其定位为克服耐药性的重要策略。

天然产物长期以来一直被认为是有前途的治疗剂，许多研究强调了它们通过关键分子机制使肿瘤细胞对辐射敏感的潜力（Komorowska等人，2022 年）。其中，β-榄香烯是一种从 Zingiberaceae 植物 Curcuma zedoaria 中提取的抗癌化合物，脱颖而出。β-榄香烯在化学上被称为 1-甲基-1-乙烯基-2,4-二异丙基环己烷，已广泛用于治疗各种恶性肿瘤，包括肺癌、膀胱癌、白血病、卵巢癌和胶质母细胞瘤癌（Wang et al.， 2005;Li et al.， 2013a;Yu et al.， 2011;Li et al.， 2013b;Yao et al.， 2008）。研究表明，β-榄香烯能够逆转耐药性并增强化疗效果（Liu et al.， 2015）。最近的研究结果还表明，它作为放射增敏剂的作用，促进 DNA 损伤和抑制修复，并增加治疗肺癌细胞的凋亡（Zou等人，2020 年）。然而，它对铁死亡和抗辐射 GC 细胞的放射敏感性的影响仍未得到探索。

在这项研究中，我们旨在研究 β-榄香烯对放射抗性 GC 细胞的影响，重点关注其诱导铁死亡和增强放射敏感性的潜力。通过阐明潜在机制，我们希望将 β-榄香烯确立为治疗放射耐药性 GC 的有效治疗辅助手段，最终改善患者的预后。

2.1 细胞培养和放射治疗

人 GC 细胞系 MKN-45 购自 BeNa Culture Collection（中国上海），AGS 来自中国科学院细胞库（中国上海）。所有细胞系均在补充有 10% 胎牛血清（Clark，中国上海）和青霉素-链霉素（Gibco，美国）的 1,640 培养基（Gibco，美国）中培养，在 37°C 和 5% CO2 的潮湿环境中。为了建立放射抗性细胞系，以 60% 的细胞密度和 4 Gy 的剂量照射 AGS 和 MKN-45 细胞。照射后，立即用新鲜培养基更换培养基，然后每 2 天更换一次。细胞连续培养直至达到 90% 汇合，此时使用胰蛋白酶酶解离并转移到新的 T25 培养瓶中。重复这种培养和照射过程，直到达到 60 Gy 的累积剂量（超过 15 个疗程），从而建立放射抗性细胞系 MKN-45/IR 和 AGS/IR（Li等人，2014 年;Petragnano et al.， 2020）。

2.2 细胞计数试剂盒-8 （CCK-8）、克隆形成测定和 EDU 测定

根据制造商的说明，使用 CCK-8 评估细胞活力。将细胞以每孔 1,000 个细胞的密度接种在 96 孔板中。为了防止边缘效应，向外周孔中加入等体积的 PBS。然后以 0、2、4、6 和 8 Gy 的剂量照射细胞或用 100 mg/L β-榄香烯处理，或两者的组合。48 小时后，向每个孔中加入 100 μL 稀释的 CCK-8 溶液并孵育 1-2 小时。使用酶标仪在 450 nm 处测量吸光度。对于克隆形成测定，使用对数生长的细胞。用胰蛋白酶处理以制备单细胞悬液后，将细胞以每孔 1,000 个细胞的密度接种在 6 孔板中。24 小时后，以 0 、 2 、 4 、 6 和 8 Gy 的不同剂量照射细胞，用 100 mg/L β榄香烯处理细胞，或接受两种处理。孵育 14 天后，用聚乙二醇固定菌落 20 分钟，并用结晶紫染色。对含有至少 50 个细胞的菌落进行计数。计算每种治疗的菌落存活率。根据制造商的说明，使用 BeyoClick™ EdU-555 细胞增殖测定试剂盒（Beyotime，上海，中国）进行 EDU 测定。使用 Leica Thunder 全自动倒置显微镜捕获图像。实验一式三份进行。

