2024年4月，北京大学贾桂芳教授课题组在知名期刊The Plant
Cell上发表了一篇题为The m6A reader ECT8 is
an abiotic stress sensor that accelerates mRNA decay in Arabidopsis的研究论文。作者创制转基因材料并在正常和盐处理条件下对其进行转录组相关的测序分析，发现ECT8的转录水平和蛋白水平在盐胁迫下升高，并且ECT8蛋白丰度的增加导致与m6A修饰相关的mRNA结合能力的增强，从而加速其降解，特别是那些盐胁迫应答的负调控因子的降解。这些发现促进了对表位转录组基因调控的理解，且为在快速变化的环境条件下培育更有抗性的作物提供了潜在的应用。![]()
=== 研究背景 ===
甲基化修饰是RNA的主要修饰之一，在真核生物mRNA中，N6-甲基腺苷 (m6A) 是最丰富的甲基化修饰形式，参与mRNA稳定性、剪接、翻译效率、核质输出等各种mRNA代谢过程，并最终调控植物生长发育及胁迫响应。m6A是一种动态可逆的转录后修饰，其与m6A甲基转移酶 (Writer)、去甲基化酶 (Eraser)和m6A结合蛋白 (Reader)协同作用。有研究表明在拟南芥中破坏m6A Writer或Eraser，使得m6A在mRNA降解中发挥作用。然而，大多数m6A
Reader在植物中的详细机制仍然不清楚，以及它们是否参与这一调控过程仍有待深入研究。在本研究中，作者表明ECT8作为一个非生物胁迫传感器，在拟南芥中加速了mRNA的衰减，为m6A修饰的分子机制及其在植物胁迫反应中的作用提供了有价值的研究视野，对农业和环境适应具有广泛的意义。# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1. ECT8是一种m6A结合蛋白
为了阐明ECT8在拟南芥中的生物学作用，作者对ECT8和含YTH结构域的家族蛋白（YTHDF1至3）进行比对和结构分析，结果发现3个保守色氨酸残基（位于ECT8中的343、404和417位）对YTH结构域中m6A的识别至关重要，形成了一个与其他YTH结构域蛋白质（如YTHDF2）相似的疏水芳香笼（图1A）。为了研究ECT8结合m6A修饰的能力，作者表达并纯化了谷胱甘肽-S-转移酶（GST）标记的全长野生型（WT）ECT8蛋白和具有2个突变（W404A/W417A）的非结合变体（GST-ECT8m）。使用5'-FAM标记的RNA探针（m6A修饰和未修饰）进行的电泳迁移率变化试验（EMSA）清楚地证明了ECT8的m6A结合能力（图1，B和C）。为进一步研究，作者采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术，以拟南芥GST-ECT8蛋白和poly（A）+RNA为模板，建立了体外RNA免疫沉淀（RIP）检测方法。结果显示，与流过组分相比，在GST-ECT8结合的组分中，m6A修饰的poly（A）+RNA显著富集（图1D）。这些结果证实了ECT8在体外对m6A修饰的识别，并强调了保守的色氨酸残基在形成疏水芳香笼是ECT8结合m6A的能力所必需的。为了进一步证实ECT8确实在植物中作为m6A结合蛋白，作者使用在T-DNA插入ect8-1突变体背景下产生的2个天然基因互补系：ProECT8：ECT8-FLAG/ect8-1（称为ECT8/ect8-1）和ProECT8：ECT8m-FLAG/ect8-1（称为ECT8m/ect8-1）转基因植物（S2，A至D），进行了体内RIP试验和UPLC-MS/MS联用。结果表明，与IgG-IP对照相比，ECT8-FLAG-IP成功分离了含有m6A修饰的转录本。另一方面，ECT8m-FLAG-IP及其相应的IgG-IP对照均未显示出这种富集（图1E）。这些共同的发现为ECT8在拟南芥中作为m6A阅读器蛋白发挥功能的结论提供了有力的支持。![]()
