2024年7月北京林业大学郭慧红研究团队在Journal of Experimental Botany发表了题为PagHAM4a-PagSCL21 and PagHAM4b-PagTCP20 modules positively regulate cambial activity and its differentiation into secondary xylem in poplar的研究论文，文章揭示了两个新的模块以杨树形成层活性及其向次生木质部的分化。![]()
# 思维导图：
![]()
#根据原文整理，以原文为准，欢迎指正！
|
=== 研究结果 ===
1. PagHAM4a/b表达模式确定
作者鉴定出两个基因(Potri.005G125800和Potri.007G029200)为AtHAM4的假定直系同源物。采用邻接法对模式植物拟南芥和毛果杨的PagHAM4a、PagHAM4b及其同源物HAM1-HAM4进行了系统发育分析。拟南芥和毛果杨的HAM1、HAM2和HAM3同源物聚类在I组中，而PagHAM4a和PagHAM4b与拟南芥和毛果杨的HAM4同源物聚类在II组中（图1A）。在II组中，PagHAM4a与PtrHAM4a聚类在一起，PagHAM4b与PtrHAM4b聚类在一起（图1A）。为了研究PagHAM4a和PagHAM4b的表达模式，利用实时定量PCR（RT-qPCR）分析了这两个基因在‘84K’杨不同组织中的相对转录水平。在所有检测的组织中均检测到了PagHAM4a和PagHAM4b转录本，其中茎中的丰度最高，其次是叶中的丰度，根中的丰度最低（图1B）。还发现，成熟茎中PagHAM4a和PagHAM4b的转录水平远高于幼茎中的转录水平（图1B）。为了进一步研究PagHAM4a和PagHAM4b的特定空间表达模式，分别将含有GUS报告基因上游的PagHAM4a或PagHAM4b启动子的构建体转化到‘84K’杨树中。在转基因杨树的茎、叶和根中检测到了GUS活性（图1C，D），这与RT-qPCR的结果一致（图1B）。值得注意的是，GUS活性在次生茎的形成层和相邻的维管细胞中最高（图1C）。![]()
图1.拟南芥和杨树中的HAM家族以及‘84K’杨树中PagHAM4a/b的表达模式。
（A）HAM家族的系统发育分析。（B）实时定量PCR(RT-qPCR)表达情况(C-D) GUS报告基因的组织染色。
2. 在‘84K’杨树中过表达和CRISPR-Cas9敲除PagHAM4a和PagHAM4b为了研究PagHAM4a和PagHAM4b基因在次级维管组织形成中的作用，作者在CaMV35S启动子的控制下，在‘84K’杨树中过表达了PagHAM4a和PagHAM4b。为了进行表型分析，选择了与野生型(WT)相比生长显著增加的代表性PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE品系，并将其种植在温室中3个月（图2A）。PagHAM4a-OE转基因植株的株高和茎粗分别增加了55%和30%，PagHAM4b-OE转基因植株的株高和茎粗分别增加了40%和20%（图2E、F）。转基因植株的表型效应与PagHAM4a和PagHAM4b的表达水平呈正相关，即两个基因表达水平越高，正向表型效应越明显(图2)，转基因植株的次生木质部发育得到促进(图2B、G)。与野生型相比，PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE转基因植物茎基部次生木质部的宽度分别增加了65%和49%（图2G）。为了研究转基因植物中次生木质部宽度的增加是由细胞数量增加还是细胞扩张引起的，作者计数并测量了转基因植物和野生型植物中次生木质部细胞的数量和大小。与野生型相比，PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE转基因植物都产生了更多的次生木质部细胞（图2H），但在次生壁厚度以及导管和纤维的细胞大小方面没有显示出任何显著差异（图2D、J、K）。为此，进一步研究了转基因植物和野生型的形成层区，作者发现与野生型相比，转基因植物的形成层区宽度增加，细胞层数增多（图2C，I）。这些结果表明，转基因植物中次生木质部发育增强是由于形成层活性增强，促进了向次生木质部的分化。![]()
图2.PagHAM4a和PagHAM4b过表达杨树的表型。
（A）3个月大的野生型(WT)和PagHAM4a和PagHAM4b过表达植株（B-C）茎段横截面及形成层（D）木质部导管和纤维的TEM。（E-I）WT、PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE杨树品系的植物高度、茎直径、木质部宽度等（J-K）次生壁厚度
