JIPB | 甲基转移酶MTB与SERRATE的相互作用介导microRNA生物发生和RNA m6A修饰的相互调节

2024年8月，华南师范大学生命科学学院张钟徽课题组、华南农业大学赫圣博课题组及广东省农科院水稻研究所刘琦课题组合作发表了一篇名为“The METHYLTRANSFERASE B-SERRATE interaction mediates the reciprocal regulation of microRNA biogenesis and RNA m⁶A modification”的研究论文。该研究详细阐述了RNA m⁶A甲基转移酶复合物与miRNA加工复合体如何通过各自核心亚基MTB和SE进行互作而影响m⁶A甲基化和miRNA加工的调控过程。

在真核生物中，RNA的N⁶-甲基腺苷(m⁶A)修饰和miRNA调控是两个关键的表观遗传机制，参与植物生长发育和环境刺激响应等诸多生物学过程。m⁶A修饰主要在mRNA的外显子区域和3'-非翻译区(3'-UTR)，通过由MTA、MTB、FTO、METTL3等亚基组成的甲基转移酶复合体(MTC)催化，来影响基因表达；miRNA则通过miRNA加工复合体降解或抑制mRNA的翻译来调控基因，该复合体由DICER-LIKE 1 (DCL1)的RNase III家族酶、HYPONASTIC LEAVES 1(HYL1)和SERRATE (SE)三个关键成分组成。近年来在动植物中的研究表明，RNA m⁶A甲基转移酶复合物在细胞核内形成动态的核斑点，而miRNA加工复合体（microprocessor)也能通过液-液相分离在核内形成无膜细胞器——切割小体（Dicing body,D-body)。特别是miRNA加工复合体中核心蛋白SERRATE（SE)含有内在无序区段⁽Intrinsic disorder region, IDR)，具有液-液相分离特性并参与切割小体的形成。尽管先前有研究表明m⁶A修饰对miRNA的生物合成有正向调控作用，但具体的相互作用机制尚不清楚。本研究揭示了m⁶A甲基转移酶复合体(MTC)和miRNA加工复合体之间的相互作用，通过MTB-SE相互作用模块，为理解植物中RNA m⁶A修饰和miRNA生物合成之间的相互作用提供了新的见解。

1.MTC通过MTB-SE交互与miRNA加工复合体关联

为了识别MTC的辅因子并探索其调控机制，作者通过免疫共沉淀(Co-IP)实验和质谱分析(IP-MS)方法，由此确认了SE蛋白与MTB相互作用，而与MTA之间没有相互作用(图1A和图1B)。作者通过酵母双杂交实验来验证MTA、MTB与SE之间的直接相互作用，结果表明BD-MTB与AD-SE之间存在相互作用，而BD-MTA与AD-SE之间没有相互作用，反之，BD-SE也与AD-MTB相互作用。而BD-MTA不与AD-SE相互作用，证实了MTB是MTC和miRNA加工复合体之间相互作用的关键桥梁(图1C)。

为了验证MTC与miRNA加工复合体的相互作用评估其互作的亚细胞位置，作者通过共表达YFP标记的MTB或MTA与Flag-4Myc标记的SE、HYL1或DCL1，并进行共免疫沉淀实验，得出YFP-MTB与SE、HYL1和DCL1共沉淀，而YFP-MTA与这些组分的共沉淀较弱，表明了MTB在MTC和miRNA加工复合体之间的相互作用中起主要作用(图1D-F)。又通过双分子荧光互补(BiFC)实验，验证了是MTB与这些组分在细胞核内相互作用(图1G)。为了进一步验证MTB的分子桥作用，作者通过共表达HA标记的MTB与MTA-YC和SE-YN或HYL1-YN，进行BiFC实验，在包含HA-MTB的组合中检测到重组YFP信号，表明MTB促进了MTA与miRNA加工复合体关键组分的体内关联(图1H和图1I)。接着作者又通过酵母双杂交得出MTB的N端区域(氨基酸107-652)与SE的C端区域(氨基酸469-720)对为MTB与SE相互作用所需的特定结构域。

总之，MTB-SE相互作用模块在植物中miRNA生物合成和RNA m⁶A修饰之间的相互调控中起着关键作用。

图1 m⁶A写入器组件与miRNA加工复合体中关键组件的相互作用。(A)免疫共沉淀实验(Co-IP)。(B)IP-MS鉴定。(C)酵母双杂交测定。(D-F) Co-IP 测定。(G) BiFC测定。 (H)在烟叶中共表达血凝素(HA)-MTB的BiFC测定。(I)蛋白质印迹。