图1. ECT 8是拟南芥中一种m6A结合蛋白。A）通过AlphaFold（AF-Q9 FPE 7-F1）模拟的ECT8的结构与公开的m6A（PDB：4 RDN）的复合物中的YTH-YTHDF 2的结构的比较。B）EMSA测定显示GST-ECT8与含有m6A-修饰的UGUAA基序的RNA探针的结合能力，但不与未甲基化的探针结合。C）EMSA测定显示GST-ECT8m对具有UGUAA基序的甲基化和未甲基化RNA探针的结合亲和力均被消除。D）体外RIP-UPLC-MS/MS显示，与输入和流通级分相比，m6A在ECT8结合的mRNA中富集。E）体内FA-RIP-UPLC-MS/MS分别显示，与IgG结合的RNA相比，m6A富集在ECT8-Flag结合的RNA中，但不富集在ECT8m-Flag结合的RNA中。![]()
图S2. T-DNA突变体ect8-1和转基因植物材料表征。A)
ECT8位点和ect8-1 T-DNA插入示意图。B) ECT8/ect8-1和ECT8m/ect8-1的转基因结构示意。C)纯合的ect8-1突变体和WT,野生型。D) ECT8在WT, ect8-1、ECT8/ect8-1、ECT8m/ect8 -1相对表达量的RT-qPCR结果。2.ECT8在花、根和叶中高度表达，并且ECT8定位于细胞质中为了进一步揭示ECT8的分子功能，作者探索了它在拟南芥中的表达模式，得到了proECT8：GUS转基因植物，并发现ECT8在重要的解剖学区域，包括花、根和叶中显著表达（补充图S3A）。在根中，ECT8表现出特异性表达模式，在分生组织区中存在最少，但在根冠、成熟区和伸长区中表达水平较高。在其他组织中，ECT8主要定位于维管组织，而其表达在活跃分裂的区域如花粉和种子中显著减少，表明其在相对成熟的组织中响应外部胁迫的作用。为了更全面地分析其组织特异性模式，作者分析了来自拟南芥RNA-seq数据库中的RNA-seq数据，进一步证实了GUS染色测定中的发现的结果（图S3B）。接着使用ECT8/ect8-1幼苗进一步分离细胞核和细胞质部分，使用组蛋白H3（H3）作为核标记物，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）作为细胞质标记物，发现了ECT8主要定位于细胞质的证据（S3C）。![]()
图S3. ECT8的表达模式和亚细胞定位。A) GUS染色法显示ECT8在不同组织中的表达模式。B)从拟南芥RNA-seq数据库分析ECT8的表达模式。C)蛋白免疫印迹显示ECT8蛋白主要定位于细胞质。对拟南芥RNA-seq数据库的分析显示，与其他YTH家族蛋白相比，ECT8的表达水平在响应各种外部非生物胁迫（包括盐、氧化和干旱胁迫）时显著上调（图S4A）。相反的是，ECT8的表达在黑暗诱导的应激等条件下保持相对稳定。为了更深入地研究ECT8对外部非生物胁迫的响应，作者对WT幼苗进行150 mM NaCl处理。结果显示，在盐胁迫期间，ECT8的mRNA和前体mRNA表达随时间持续增加（图2A）。为了进一步证实盐处理增加ECT8转录，作者对与RT-qPCR偶联的核进行连续测定，以测量完整核中ECT8的相对原位转录速率。通过向细胞核中加入BrUTP进行核连续分析，并用抗BrdU珠富集标记的转录物。结果发现，与正常条件相比，在4小时盐胁迫处理后，ECT8的转录累积显著增加了4倍（图2B）。随后，作者还观察到在盐胁迫下ECT8的蛋白质水平增加（图2C）。这些结果表明，盐胁迫条件下ECT8的转录速率和蛋白表达量增加。至于m6 A Writer和Eraser，与ECT8相反，在4小时150 mM NaCl处理后没有观察到显著的转录变化（图S4、B和C），表明m6A读取器ECT8在很大程度上是盐胁迫的主要响应者，而不是m6A