为了进一步研究PagHAM4a和PagHAM4b的功能及其功能冗余，作者使用CRISPR-Cas9技术生成了pagham4a和pagham4b单突变体以及pagham4a;b双突变体。与WT相比，所有突变体均表现出植物高度、茎直径、节间数和长度以及叶片大小的显着降低（图3A，B，E，F）。pagham4a突变体的株高和茎粗分别降低了47.60%和26.51%（图3E，F），pagham4b突变体的株高和茎粗分别降低了34.73%和21.95%（图3E，F），这表明pagham4a突变体可能比pagham4b突变体遭受更严重的生长抑制。与WT相比，pagham4a;b双突变体的株高和茎粗分别降低了62.85%和35.57%（图3E，F），比pagham4a和pagham4b单突变体遭受的生长抑制更严重（图3E，F）。进一步解剖观察发现，与野生型相比，pagham4a、pagham4b和pagham4a;b的次生木质部宽度分别减少了31.84%、26.95%和41.67%，木质部细胞层数减少（图3G）,突变体形成层区细胞层数减少，导致形成层宽度减小（图3C、H）。![]()
图3.84K杨树中PagHAM4a和PagHAM4b单突变体和双突变体的表型。
（A）PagHAM4a和PagHAM4b敲除突变体矮化表型。（B）WT和突变体植株基茎的横截面图（C）形成层表型观察（D）木质部导管和纤维的TEM。（E-H）植株高度、茎直径、木质部宽度和形成层细胞层数据(I-J)导管和纤维的次生壁厚度数据
3.PagHAM4a和PagHAM4b激活PagSCL21和PagTCP20表达
为了鉴定PagHAM4a和PagHAM4b的靶基因，作者以野生型植物为对照，分析了刚开始二次生长（第1阶段）和已发生显著二次生长（第2阶段）的转基因植物茎样本的转录谱。在PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE转基因植物茎样本中分别鉴定出3,819个和3,120个DEG。其中，在PagHAM4a-OE转基因植物的发育第1阶段和第2阶段分别鉴定出3,684个（2,204个上调/1,480个下调）和135个（43个上调/92个下调）DEG。在PagHAM4b-OE转基因植株的发育第1阶段和第2阶段分别鉴定出1,696个（1,023个上调/673个下调）和1,424个（571个上调/853个下调）DEG。的分析表明，这些DEG主要存在于PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE转基因植株的发育第1阶段，在此阶段形成层刚刚开始二次生长，其中上调的基因多于下调的基因。还发现，在PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE转基因植物的第1阶段，总共5,380个DEG中有4,908个是不同的，而转基因植物的第2阶段，总共1,559个DEG中有1,532个是不同的。这些发现表明，PagHAM4a和PagHAM4b可能通过不同的途径调节‘84K’杨树茎中的二次生长。基于上述分析，作者重点研究了PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE转基因植物第1阶段中存在的上调转录因子，并研究了PagHAM4a和PagHAM4b介导的转录调控网络。使用JASPAR在线程序（https://jaspar.genereg.net/）预测第1阶段上调转录因子启动子序列与PagHAM4a或PagHAM4b的结合位点。在前10个候选靶基因中，基于结合位点的评分、基因表达的丰度和上调倍数以及候选靶基因或其家族成员的先前功能研究等综合考虑，预测PagSCL21和PagTCP20分别是PagHAM4a和PagHAM4b最可能的靶基因。发现，与WT相比，PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE转基因植物的第1阶段中PagSCL21和PagTCP20的表达水平显著上调，而两种转基因植物的第2阶段中没有观察到显著变化。为了验证上述预测，作者分别以PagHAM4a和PagHAM4b的CDS为诱饵，以PagSCL21和PagTCP20的上游启动子序列为猎物进行了酵母单杂交（Y1H）实验。所有酵母转化子在缺乏AbA的合成dropout（SD）（-Leu/Ura）培养基中均生长良好，然而，在添加400ngml-1AbA后，只有与pAbAi-PagSCL21pro和pGADT7-PagHAM4a共转化的酵母，以及与pAbAi-PagTCP20pro和pGADT7-PagHAM4b共转化的酵母生长正常（图4A，B）。