近期凝血岗位同事反应新配TT试剂质控不稳定，两水平都经常偏低甚至失控（特别是正常水平，靶值在15秒左右，而近期多次低至13秒以下），更换人员配置试剂仍然不能解决，也排除了仪器问题。质控图如下：
本实验室使用沃芬的ACL TOP750血凝仪及其配套试剂。首先查看试剂批号，近期并未更换。且6月6日才做过TT室间质评样本，5个样本检测结果与靶值偏差均在5%以内。因此质控均值的设置是没问题的，那么为什么会突然做低呢？是试剂质量有问题还是配置过程中的哪个环节出了问题？
试剂质量问题？
随机抽取10盒试剂，每盒试剂配置一瓶后上机检测，质控均在靶值附近，未发现明显质量问题。
制备流程问题？
我们主要从两个方面进行分析：1，制备试剂用水质量是否达标；2，试剂制备前是否在室温充分平衡。
首先分析制备用水的影响：近期纯水机出口电导率0.256 μS/cm，达到了二级实验用水标准；从一盒新的TT试剂中取出两瓶干粉试剂，室温平衡30分钟后，分别加入4毫升娃哈哈纯净水和实验室用水，1分钟后加入1毫升缓冲液。室温放置30分钟，混匀后上机检测，正常水平质控结果分别为15.2s和15.3s，均在靶值附近且无明显差异。看起来实验室所用纯水配制试剂并无问题。
接下来分析制备前室温平衡时间的影响，取7瓶干粉试剂，分别在室温平衡0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min后加入4毫升实验室用水，1分钟后加入1毫升缓冲液。后室温放置30分钟，混匀后上机检测，正常水平质控结果如下表:
可见室温平衡时间对TT试剂制备效果也无明显影响，那么这突如其来的质控偏低问题到底是什么原因引起来的？
首先来仔细回顾一下TT试剂的制备流程：沃芬的TT试剂盒含有两种试剂：R1缓冲液（里面含有CACL2、缓冲成份及防腐剂），R2 干粉试剂（里面含有牛凝血酶、牛白蛋白及缓冲成份）。说明书给出的配制方法是先用纯水将缓冲液进行1:5倍稀释后，吸取5毫升加入干粉试剂复溶。该方法比较繁琐，且存在稀释容器多次使用被污染的风险，因此多数实验室使用经验证且不影响检测结果的简便流程：使用4毫升纯水复溶干粉试剂，1min后加入1毫升缓冲液，室温放置30min后混匀使用。本实验室使用的也是简便流程，从平台使用至今并未出现类似问题。
材料和流程均没有明显问题，那么可能出问题的地方还有哪些呢？凝血岗近期轮转来了几名新同事，是否是他们操作过程中的哪一步出现了问题呢？接下来我们叫来一位新同事现场配置，这时候终于发现了问题所在：缓冲液使用前未充分混匀！按照试剂说明书的要求（如下图），平时大家在制备TT试剂时往往会将缓冲液在摇床上摇匀1到2分钟后再使用，新同事以为缓冲液是液体试剂，其成份只起到缓冲反应体系的作用，不混匀应该不会影响配制效果。
接下来我们进行验证：从试剂库取出一盒TT试剂，轻轻转移至试剂配置台（过程中避免晃动），取出三瓶干粉试剂，加入4毫升纯水复溶1min后，分别从未混匀的缓冲液上、中及下方最底层吸取1毫升缓冲液加入试剂瓶，室温放置30min，摇匀后上机检测，果然重现了质控偏低的问题：
到这里终于找到了质控失控的原因，仅仅因为缓冲液未充分混匀，便引起检测结果如此明显的偏差，这提醒我们试剂使用应严格遵照说明书操作，任何对制造商建议的偏离都应经过验证。
经我们仔细排查发现的这一凝血检查质量风险供同道参考，避免“踩坑”。此外，使用未混匀的缓冲液为何会造成结果差异的确切机制尚不得而知，推测中下层某些缓冲液成分浓度过高或许对凝血酶活性有促进作用？我们也在咨询制造商，希望获得更准确答案。
审校：Tony