Writer或Eraser。4.ECT8的m6A结合能力是盐胁迫响应所必需的
在此基础上，作者进一步研究了ECT8在盐胁迫响应中的作用。在正常条件下，ect8-1突变体和WT均显示出无差别的萌发和生长速率（图2，D和E）。然而，当暴露于不同浓度的NaCl（100和150 mM）时，与野生型相比，ect8-1突变体植株表现出发芽延迟、绿色子叶率和存活率降低以及主根长度缩短的表型（图2，D至G;图S4，D至F）。而野生型ECT8的表达可以挽救ect8-1突变体对盐胁迫的超敏感性，ECT8m的表达却不能挽救ect8-1突变体对盐胁迫的超敏感性（图2，D至G;图S4，D至F）。结果发现，ECT8与m6A结合的能力可能参与了盐胁迫响应的调控。![]()
图2. ECT8以m6A依赖性方式参与盐胁迫应答。A）RT-qPCR，用于在盐胁迫期间随时间增加的ECT8 mRNA和前mRNA的表达水平。B）核连续分析表明，在NaCl处理4小时后，ECT8的转录速率显著增加。C）蛋白质免疫印迹，显示在模拟和150 mM盐处理下ECT8蛋白质随时间的相对表达水平。D）在模拟对照和100 mM NaCl处理下，WT与不同转基因植物中盐应答的表型分析。E）在模拟对照和100 mM NaCl处理下，WT与不同转基因植物的发芽率的统计分析。F）在模拟对照和100 mM NaCl处理下，WT与不同转基因植物中根长度的表型分析。G）在模拟对照和100 mM NaCl处理下，WT与不同转基因植物中初生根长度的统计学分析。![]()
S4. ECT8以依赖于m6A的方式进行盐胁迫。A) YTH家庭中ECT8蛋白对各种外界胁迫的敏感性较高的蛋白质。B)热图显示m6A Writer和Eraser的相对表达水平变化。C) RT-qPCR显示150 mM NaCl处理4小时后m6A Writer和Eraser的相对表达量只有轻微增加。D) WT、与不同转基因对盐反应的表型分析。E) 模拟对照和150mm NaCl处理下的WT与不同转基因植株的发芽率统计分析。F)模拟对照、100 mM和150 mM NaCl处理下WT与不同转基因植株存活率的统计分析。5.在正常和盐胁迫条件下，ECT8与m6A修饰的mRNA的3′-UTR结合
考虑到m6A阅读器蛋白的功能严重依赖于其特异性靶基因，作者在正和150 mM NaCl条件下进行了m6A-seq实验，以探索ECT8的分子功能。对结果进行分析发现超过92%的ECT8结合位点与m6A峰重叠，鉴定出5479个ECT8的m6A靶向基因（图3A）。类似地，在盐处理条件下，鉴定了19084个m6A峰和8609个ECT8结合位点，揭示了超过95%的ECT8结合位点具有对应于7270个ECT8 m6A靶向基因的m6A峰（图3B）。对ECT8的m6A靶向基因进行进一步分析，我们发现ECT主要与mRNA相互作用，在两种条件下3′-UTR区域内具有集中的结合分布（图3C）。在植物中发现的已知m6A基序URUAY（R=A或G，Y=C或U）和RRACH（R=A或G，并且H不是G）也在ECT8的结合位点中鉴定（图3D）。6.盐胁迫下ECT8蛋白的升高增强了其与m6A修饰的mRNA的结合能力
为了探索ECT8在盐胁迫下的调节功能，作者研究了盐胁迫是否会改变ECT8的m6A结合模式和能力。结果发现盐胁迫处理不干扰m6A分布模式或ECT8的结合位点（图3E）。值得注意的是，超过60%的ECT8和m6A结合位点在正常和盐胁迫条件之间过度重叠（图3F）。这些表明，ECT8在两种条件下保持较一致的m6A结合模式。然后。作者使用在正常和盐胁迫条件下鉴定的共同的ECT8的m6A靶向基因来评估ECT8在正常和盐胁迫条件下的结合能力。结果显示，与正常条件相比，在盐胁迫条件下，尽管总体m6A丰度在所述条件之间没有差异，ECT8与其m6A靶向基因的结合能力显著增加（图3G）。