2024年9月19日，New Phytologist发表了题为A nitrogen-responsive cytokinin oxidase/dehydrogenase regulates root response to high ammonium in rice的研究论文，文章确定了RR25/26-CKX3是一种细胞分裂素信号模块，通过调控根分生组织和侧根原基中的生长素信号传导来介导根对外部铵态的响应。![]()
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# 思维导图![]()
为了探索高NH4+对根系调控的作用，研究者对在低氮（LN，0.25mMNH4+）和高氮下（HN，2.5mMNH4+）生长的水稻WT幼苗的根组织进行转录组测序，KEGG分析显示，这些由HN供应的协同调控的deg预计参与了氮代谢、次生代谢物的生物合成和氨基酸生物合成相关的途径（图1b）。GO富集分析表明，HN处理会强烈干扰多种生物过程，包括氮同化、氨基酸跨膜转运、乙烯信号通路、离子跨膜转运和碳水化合物代谢过程（图1c）。
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图1.低氮（LN，0.25mMNH4+）和高氮下（HN，2.5mMNH4+）生长的水稻WT幼苗的根组织进行转录组测序结果分析。转录组数据表明NH4+在根中对细胞分裂素脱氢酶（CKX）活性有潜在影响（图1c）。CKX编码基因CKX3在HN处理6小时和24小时后被转录诱导，而CKX4和CKX5的表达水平在HN处理6小时后降低（图2a）。定量实时聚合酶链响应分析证实，24小时处理后HN诱导根中CKX3和CKX8的表达，而对CKX3表达的诱导更为明显（图2b）。进一步的分析表明，HN诱导CKX3的表达在2小时后很明显，并在12小时时达到峰值水平（图2b）。GUS染色显示，在根帽，伸长和分化区的韧皮部细胞中具有很强的启动子活性，但在分生组织区没有（图2c、d、S2）。此外，高NH4+诱导的CKX3表达水平支持其是NH4+处理下水稻根系中的响应基因（图2c，d）。
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图2.NH4+对CKX3在水稻根系中的表达模式影响。（a）在LN和HN处理中的定量结果。（b）在LN和HN条件下生长超过48小时的4-d龄NIP幼苗根中CKX3表达的时间过程分析。（c）在LN和HN条件下生长24h的4d-oldpCKX3：GUS转基因系根中的GUS活性。（d）检测pCKX3：GUS转基因系侧根原基中的GUS。为了探讨CKX3在对NH4+调控水稻根系的响应中的作用，研究者获得了CKX3的敲除突变体和过表达系，并分析了它们在不同NH4+下的根表型条件。研究者发现，与LN条件相比，WT幼苗在HN条件下表现出更短的精根，但LR密度增加（图3a-c）。在CKX3的三个突变体中，精根伸长和LR形成在HN或LN条件下均受到抑制。根部对外部NH4+的敏感性与WT相比，在三个CKX3突变体系中不太明显，这可以通过在HN和LN处理的CKX3突变体之间观察到的相似的LR密度和较小的精根伸长差异来证明（图.3b，c）。
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图3.NH4+对水稻CKX3突变体的根系发育的影响。（a）在LN和HN条件进行7d的处理分析。（b）相对精根长度密度。（c）相对精根长度。研究者进一步比较了不同氮条件下WT和CKX3突变体之间的分生组织长度和细胞数。在LN或HN条件下，与WT相比，CKX3突变体的分生组织长度和细胞数量减少（图4a-c）。重要的是，在HN条件下，WT幼苗的根分生组织细胞数量和分生组织长度均显著降低，而这种差异在三个CKX3突变体中变得更小（图4a-c）。进一步表明，在不同氮条件下CKX3介导的精根伸长是根分生组织细胞分裂活动的结果。