2.MTB的敲低会损害miRNA的生物发生

作者推测MTB也可能有助于miRNA的生物发生，则创制了转基因MTB敲低系(amiR-MTB）(图2A)。为了进一步证实推测，作者在amiR-MTB中，首先通过免疫印迹分析，得出内源MTB和MTA蛋白水平下降，表现出多效性发育表型(图2B-C)；再对小RNA进行凝胶印迹分析发现成熟的miRNA的含量减少(图2D)；经过RT-qPCR 测定miRNA靶向的mRNA丰度相较于野生型增加，表明MTB对miRNA的生物发生至关重要(图2E-I)。此外，作者发现敲低FIP37也导致多效性发育表型和miRNA积累减少，结果表明功能性MTC对于正确的miRNA生物发生有着不可或缺的作用。

图2.MTB对于miRNA的生物合成至关重要。(A)使用抗MTA/MTB抗体进行蛋白质印迹，用于检测35S-amiR-MTB的Col-0野生型、突变体和敲低系中的MTA和MTB。(B)Col-0野生型、突变体和35S-amiR-MTB敲除系的3周龄植物的发育表型。(C)35S-amiR-MTB的Col-0野生型、突变体和敲低系中莲座叶的表型。(D)35S-amiR-MTB的Col-0野生型、突变体和敲低系中所示miRNA的小RNA凝胶印迹。(E-I)通过定量聚合酶链式反应对所示miRNA靶向的mRNA水平进行定量。

3.MTB促进miRNA加工复合体与MIRNA 基因座和pri-miRNA的结合

作者为了探究MTB在miRNA生物合成中的作用。首先通过RT-qPCR分析MTB缺失对pri-miRNAs转录水平的影响，显示在mta和mtb突变体中，pri-miRNAs的积累增多，说明MTB对pri-miRNAs的正常加工或降解起关键作用(图3A)。再者进行了GUS报告基因分析作者评估了MIR基因的转录活性是否因MTB缺失而改变，发现MIR基因的转录活性在突变体和野生型之间没有差异，表明pri-miRNAs积累的增加不是由于转录水平的变化(图3B)。作者通过分析SE和DCL1的亚细胞定位以及量化切割小体的数量，其在mta突变体中没有显著变化，说明MTB缺失并不影响这些蛋白的定位和切割小体的形成(图3C-D)。接着作者通过RIP-qPCR和ChIP-qPCR分析表明，在mtb突变体中，miRNA加工复合体与pri-miRNAs的结合减少，SE与MIRNA基因位点的结合也降低，这表明MTB对于miRNA加工复合体和SE的功能至关重要(图3F)。

综上，MTB不仅影响miRNA加工复合体与pri-miRNAs的结合，还影响SE与MIRNA基因位点的结合，从而调节miRNA的加工和成熟。这些发现为理解植物中miRNA生物合成的调控机制提供了新的见解。

4.SE影响转录组范围内的m⁶A甲基化

为了探究SE影响RNA m⁶A甲基化的机制，作者对突变体总RNA进行总体斑点印迹分析，结果表明在相同mRNA负载下，se-1突变体中m⁶A甲基化RNA信号弱于野生型但强于mta和mtb突变体(图4A)。这一结果促使作者对Col-0、mta和se-1植物样品进行使用甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)，来更全面地探讨SE对转录组RNA m⁶A甲基化的影响。

相比较于Col-0、mta和se-1系中m⁶A富集度显著降低(图4B)，结果表明SE可能有助于广泛转录物中的RNA m⁶A甲基化有着重要作用。通过韦恩图展示se-1和mta突变体低甲基峰重叠来表明二者具有协同作用(图4C)。于是通过motif分析，识别了m⁶A修饰峰区域的保守序列基序，得出SE可能通过影响特定序列的m⁶A修饰来调控基因表达的结论(图4D)。接着对富集m⁶A甲基化峰的分析证实，编码基因位点中的许多m⁶A修饰主要分布在3'非翻译区(3'UTR)和终止密码子周围(图4E)，然而mta和se-1突变体中3'-UTR的峰比例显著降低(图4F)，表明m⁶A甲基化模式可能受到这两个基因的影响。尽管pri-miRNA在植物中的表达水平非常低，作者还是对pri-miRNAs中m⁶A甲基化峰的鉴定，得出这些m⁶A峰主要在前体miRNA区域或MIRNA位点附近，总结了SE通过影响pri-miRNAs的m⁶A修饰来调控miRNA成熟(图4G)。通过MeRIP-qPCR分析，作者评估了所有测试mRNA和pri-miRNA的甲基化状态。只有se-1突变体中的m⁶A甲基化水平显著降低(图H-I)。