2.3 评估 β-榄香烯的抑制剂机制

为了探索 β-榄香烯如何抑制放射抗性 GC 的增殖，使用了几种特异性抑制剂。这些包括铁死亡抑制剂铁死亡抑制剂-1 （Fer-1）、铁螯合剂去铁胺 （DFO）、自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤 （3-MA）、细胞凋亡抑制剂 Z-VAD-FMK （Z-Val-Ala-Asp（OMe）-氟甲基酮）和坏死抑制剂 Necrostatin-1 （Nec-1）。所有试剂均来自 MedChemExpress（美国），并储存在 −20°C 下。

2.4 定量实时 PCR （qRT-PCR） 检测

使用 TRIzol 试剂（Invitrogen，美国）分离 RNA。qRT-PCR 过程是根据前面概述的方法进行的（Sindhuja等人，2022 年）。提供引物序列：GPX4：F：5′-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC-3'，R：5′-CCGAACTGGTTACACGGGAA-3'。

2.5 丙二醛 （MDA） 测定

根据 MDA 测定试剂盒 （Beyotime， China） 的说明进行操作。通过用 PBS 缓冲溶液洗涤待测细胞 3 次来制备工作溶液。然后，用含有 1% PMSF 的 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞 30 分钟。将 0.15 mL 裂解物转移到样品管中。向标准管中加入 0.15 mL 标准溶液，向空白管中加入 0.15 mL 蒸馏水。向每管中加入 2.5 mL TBA，在 100°C 下孵育 40 分钟，然后用自来水冷却。以 4,000 rpm 离心 10 分钟。将上清液转移到 96 孔板中，将波长设置为 532 nm，并使用多功能酶标仪测量吸光度。

2.6 活性氧 （ROS） 测量

使用 2,7-二氯荧光素二乙酸酯 （DCFH-DA） （Yeasen， Shanghai， China） 测量细胞内 ROS 水平。将细胞与在 RPMI-1640 培养基中稀释的 10 μM DCFH-DA 在 37°C 避光中孵育 30 分钟。使用 ImageJ 软件定量荧光强度。使用流式细胞术分析细胞。

2.7 铁离子检测

根据铁离子比色测试试剂盒手册（Beyotime，中国）的说明进行操作。

2.8 Western blot 检测

按照上述方法进行总蛋白分离和 Western blot（Liu等人，2020 年;He et al.， 2024）。使用以下抗体：抗 GPX4、抗 GAPDH、抗 HA 和抗 Flag （Proteintech，中国）、抗 OTUB1 （Affinity，中国）。

2.9 免疫共沉淀测定 （Co-IP）

将总细胞裂解物与 1 μg 一抗或阴性对照兔 IgG 在 4°C 下孵育过夜。随后，加入 20 μL 蛋白 A+ G 琼脂糖（Bioworld Technology，美国明尼苏达州圣路易斯帕克），并将混合物在 4°C 下进一步孵育 2 小时。用 PBS 洗涤蛋白质-抗体混合物 4 次，并通过琼脂糖珠旋转收集。在此之后，通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和随后的 Western blot 分析鉴定蛋白质。

2.10 免疫荧光测定 （IF）

首先，用冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（Gibco，美国）洗涤 GC 细胞 3 次。然后用 4% 多聚甲醛（Beyotime，中国）固定 25 分钟，然后用 0.1% Triton X-100（Beyotime，中国）透化 10 分钟。随后在 5% 牛血清白蛋白（Solarbio，中国）中进行封闭步骤。随后，将细胞与抗 GPX4 抗体在 4°C 下孵育过夜，然后用 PBS 洗涤 3 次。接下来，将细胞与 Alexa Fluor 488 偶联的山羊抗小鼠 IgG（ABclonal，中国）孵育 1 小时，然后用 PBS 洗涤 3 次。然后将细胞与抗 OTUB1 抗体在 4°C 下孵育过夜，然后进行 PBS 洗涤。随后，将细胞与 Alexa Fluor 647 偶联的山羊抗兔 IgG（ABclonal，中国）孵育 1 小时，并用 DAPI（Cell Signaling Technology，美国）染色 15 分钟。使用 Zeiss LSM 900 共聚焦显微镜对染色细胞进行成像。