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图4.NH4+对水稻CKX3突变体根分生组织活性的影响。（a）分生组织皮质细胞数。（b）分生组织长度。（c）显著性图。3.CKX3与CKX8在调控根系对铵态响应方面具有相似的功能 序列分析和同源比较表明，CKX3的氨基酸序列与CKX家族的另一个成员CKX8具有高度同一性（59.74%）转录组分析表明，CKX3与CKX8类似，在根中的表达水平都是由HN诱导的（图1d、2a）。这表明CKX3与CKX8在响应NH4+调控根的发育方面具有相似的功能。因此研究者使用CRISPR-Cas9技术生成了CKX3的单个突变体（ckx3-1）和CKX3和CKX8的双突变体（ckx3-1ckx8-1），并将它们的根表型与不同NH4+下的WT进行比较条件。结果表明，CKX3及其同源物CKX8共同调控根发育对外部NH4+的响应。![]()
图5.NH4+对水稻CKX3和CKX8突变体的根系发育的影响。（a）在LN和HN条件进行7d的处理分析。（b）相对精根长度密度。（c）相对精根长度。CK稳态取决于其体内的生物合成和降解。为了研究CKX3和CKX8是否影响内源性CK稳态，研究者量化了不同NH4+下WT、ckx3-1、ckx3-1和ckx3-1ckx8-1根中CKs及其衍生物的含量，包括iP、tZ、cZ、cZR和iPR4+条件。CKs在WT根和不同NH4+下的突变体中表现出不同的丰度条件（图6a）。在HN条件下，WT根中tZ、iPR和总CKs的含量增加，与几个CK生物合成基因的较高表达一致。在LN条件下，WT根和所有突变体中iP含量升高;而其含量在ckx3-1和ckx8-1中相对高于WT，在ckx3-1ckx8-1中更为明显。为了评估ckx3-1中CKs含量的增加是否会引发根中的内源性CK信号传导，研究者生成了CK响应性报告基因系TCSn：GUS并将其引入ckx3-1中。TCSn：GUS信号在根帽和分化区被强烈检测到，但在根分生组织和伸长区不存在。在LN条件下，WT和ckx3-1的根尖区域的TCSn：GUS表达没有明显差异（图6b）然而，TCSn：GUS在根中的表达是由HN诱导的，并且在LN或HN条件下，ckx3-1根显示出比WT更强的TCSn：GUS信号（图6b）这些结果共同表明CKX3在调控根中CK稳态中起着关键作用。图6.NH4+对水稻突变体ckx3-1、ckx3-1和ckx3-1ckx8-1根中细胞分裂素衍生物的含量的影响。（a）在LN和HN条件下7d的处理分析。（b、c）LN和HN条件下生长的4天龄NIP和ckx3-1幼苗的侧根和根尖中TCSn：GUS活性。随后，研究者检测了CKs在ckx3中的积累是否与CKX3介导的根对外部NH4+的反应有关。为了解决这个问题，在LN和HN条件下用外源6-BA和iP处理ckx3-1和WT幼苗。在这两种条件下，外源性6-BA和iP处理导致精根伸长显著减少，并完全阻断了WT和ckx3-1中LR的形成（图7a、b）。当用6-BA或iP处理时，WT和ckx3-1的精根伸长和LR形成对外部NH4+的响应性均被消除（图7a、b）。此外，外源6-BA和iP的应用在6小时处理后诱导了根中CKX3和CKX8的表达（图7c），表明CKX3和CKX8在体内被转录激活以降解过量的CKs。这些结果强调了CKX3和CK稳态在响应NH4+的调节根发育中的重要作用。![]()
图7.LN和HN条件下外源6-BA和iP对水稻CKX3突变体根系表型及CKX3和CKX8表达的影响。（a）图像显示了在LN和HN条件下生长的发芽Nipponbare（NIP）和ckx3-1种子的根表型。（b）通过在LN条件下归一化为野生型。（c）定量4d龄NIP幼苗根中的CKX3表达水平。据报道，B型CK响应调控因子（RRs）能够转录激活CKX，从而调控水稻根系发育。转录组分析显示，编码基因RR22、RR23和RR26的B型RRs在HN6h处理后被转录诱导在WT根部，处理24h后诱导增强。其中，RR26的表达显示NH4+的诱导最高，反映了CKX3对NH4+的转录响应，由此表明了B型RRs和CKX3之间的分子联系。CKX3的启动子区包含推定的RR结合元件“AGATT”的5个重复序列（图8b）。