这表明盐胁迫诱导的ECT8蛋白水平升高增强了其与靶向转录本的相互作用。为了更深入地了解ECT8在应对外部压力中的作用，作者对在正常和盐胁迫下重合的ECT8的m6A靶向基因进行GO途径分析，结果显示在RNA代谢、基因表达调控以及对盐和冷胁迫的响应相关的途径中具有明显富集（图3I）。此外，作者还对特异于正常和盐胁迫条件的独特的ECT8的m6A靶向基因进行了GO分析（图S5I和J），发现只有ECT8的m6A特异性靶基因参与了与渗透压变化和盐胁迫反应相关的途径。这些结果强调了ECT8在应激条件下调节靶向转录物表达水平的综合作用。![]()
图3. .在正常和盐胁迫条件下，ECT8与mRNA的3′UTR区结合。A、B）在正常A）和盐胁迫条件B）下，FA-CLIP鉴定的ECT8结合位点和m6A峰之间的重叠。C）显示在正常和盐胁迫条件下ECT8与m6A结合位点在所示mRNA片段中的区域分布的多基因谱。D）在正常和盐胁迫条件下，基于ECT8和m6A结合位点，通过HOMER软件鉴定的基序。E）在盐胁迫下与在正常条件下相比的ECT8和m6A结合位点的距离的分布。F）描绘在正常和盐条件下鉴定的ECT8和m6A靶向基因的重叠的Venn图。G）在正常和盐条件下ECT8和m6A靶向基因的结合能力的累积图组合箱形图。H）在两种条件下ECT8和m6 A靶向基因的m6A水平的箱形图。I）在两种条件下ECT8和m6 A靶向基因的GO分析.![]()
图S5. .在正常和盐胁迫条件下的独特的ECT8的m6A靶向基因GO分析图7.ECT8加速m6A修饰的mRNA的降解
为了研究由ECT8介导的基因表达调控，作者在正常条件下对12天龄WT和ect8-1幼苗进行链特异性poly（A）+ RNA-seq。将鉴定的转录物分为3组：ECT8靶向基因、ECT8和m6A靶向基因以及非ECT8靶向基因，结果发现与WT相比，在ect8-1中，靶向ECT8的基因和靶向ECT8和m6A的基因都表现出比非靶向ECT8的基因更高的转录物丰度（图4A）。考虑到基因表达的变化主要受转录速率和RNA稳定性的影响，再加上ECT8的细胞质定位（补充图S3C），因此有理由认为ECT8在促进其靶转录物的降解中发挥关键作用。基于对ECT8的研究，作者选择在具有高复制性的不同时间点（0、15、30、60和120分钟）对7天龄WT和ect8-1幼苗进行了全转录组mRNA寿命测序。结果显示，当与非ECT8靶向基因相比时，ECT8靶向基因以及ECT8和m6A靶向基因的转录物在ect8-1中表现出显著更长的半衰期（图4B）。进一步的结果显示，与WT相比，在ect8-1具有更多ECT8结合位点的mRNA表现出比具有更少结合位点的mRNA显著更长的半衰期（图4C）。它强化了ECT8并加速了其结合mRNA降解的假设，并且随着结合位点数量的增加，这种降解过程变得更加明显。考虑到在胁迫下ECT8水平升高，作者探究在盐胁迫条件下是否会有类似的结果。因此，对用150 mM NaCl处理的12天龄WT和ect8-1幼苗进行链特异性poly（A）+RNA-seq。结果显示，在盐条件下，ECT8的分散显著增加了ECT8靶向基因的mRNA丰度，并且ECT8和m6A靶向基因与非ECT8靶向基因的mRNA丰度一致（图S6C），与正常条件下的结果一致。这些结果进一步证实，在正常和盐胁迫条件下，ECT8促进其结合的mRNA的降解。![]()
图4. . ECT8促进m6A修饰的mRNA的降解。A）在模拟条件下，与野生型相比，ect8-1中靶向基因以及非靶向基因的相对mRNA表达的累积分布和箱形图。B）在模拟条件下，与WT相比，ect8-1中靶向基因以及非靶向基因的相对mRNA半衰期的累积分布和箱形图。C）在模拟条件下，与WT相比，ect8-1中具有不同结合位点的ECT8和m6A靶向基因以及非ECT8靶向基因的相对mRNA半衰期的累积分布和箱形图。 8.ECT8通过与P体中的DCP5直接相互作用促进m6A修饰的mRNA衰变