2.11 免疫组织化学 （IHC）

根据先前描述的方法进行 IHC（Zhu等人，2021 年;胡 et al.， 2020;Yilin 胡 et al.， 2024）。使用抗 GPX4、抗 Ki-67、抗 4-HNE 抗体。两名经验丰富的病理学家根据以下标准对染色强度进行手动评分：0 = 无染色，1 = 弱染色，2 = 中度染色，3 = 强染色。阳性细胞的比例评分为 1 （0%–10%）、2 （11%–50%）、3 （51%–80%）、4 （81%–100%） （Lu et al.， 2020;Zhu et al.， 2019;Xian et al.， 2014;Jing-Lin Wang et al.， 2023）。最终的 IHC 评分是通过将强度评分乘以阳性细胞的百分比来计算的。

2.12 动物实验

将 32 只 4 周龄雄性裸鼠（购自南通大学模型动物研究中心）随机分为 8 组。4 组注射 MKN-45/IR 细胞 （对照组、β榄香烯 组、放疗组、联合治疗组），4 组 AGS/IR 细胞注射 （对照组、β-榄香烯 组、放疗组、联合治疗组），每组 4 只小鼠。每只小鼠在右侧腋窝区域皮下注射 200 μL MKN-45/IR 或 AGS/IR 细胞 （2 × 10^6 个细胞）。定期监测小鼠的生长情况，一旦皮下肿瘤大小达到约 150 mm³（约 15 天），对各组进行不同的治疗。每 3 天测量一次肿瘤体积和重量。36 天后，对小鼠实施安乐死，收获肿瘤组织，称重，拍照，记录，绘制肿瘤生长曲线。所有动物实验均经南通大学动物伦理委员会批准。

2.13 统计分析

使用 GraphPad Prism 8.0 和 R 编程语言 （4.2.3 版） 分析数据。正态分布的测量数据表示为 SD ±平均值，并用双样本 t 检验进行统计分析。非正态分布测量数据表示为中位数 （范围） 并通过 Mann-Whitney U 检验进行分析。对于符合正态分布的 3 个或更多组，使用单向方差分析，而对于不服从正态分布的组，采用 Kruskal-Wallis 检验。所有统计分析均为双侧，p < 0.05 用于定义统计显著性。所有实验均进行了 3 次以上。

3.1 β-Elemene 治疗逆转 GC 细胞的放射抗性

为了研究 β-榄香烯处理是否可以逆转 GC 细胞的放射抗性，我们首先建立了放射抗性 GC 细胞系 （MKN-45/IR 和 AGS/IR） （图 1A）。使用细胞计数试剂盒 8 （CCK-8） 测定和克隆形成存活测定评估 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞的放射抗性。结果表明，与亲本细胞相比，MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞表现出更高的生长能力和存活率（图 1B-E）。我们进一步确定了放疗前后细胞存活的平均致死剂量 （D0 ） 、准阈值剂量 （Dq） 和增敏率 （SER）。结果表明，MKN-45 的 D0 为 3.130，Dq 为 2.665，而 MKN-45/IR 细胞的 D0 为 4.476，Dq 为 3.052，SER 为 0.75。对于 AGS，D0 为 3.302，Dq 为 2.376，而对于 AGS/IR 细胞，D0 为 4.441，Dq 为 2.904，SER 为 0.74。这些发现表明，耐药细胞系比其亲本细胞表现出更强的辐射抗性。为了进一步探索 β-榄香烯处理对放射抗性的影响，我们使用克隆形成测定验证了这种效果。结果表明，β-榄香烯联合放疗显着降低了 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞的集落形成能力（图 1F-I）。

Figure 1

图 1.β-Elemene 处理可逆转 GC 细胞的放射抗性。（A） 抗辐射 GC 细胞系模型的构建。（B-C）使用 CCK-8 测定评估放射抗性 GC 细胞系 MKN-45/IR 和 AGS/IR 的放射敏感性。（D-E）评估不同辐射剂量治疗后的集落形成;治疗后 2 周计数菌落。（F-I）研究 β-榄香烯和/或 4 Gy 辐射暴露通过集落形成对 GC 细胞增殖能力的影响。***p < 0.001。