这些结果表明SE在转录组范围内的m⁶A甲基化中发挥积极的调节作用。这些发现为理解植物中m⁶A修饰和miRNA调控网络提供了新的视角。

图4. SERRATE(SE)影响转录组范围内的m⁶A沉积。(A)mRNA的m⁶A斑点印迹分析对比图。(B)从 Col-0、se-1和 mta调用的m⁶A峰的小提琴图。(C)与Col-0相比，se-1和mta之间MeRIP-seq低甲基化基因重叠的维恩图。(D)包含m⁶A的峰区域的保守序列基序图。(E)se-1和mta编码基因低甲基化位点的基因组视图示例。(F)基因体m⁶A分布的宏基因图。(G)对测试pri -miRNA的m⁶A峰基因组视图。(H) 编码 mRNA的MeRIP-qPCR分析。(I)对测试的pri-miRNA进行MeRIP-qPC分析。

5.SE促进MTC复合体的LLPS

为了深入了解SE在调控m⁶A甲基化中的作用及其潜在机制，作者进行了一系列的实验。他们首先通过RT-qPCR分析发现，在se突变体中，MTA、MTB和FIP37的转录水平较高(图5A)，而免疫印迹分析也显示MTA和MTB的蛋白丰度在se突变体中增加(图5B)，这表明SE可能通过其他调控机制影响MTA或MTB的表达水平来调节m⁶A甲基化。进一步的MeRIP-seq数据分析显示，编码RNA m⁶A甲基化途径关键成分的基因转录水平没有显著变化(图5C)，说明SE的作用可能不涉及这些基因的转录调控。

鉴于MTA和MTB形成功能性RNA m⁶A甲基转移酶异二聚体，作者通过Co-IP实验探究了SE是否影响MTA和MTB的相互作用，结果表明SE缺失并不干扰MTA和MTB组装成异二聚体(图5D)。考虑到SE含有多个IDR并表现出LLPS能力，作者进一步研究了SE对MTC复合物LLPS的影响。体外实验显示，SE的存在促进了MTB的相分离，形成更大的液滴(图5E-F)，而在体内实验中(图5G-H)，YFP-MTB在se突变体中的核斑点数量减少，FRAP实验也表明SE促进了MTB的相分离和动态组装。

综上所述，这些结果揭示了SE在促进MTC复合物的LLPS以及调节m⁶A甲基化中的重要作用，为理解SE在转录组范围内m⁶A甲基化中的调控作用提供了新的视角。

图5.SE促进MTC的液-液相分离。(A)SE突变体中MTC关键成分转录水平分析。(B)Col-0与se突变体中MTA和MTB蛋白水平对比图。(C)SE促进MTB相分离的体外荧光共聚焦成像图。(D)SE对MTA和MTB混合物相分离的促进作用成像图。(E)YFP-MTB在Col-0和se-1突变体原生质体中的亚细胞定位。(F)Col-0和se-1突变体中YFP-MTB相关核体数量量化图。(G)Col-0和se突变体中YFP-MTB凝聚物流动性的FRAP实验图。(H)FRAP恢复曲线。

6.SE缺陷导致MTC保留在染色质上并减少其与底物RNA的结合

为了深入了解SE对RNA m⁶A甲基化和miRNA加工的影响，作者进行了一系列的实验。作者发现MTB与miRNA加工复合体的结合以及与MIR位点及其pri-miRNA染色质区域的相互作用对于miRNA的生物合成至关重要。为了探究SE是否影响MTB与染色质和转录本的结合，作者利用ChIP-qPCR和RIP-qPCR技术对野生型和se突变体进行了分析。结果显示，在se-1突变体中，MTB与产生m⁶A甲基化RNA以及miRNA的位点染色质的结合显著增强(图6A-B），同时，MTB与靶转录物（包括编码mRNA和pri-miRNA）的结合能力却明显受损（图6C-D）。这些发现表明，SE的缺失导致MTC异常保留在染色质上，并减少与其底物转录物的结合，从而可能影响m⁶A甲基化和miRNA的生物合成。

总之，作者的研究揭示了RNA m⁶A修饰和miRNA生物发生之间相互调节的先前未知机制(图7)。关键发现是MTB与SE相互作用连接了MTC和miRNA加工复合体。敲低MTB损害miRNA生物发生，SE功能缺失影响修饰。SE能促进MTC的LLPS，SE缺失会导致MTC在染色质上异常保留且结合底物RNA能力下降，表明二者相互作用在基因表达调控中起关键作用。突显了SE蛋白在调控miRNA加工和m⁶A修饰相关无膜细胞器形成过程中的重要性，为理解真核生物中表观遗传调控的复杂性提供了新的视角。

图7:甲基转移酶MTB – SERRATE(MTB-SE)相互作用模块在相互调节miRNA生物合成和m⁶A修饰中的功能工作模型。

投稿日期：2024.7.22

接收日期：2024.8.10

发表日期：2024.8.29

原文链接（点击“阅读原文”）

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