作者通过原生质体共表达实验发现ECT8和P体组分DECAPPING1（DCP1）和DCP5共定位（图5A;图S8B），证实了ECT8定位于P体中。鉴于ECT8促进mRNA降解并定位于P体，作者怀疑与ECT8相互作用的蛋白质可能在mRNA降解中起作用。于是利用酵母双杂交技术（Y2H）筛选了几个负责5′帽结构去除或去腺苷化的候选基因。最终，DCP5和VARICOSE（VARICOSE）被鉴定为ECT 8的P体中的潜在相互作用组分。（图5B）。有研究表明DCP5与其他蛋白质（如XRN、DCP1和DCP2）结合，主要作用是从P体内的mRNA分子中去除保护性5′帽结构，最终导致XRN4降解mRNA。为了验证这一发现，作者进一步通过在烟草叶片中共表达ECT8和DCP5与黄色荧光蛋白（YFP）来进行双分子荧光互补（BiFC）。结果表明，ECT8和DCP5的共表达导致细胞质中强的重构YFP信号（图5C），证实了ECT8和DCP5之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。随后研究了DCP5是否促进ECT8介导m6A修饰的mRNA降解的功能。为了实现这一点，作者分析了已发表的来自dcp5-1突变体及其WT对应物（GSE61812）的poly（A）+RNA-seq数据，将检测到的转录本分为3组：ECT8靶向基因、ECT8和m6A靶向基因以及非ECT8靶向基因。分析显示，DCP5的破坏显著增加了ECT8靶向基因以及ECT8和m6A靶向基因与非ECT8靶向基因的mRNA丰度（图5D），这表明DCP5促进了由ECT8结合的mRNA的降解。通过对mRNA寿命测序分析，结果显示，DCP5、ECT8和m6A靶向基因在ect8-1中具有显著延长的mRNA半衰期（图5E），表明ECT8和DCP5在mRNA降解中的共调节功能。此外，作者选择了4个DCP5靶向基因AT5G13570、AT1G79440、AT3G45970和AT1G03440进行进一步的确认。其中，AT5G13570和AT3G45970已经过验证。FA-CLIP和m6A-seq的结果显示，AT5G13570和AT1G79440转录物上的ECT8结合位点含有m6A修饰，而其他2种转录物缺乏m6A修饰（图5F;图S8F）。mRNA寿命测定显示，AT5G13570和AT1G79440的mRNA半衰期在ect8-1中比在WT中长，但在AT3G45970和AT3G45970中未观察到这种差异（图5G;图S8G）。这些结果共同表明，ECT8利用其m6A结合能力，通过与P体中的DCP5相互作用促进RNA衰变。![]()
图5.
ECT8通过与P体内的DCP5直接相互作用加速m6A修饰的mRNA的降解衰减。 A）共聚焦显微镜显示来自原生质体共表达实验的P体中ECT8-GFP和DCP5-mCherry的共定位。B）Y2H测定，显示出在酵母细胞中ECT8和DCP5之间的物理关联。C）BiFC测定显示了ECT8和DCP5之间的物理关联。D）在模拟条件下，与WT相比，dcp5-1中靶向基因以及非靶向基因的相对表达水平的累积分布和箱形图。E）与正常条件下的WT相比，ect8-1中靶向基因以及非靶向基因的相对mRNA半衰期的累积分布和箱形图。F）显示AT5G13570和AT1G79440转录物上的m6A-seq和FA-CLIP测序结果的整合基因组学查看器（IGV）。FA-CLIP，甲醛交联和免疫沉淀。G）7天龄WT和ect8-1幼苗中AT5G13570和AT1G79440转录物的RNA半衰期。![]()
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图S8.