3.2 β-Elemene 处理可诱导放射抗性 GC 细胞铁死亡

为了确定 β-榄香烯联合放疗抑制放射耐药 GC 细胞生长的主要分子机制，首先用各种细胞死亡抑制剂对细胞进行预处理。用铁死亡抑制剂 Fer-1 、铁螯合剂 DFO、自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤 （3-MA） 、细胞凋亡抑制剂 Z-VAD 和坏死性凋亡抑制剂 Necrostatin-1 处理细胞。48 小时后评估细胞存活水平。结果表明，Fer-1 和 DFO 均显着减少了放疗和 β-榄香烯联合治疗诱导的细胞死亡（图 2A、B）。这表明铁死亡可能在 β-榄香烯逆转放疗耐药的能力中起关键作用。随后，为了进一步验证这一假设，我们测量了 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞中活性氧 （ROS） 、铁离子和脂质过氧化的水平。与以前的发现一致，在 β-榄香烯和放疗联合治疗后，这些指标显着升高（图 2C-H）。为了探讨铁死亡在 β-榄香烯逆转 GC 细胞放疗耐药中的作用，我们专注于一种关键的铁死亡调节蛋白谷胱甘肽过氧化物酶 4 （GPX4）。GPX4 是防止过氧化物脂质在细胞中积累的主要酶，其活性与铁死亡密切相关 （Liu et al.， 2024）。因此，我们通过 qPCR 和 Western blot 评估了 GPX4 在用 β-榄香烯处理的放射抗性 GC 细胞中的表达。虽然 GPX4 mRNA 表达水平没有显着变化，但蛋白质水平显着下降，表明 β-榄香烯可能通过影响蛋白质稳定性或降解途径来调节 GPX4 的表达，从而进一步促进铁死亡（图 2I-L）。

Figure 2

图 2.β-Elemene 处理可在放射抗性 GC 细胞中诱导铁死亡。（A-B）MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞用 4 Gy 照射和/或 β-榄香烯 （100 mg/L） 联合各种细胞死亡抑制剂处理 48 h，然后使用 CCK-8 测定进行细胞活力评估。（C-D）用流式细胞术用 β-榄香烯 （100 mg/L） 和/或照射 （4 Gy） 处理后 48 小时测量 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞中活性氧 （ROS） 的水平。（E-F）使用 Fe2 + 检测试剂盒在 β-榄香烯 （100 mg/L） 和/或辐射 （4 Gy） 处理后 48 小时测定 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞中 Fe2 + 的细胞内水平。（G-H）用 β-榄香烯 （100 mg/L） 和/或不同剂量的辐射处理 48 小时后，分析 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞中丙二醛 （MDA） 水平。（I-L）使用 qRT-PCR 和 Western blot 用 β-榄香烯 （100 mg/L） 和/或辐射 （4 Gy） 处理后 48 小时评估 AGS/IR 和 MKN-45/IR 细胞中 GPX4 的表达。**p < 0.01，***p < 0.001。

3.3 β-Elemene 促进 GPX4 在放射抗性 GC 细胞中的泛素化和降解

为了进一步阐明 β-榄香烯如何影响 GPX4 蛋白水平，我们最初用放线菌酮 （CHX） 处理细胞以阻断新蛋白质合成，使我们能够观察蛋白质降解的动力学。实验结果表明，在 β-榄香烯和放疗联合治疗中，GPX4 的降解速度比单独放疗组更快（图 3A-F）。这表明 β-榄香烯可能增强 GPX4 的降解。考虑到泛素-蛋白酶体通路和自噬-溶酶体通路是调节蛋白质降解的两条主要途径，我们使用蛋白酶体抑制剂 MG132 和自噬抑制剂氯喹 （CQ） 进一步探索这些途径的作用。MG132 处理显着抑制 GPX4 的降解，而 CQ 处理对 GPX4 的降解影响很小（图 3G-J）。这一结果表明，在 β-榄烯联合放疗的条件下，GPX4 的降解主要通过泛素-蛋白酶体途径发生。为了验证这一点，我们进一步检查了 GPX4 的泛素化水平。与单独放疗组相比，β-榄香烯和放疗联合组 GPX4 的泛素化水平显着增加，支持我们的假设，即 β-榄香烯可能通过促进泛素化和随后蛋白酶体介导的 GPX4 降解而发挥作用（图 3K、L）。