这些结果表明PagHAM4a可以与PagSCL21启动子结合，而PagHAM4b可以与PagTCP20启动子结合。采用双荧光素酶报告基因（DLR）检测进一步验证PagHAM4a和PagHAM4b是否能够分别激活PagSCL21和PagTCP20的表达。将PagSCL21和PagTCP20启动子分别与萤火虫荧光素酶（LUC）报告基因融合，与35S::PagHAM4a、35S::PagHAM4b或空载体共转化到本氏烟叶片中。与对照相比，35S::PagHAM4a和PagSCL21pro::LUC共转化的本氏烟叶片中的LUC活性显著升高，35S::PagHAM4b和PagTCP20pro::LUC共转化的本氏烟叶片中的LUC活性显著升高（图4C、D）。这些结果通过LUC互补成像分析得到证实（图4E、F）。进一步的ChIP-qPCR表明，与WT相比，ChIP中的PagSCL21和PagTCP20启动子片段分别在PagHAM4a-3×Flag和PagHAM4b-3×Flag植物中显著富集（图4G、H）。这些结果证实了PagHAM4a和PagHAM4b分别可以在体内与PagSCL21和PagTCP20启动子结合。![]()
图4.PagHAM4a和PagHAM4b分别在体外和体内激活PagSCL21和PagTCP20。
（A-B）酵母单杂交试验证明PagHAM4a和PagHAM4b体外激活PagSCL21和PagTCP20（C-F）双荧光素酶报告证明PagHAM4a和PagHAM4b体内激活PagSCL21和PagTCP20(G-H)ChIP-qPCR检测PagHAM4a、b与PagSCL21和PagTCP20启动子的结合
4.PagSCL21和PagTCP20在‘84K’杨树中的过度表达
为了研究PagSCL21和PagTCP20的功能，作者从‘84K’杨树茎的互补DNA(cDNA)文库中克隆了这两个基因。在‘84K’杨树中过表达了PagSCL21和PagTCP20（PagSCL21-OE和PagTCP20-OE），并观察了从转基因植物中收集的第12个节间的解剖结构。与野生型相比，PagSCL21-OE和PagTCP20-OE转基因植株茎直径和次生木质部宽度显著增加，次生木质部和形成层的细胞层数增多（图5A，D-F），与PagHAM4a-OE和PagHAM4b-OE转基因植株的表型相似。进一步发现，与野生型相比，PagSCL21-OE转基因植株导管和纤维的次生壁厚度、细胞大小没有显著差异（图5H，I），而在PagTCP20-OE转基因植株中，纤维的大小减小，但纤维的次生壁宽度增加（图5H，I）。此外，检测到PagTCP20-OE转基因植物中PagWND6的表达水平显著增加。![]()
图5.PagSCL21和PagTCP20过表达杨树的表型。
（A）PagSCL21-OE和PagTCP20-OE植物基茎的横截面。（B）PagSCL21-OE和PagTCP20-OE植株形成层表型（C）木质部导管和纤维的TEM。(D-G)茎直径、木质部宽度、木质部和形成层细胞层数(H-I)导管和纤维次生壁厚度
=== 总结 ===
综上所述，作者确定了PagHAM4a和PagHAM4b是‘84K’杨树茎中形成层分化为次生木质部的正调控因子。PagHAM4a和PagHAM4b表达的上调可显著促进杨树茎的径向增厚，表明这两个基因是增加树木生物量的潜在靶标。本研究还阐明了PagHAM4a和PagHAM4b及其靶基因PagSCL21和PagTCP20对‘84K’杨树茎中形成层活动及其向次生木质部分化的作用机制，为了解次生木质部形成的复杂调控网络提供了新的见解，这些新见解为通过分子设计育种提高树木生物量提供了更多的选择。此外，研究还表明PagHAM4a-PagSCL21和PagHAM4b-PagTCP20 模块与其他转录因子家族成员协同调节次生木质部的形成（图6）。![]()
图6.杨树中HAM4a和HAM4b介导的次生木质部形成的模型。
HAM4a直接激活SCL21表达，促进形成层分化为次生木质部。而HAM4b直接激活TCP20表达，然后TCP20激活WND6转录，并与由ARF7和HD-ZIPIII转录因子HB4激活的WOX4相互作用，促进形成层活动和形成层分化为次生木质部。
期刊：Journal of Experimental Botany------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
～ The End! ～
![]()
