凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）和纤维蛋白原（FIB）测定是常见的凝血试验，抗凝血酶III（ATIII）是体内主要的抗凝蛋白，是凝血酶、因子 Xa 和其他凝血酶的主要抑制剂；这些指标可用于评估凝血和抗凝系统的病理变化。而在实验室测试过程，一般分为三个阶段，即分析前、分析中和分析后阶段。影响凝血试验结果的主要分析前变量包括采样技术、抽取顺序、抗凝剂的类型和浓度、血细胞比容、采样管的填充状态、运输、离心、温度、采集和检测之间的时间间隔等[1]。本次实验旨在探究凝血试验标本在室温下存放的时间长短对于上述4项凝血试验的结果的影响。
实验方法
普通样本选择自2023年11月29日在本院抽血的6名患者（样本1~样本6），每例标本分别进行APTT、PT、FIB、ATIII检测。第一次检测控制在采集时间2小时（H）以内，此后分别在距离标本采集4H，8H，12H，24H进行上述凝血检测，记录结果。此外，针对PT和APTT，另选4份应用了抗凝药物的患者样本（样本7~样本10），其中样本7使用阿加曲班，样本8使用低分子肝素（LMWH），样本9、样本10均为使用普通肝素（UFH）。
仪器和试剂采用STA-R MAX血凝仪及其配套试剂，所有样本在采集后2H内完成离心（2000g Х10min），样本全程常温（20~25℃）放置。为了避免样本长时间暴露在空气中导致血浆水分蒸发，影响结果[2]，所有检测都在保持样本帽盖紧的状态下进行（使用仪器的穿刺针进行检测）。实验完成后，我们将记录的结果根据不同的检测项目和放置时间的长短分组后进行配对结果分析。
各时点80%及以上结果与2H以内结果偏差小于允许偏差，视为可接受（但只要开始有结果超出允许偏差，该项目此后时点均视为不可接受）：
结果
一、PT检测结果
所有样本在各个时点的检测结果与2H以内结果偏差均小于允许偏差。（图1）
二、APTT检测结果
从8H开始，样本3、7、9、10结果与2H结果偏差超过7.5%（实验室允许偏差），绝大部分（9/10）的样本在采集24H之后的检测结果与2H内检测结果偏差均超过了允许偏差。即未使用抗凝药物的样本，放置8H的APTT结果仍是可接受的（1/6的结果超出允许偏差），但使用了抗凝药物的样本，放置超过4H的结果就可能无法接受。（图2）
三、FIB检测结果
样本4的8H与2H内结果偏差，及样本5的12H与2H内结果偏差超过10%（FIB实验室允许偏差），其余结果偏差均未超过实验室允许偏差。（图3）
图3 标本放置时间对FIB结果的影响
四、ATIII检测结果
所有6份样本在4H、8H、12H、24H的AT检测结果与2H内的检测结果偏差均未超过10%。（结果见下图和下表）
图4 标本放置时间对AT结果的影响
讨论
从实验结果来看，在满足一定先决条件的情况下（及时离心且常温加盖放置），普通标本放置24H对PT、AT检测结果的影响均可接受。一般标本放置8H的APTT结果尚可接受，但应用了抗凝药物的患者标本放置8H，APTT结果大多变得不能接受。这一结果与Wang等人的研究[3]较为吻合。APTT结果的稳定性较差可能是由于不稳定因子的时间依赖性生成或丢失，特别是因子 VIII和V [4]。而在患者使用阿加曲班、UFH等抗凝药物的时候，标本放置时间的延长会导致APTT的结果增加更为明显，使用低分子肝素的患者则未观察到类似的现象。可能的原因是阿加曲班和UFH直接和间接的抑制凝血酶活性，这一抑制效应在体外会随着时间增强。因此我们建议APTT检测应在采集后4H内完成。
而即使使用了阿加曲班、LMWH、UFH的患者，PT结果在采样离心后24小时内都能保持稳定，这与Magnette等人的研究结果[5]一致，表明这类抗凝药物的使用在体外相当长时间内也不会造成PT结果的明显变化。
在FIB的实验结果中，所有标本放置4H后的检测结果和2H内检测结果的差值都在实验室允许偏差内，而从8H开始就有个别样本的变化程度超过实验室的允许误差。Feng等人的研究[1]中提到的FIB测定结果能在24H内保持稳定，而Wang等人的研究[3]中提到的FIB测定结果能在8H内保持稳定。基于本实验结果，我们建议FIB在标本采集后8H内完成检测。
所有样本在24H内的ATIII检测结果与首次检测结果的差值都未超过实验室允许偏差，说明离心后室温放置24H内的ATIII检测结果似乎都是可靠的。进一步观察发现，当样本在室温下放置12H、24H后，所有样本的检测结果较2H内检测结果都逐渐下降。表明标本体外放置12H后ATIII的活性开始下降。
局限性：本次实验标本量较少，仅供参考。且未调查采样到离心的时间、标本放置的温度和标本是否加盖等对检测结果的影响。
综上所述，对及时离心（采样后2H内）且室温加盖放置的凝血样本，APTT检测应在采样后4H内完成（若未应用抗凝药物，可放宽至8H内），FIB检测应在采样后8H内完成，PT和ATIII则在采样后24H内检测均可。而临床实践中，未及时检测的样本未必能做到及时离心和加盖放置，因此建议放置时间尽量短。选择检测速度更高的高通量凝血分析仪或能在一定程度上减少这类影响。
参考文献
1. Feng L, Zhao Y, Zhao H, Shao Z. Effects of storage time and temperature on coagulation tests and factors in fresh plasma. Sci Rep. 2014 Jan 27;4:3868.
2. Kitchen S, Olson JD, Preston FE. Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis. Bognor Regis: Wiley-Blackwell, 2nd Edition. 2013; 22–44.
3. Wang X., Ma J. Z. H. & Hao Z. L. Influence of storage time of PT and APTT at different temperature. Journal of Hebei Medical University 23, 108–109 (2002).
4. Kottke-Marchant K, David B. Laboratory hematology practice. Wiley-Blackwell. 2012;31:416–7.
5. Magnette A, Chatelain M, Chatelain B, Ten Cate H, Mullier F. Pre-analytical issues in the haemostasis laboratory: guidance for the clinical laboratories. Thromb J. 2016 Dec 12;14:49. doi: 10.1186/s12959-016-0123-z.
审校：Tony