Figure 3

图 3.β-Elemene 促进 GPX4 在放射抗性 GC 细胞中的泛素化和降解。（A-F）用或不用 β-榄香烯 （100 mg/L） 的辐射 （4 Gy） 处理的 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞中 GPX4 蛋白水平的蛋白质印迹分析。在 CHX 处理后 0 、 2 、 4 和 6 小时收获细胞。（G-J）用或不用 β-榄香烯 （100 mg/L） 的辐射 （4 Gy） 处理的 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞中 GPX4 蛋白水平的蛋白质印迹分析。在用 MG-132 或 CQ 处理后 0 、 2 、 4 和 6 小时收集细胞。（K-L）研究用 Ub 质粒、Flag-GPX4 和 MG132 共转染、放疗 （4 Gy） 处理或不β-榄香烯 （100 mg/L） 处理的细胞中 GPX4 泛素化水平。

3.4 β-Elemene 抑制放射抗性 GC 细胞中 OTUB1 和 GPX4 之间的相互作用

为了更深入地研究 GPX4 泛素化和降解的机制，我们利用 IntAct 在线数据库来预测 GPX4 的潜在相互作用蛋白（图 4A）。在这些蛋白质中，OTUB1 已被鉴定为一种脱泛素酶，它与泛素依赖性蛋白质降解途径密切相关。既往研究表明，在 GC 细胞系中，OTUB1 可与 GPX4 形成复合物，从而降低 GPX4 的泛素化水平并抑制其蛋白酶体降解（Li等人，2023 年）。我们还在放射抗性 GC 细胞系中发现了这种现象。IF 测定证实了 OTUB1 与 GPX4 的共定位 （图 4B、C），COIP 测定显示 GPX4 和 OTUB1 之间的相互作用在对照组和单独放疗组中都是稳健的。然而，在 β-榄香烯联合放疗治疗的组中，这种相互作用显着减少（图 4D、E）。

Figure 4

图 4.β-Elemene 抑制放射抗性 GC 细胞中 OTUB1 和 GPX4 之间的相互作用。（A） 使用 IntAct 在线数据库预测的 GPX4 的潜在相互作用蛋白。（B-C）IF 实验和 mIHC 验证了 GPX4 和 OTUB1 在 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞中的共定位。比例尺，10 μm。（D-E）免疫共沉淀 （Co-IP） 测定检测 MKN-45/IR 和 AGS/IR 细胞中 GPX4 和 OTUB1 之间的相互作用，辐射 （4 Gy） 有或没有 β-榄香烯 （100 mg/L）。

3.5 β-榄香烯可通过体内铁死亡逆转 GC 细胞放射抗性

为了探索 β-榄香烯联合体内放疗的治疗潜力，我们通过皮下注射 MKN-45/IR 或 AGS/IR 细胞在裸鼠中建立了皮下肿瘤模型（图 5A）。一旦肿瘤发展，通过管饲法使用 β-榄香烯 （每次给药 0.2 mL） 、单独放疗 （每次给药 2 Gy） 或两者的组合进行治疗。结果表明，用 β-榄香烯联合放疗治疗的裸鼠的肿瘤生长受到显着抑制（图 5B-G）。肿瘤组织的免疫组织化学染色显示联合治疗组 4-HNE 水平升高，而 Ki-67 和 GPX4 的表达低于对照组（图 5H、I）。

Figure 5

图 5.β-榄香烯可以通过体内铁死亡逆转 GC 细胞放射抗性。（A） 构建 β-榄香烯联合放疗治疗皮下肿瘤裸鼠模型的流程图。（B-C）皮下异种移植肿瘤的典型图像。（D-G）皮下异种移植肿瘤的体积和重量 （n = 4）。（H-I）不同组皮下肿瘤的 IHC 染色。比例尺，50 μm ***p < 0.001。

本研究阐明了 β-榄香烯通过调节铁死亡逆转 GC 放射抗性的能力。具体来说，已经证明 β-榄香烯抑制 OTUB1 和 GPX4 之间的相互作用，促进泛素介导的 GPX4 降解，增强铁死亡，从而增强 GC 细胞的放射敏感性（图 6）。这些发现为 β-榄香烯的治疗用途克服 GC 治疗中的放射耐药性提供了新的视角。