为了研究B型RRs是否可以直接与CKX8的启动子结合，作者在体外进行了Y1H和LUC。两项测试均表明，RR25和RR26都可以与CKX8的启动子结合并激活CKX3表达（图8c-e）。研究者进一步生成了RR25和RR26的两个双敲除突变体并验证了LN和HN条件下NIP根中CKX3和rr25-1rr26-1中的表达水平。结果表明，HN处理导致NIP和rr25-1rr26-1根中CKX3的表达增加，而在LN和HN处理下，rr25-1rr26-1根中CKX3的表达水平低于WT。该结果证实CKX3的表达受RR25和RR26的正向调控。接下来，研究者将突变根表型与WT在不同NH4+条件下进行了比较。在LN或HN条件下，rr25-1rr26-1双突变体的精根比WT略长和LR密度更高。![]()
图8.水稻中B型细胞分裂素响应调控因子RR25和RR26的表达和CKX3在根中对外部NH4+响应中的调控。（a）HN和LN处理6小时和24小时后的状况。（b）CKX3启动子中细胞分裂素响应元件的序列和位置（c）酵母单杂交（d）LUC（e）转录激活（f）NIP和rr25-1rr26-1幼苗根中CKX3表达水平的定量。7.CKX3介导的根对NH4+响应的调控涉及生长素信号传导已知CK与生长素起拮抗作用以调控根发育。然而，目前尚不清楚在不同NH4+下，生长素与CK的相互作用。为了研究这一点，研究者将生长素响应报告基因DR5rev：3xVENUS-N7引入ckx3-1中，并量化其在不同NH4+下根组织中的表达模式条件在LN条件下，DR5信号在WT幼苗的根柱中升高，而在根表皮细胞中降低（图9a，b）。在ckx3-1中，在LN或HN条件下，柱状细胞和表皮细胞中的DR5信号都显著降低（图9a，b）。在下一个实验中，研究者分析了不同NH4+条件下外源6-BA和iP对WT和ckx3-1中DR5表达的影响。IP或6-BA在很大程度上抑制了WT幼苗根柱细胞中LN诱导的DR5信号（图9a，b）。考虑到iP或6-BA对根伸长的抑制作用，ckx3-1中CK水平升高可能通过减弱柱中的生长素信号来抑制根伸长。
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图9.水稻中B型细胞分裂素响应调控因子RR25和RR26的表达和CKX3在根中对外部NH4+响应中的调控。（a）HN和LN处理6小时和24小时后的状况。（b）CKX3启动子中细胞分裂素响应元件的序列和位置。（c）酵母单杂交。（d）LUC（e）转录激活（f）NIP和rr25-1rr26-1幼苗根中CKX3表达水平的定量。作者进一步分析了DR5在LR原基中的表达模式。与LN条件相比，在HN条件下WT的LR原基中的DR5表达较低。此外，在HN和LN条件下，ckx3-1中LR原基中的DR5表达在ckx3-1中进一步降低（图10a，b）。此外，iP和6-BA处理显著降低了WT幼苗LR原基中DR5的表达，类似于ckx3-1中的DR5表达模式。因此，CKX3介导的CK稳态可能影响生长素信号传导以调控根对外部NH4+的响应。
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图10.NH4+的影响以及外源细胞分裂素对水稻CKX3突变体根尖DR5表达的影响。（a）在LN（低NH4+）和HN（高NH4+）条件下，在存在和不存在10nM6-BA或iP的情况。（b）所示幼苗的根表皮和柱中DR5rev：3xVENUS-N7信号的定量。
根系结构是植物生长潜力的重要决定因素，因为它在养分吸收和避免压力方面起着重要作用。然而，高NH4+供应严重抑制植物根系生长，限制根系从深层土壤中吸收养分和水分。了解潜在的调控机制和确定调控因素具有重要的农艺意义。在这项研究中，通过对经不同浓度NH4+处理的根组织进行全基因组转录组分析，研究者确定了高NH4+响应基因CKX3作为根发育的关键调控因子，并且CKX3在根部对高NH4+的响应过程中通过调控内源性CK稳态和生长素信号转导具有重要作用。![]()
期刊：New Phytologis
接受日期：2023.8.27
发表日期：2024.09.19
评述：王徐泽
编辑：吴凤霞
校对：项珩喆