ECT8和DCP5互作。B)通过原生质体共表达实验，共聚焦显微镜显示了ECT8-GFP和DCP1-mCherry在p体中的共定位。E)表示ECT8和m6A靶基因与的重叠比例的Venn图。F)IGV显示AT3G45970和AT1G03440转录本的m6A-seq和FA-CLIP测序结果。G)AT3G45970和AT1G03440转录本在7d龄WT和ect8-1幼苗中的RNA半衰期。9.ECT8使降低盐胁迫响应的负调节因子的稳定性以增强盐胁迫耐受性
基于上述的研究结果及一些测序分析，作者选择了4种盐胁迫反应的负调节因子：PPRT1、MSI1、BIL1和ENGD-1。值得注意的是，如FA-CLIP和m6A-seq中所示，所有这些转录物在其m6A区域内被ECT8靶向（图6A）。并且观察到ECT8对每个转录本的结合亲和力在盐胁迫条件下比正常条件下增强得多，尽管这两种条件之间m6A水平没有显著变化。为了证实上述观察到的结果，作者在正常和盐胁迫条件下进行了m6A-IP-qPCR和FA-RIP-qPCR。结果表明，PPRT1、MSI1、BIL1和ENGD-1的转录物在两种条件下确实被m6A修饰并直接与ECT8结合（图6，B和C）。此外，与WT相比，这4种转录物的相对表达水平在ect8-1突变体中升高，在盐胁迫下观察到更显著的增加（图6D）。这些结果与测序数据的发现一致，即盐胁迫诱导的ECT8蛋白水平升高导致结合能力升高。ect8-1突变体中PPRT1、MSI1、BIL1和ENGD-1的增加的表达水平可以通过与ECT8互补而不是与m6A结合受损的ECT8m互补来恢复（图6D）。这提供了证据表明ECT8的m6A结合能力是基因调控所必需的，因此也是盐胁迫反应所必需的。之后作者又进行了RT-qPCR分析，并观察到这些靶基因的前mRNA水平没有显著增加（图S10），这些结果共同表明ECT8参与这些代表性转录物的降解过程，但不参与转录调控。考虑到ECT8促进m6A修饰的mRNA的降解，作者进行了mRNA寿命测定以测量盐胁迫响应的这4种负调节物的半衰期。结果显示，在正常和盐胁迫条件下，与WT相比，它们的转录物在ect8-1中降解更慢（图6，E和F）.![]()
图6在盐胁迫条件下，ECT8加快盐胁迫负调节因子的降解。.A）显示PPRT1、MSI1、BIL1和ENGD-1转录物的测序结果的整合基因组学观察器B）m6A-IP-qPCR验证在模拟和盐条件下12天龄WT幼苗中四种盐胁迫负调节因子中m6 A的富集水平。C）FA-RIP-qPCR验证在模拟和盐胁迫条件下，在12天龄的ECT8/ect8-1和ECT8m/ect8
-1幼苗中ECT8对四种盐胁迫负调节因子的结合亲和力。D）在模拟和盐胁迫下，12天龄WT与不同转基因幼苗中四种盐胁迫负调节因子的相对mRNA表达水平。E、F）在模拟E）和盐胁迫F）条件下，7天龄WT和ect8-1幼苗中四种盐胁迫负调节因子的mRNA半衰期。![]()
图S10: ECT8不影响盐胁迫负调控因子的转录。RT-qPCR分析显示，在正常和盐胁迫处理下，这些下游候选基因的pre-mRNA表达水平基本保持不变。=== 总结 ===
综上所述，ECT8作为非生物胁迫传感器，通过与m6A结合并与去封闭蛋白DCP5相互作用，促进靶mRNA在P体中降解。以盐胁迫为例，ECT8的转录和表达水平显著增加。作者推测，盐胁迫诱导的ECT8丰度的增加，可能是通过招募更多的m6A修饰的mRNA进入更多的P体，降解ECT8结合的mRNA，包括盐胁迫应答的负调控因子，最终增强盐胁迫耐受性。图7: ECT8的模型在拟南芥中用作盐胁迫传感器
------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
～ The End! ～
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