Figure 6

图 6.β-Elemene 通过抑制 OTUB1-GPX4 相互作用促进胃癌中的铁死亡并逆转放射耐药性。

最近的研究表明，β-榄香烯作为放射增敏剂对各种癌症类型具有潜力。例如，对非小细胞肺癌的研究表明，β-榄香烯通过抑制 EMT 并通过 Prx-1/NF-κB/iNOS 信号通路减少癌症干细胞特性来增强放射敏感性（Zou等人，2020 年）。同样，据报道 β-榄香烯可促进 DNA 损伤并抑制修复机制，导致胶质母细胞瘤和膀胱癌细胞凋亡增加（Li et al.， 2011）。在胶质母细胞瘤中，β-榄香烯增强放射敏感性和化学敏感性的能力与其抑制 ATM 信号通路有关（Liu et al.， 2015）。我们的研究表明，β-榄香烯主要通过抑制 OTUB1-GPX4 相互作用促进铁死亡来逆转 GC 细胞中的放射抗性。这种机制强调了 β-榄香烯独特的放射增敏能力及其改善 GC 放疗结果的潜力。

GPX4 是铁死亡的重要负调节因子 （Chenet al.， 2023）。GPX4 的主要细胞内功能是从细胞膜中清除过氧化脂质，防止过氧化损伤（Forcina 和 Dixon，2019 年）。它将还原型谷胱甘肽 （GSH） 转化为氧化型谷胱甘肽 （GSSG），同时将过氧化脂质还原为无毒脂质。因此，它在抑制铁死亡中起着至关重要的作用 （Xue et al.， 2023）。在肿瘤学中，GPX4 因其在减轻脂质过氧化和避免铁死亡方面的关键作用而得到认可，从而支持癌细胞在治疗应激下的存活。

最近的研究发现，去泛素酶选择性地调节与肿瘤发生和发展密切相关的肿瘤相关蛋白（Dewson et al.， 2023）。含有 OTU 结构域的泛素醛结合蛋白 B1 （OTUB1） 是 DUB 家族的一员，广泛表达于肾、肠、脑、肝和肺 （Nijman等人，2005）。OTUB1 是一种参与肿瘤恶性进展的去泛素化酶 （Liao et al.， 2022）。例如，OTUB1 通过促进 EMT 促进结直肠癌转移，并作为结直肠癌中潜在的远处转移标志物（Saldana等人，2019 年）。OTUB1 还通过稳定蛋白 Snail 促进食管鳞状细胞癌 （ESCC） 转移。在 GC 细胞中，OTUB1 通过抑制其泛素化来稳定 GPX4，最终通过抑制铁死亡促进 GC 转移（周 et al.， 2018）。这导致我们推测榄香精对 GPX4 的泛素化修饰是否与 OTUB1 有关（Li等人，2023 年）。在本研究中，OTUB1 通过去泛素化稳定放射抗性 GC 细胞中的 GPX4。这种相互作用对于维持细胞氧化还原稳态和抵抗细胞死亡至关重要，使其成为治疗干预的重要靶点。

这项研究的意义在于揭示了一种新的机制，即 β-榄香烯通过诱导铁死亡来增强 GC 细胞的放射敏感性。这种新发现的途径不同于以前已知的 β-榄香烯的作用，例如诱导细胞凋亡和导致细胞周期停滞（Liu et al.， 2015）。因此，该研究扩大了科学界对 β-榄香烯在癌症治疗中的不同作用的理解，特别是在放射治疗方面，并强调了其纳入治疗方案的潜力。研究结果表明，β-榄香烯可能通过变构调节或竞争性抑制破坏 GPX4-OTUB1 轴（Zhao等人，2023 年）。这种干扰需要进一步的结构和生化分析，以阐明 β-榄香烯采用的确切机制。获得如此详细的分子见解将有助于开发靶向疗法，利用放射抗性 GC 细胞对 GPX4-OTUB1 相互作用的依赖性。

（翻译及审校：梁嘉伟、李彦慧）