2023年2月9日，美国William Gordon-Kamm团队在Nature Plants上发表了一篇题为“Leaf transformation for efficient random integration and targeted genome modification in maize and sorghum”的研究论文，该研究证明增强Wus2/Bbm的表达可显著改善玉米和高粱的叶片转化，从而使Cas9介导的基因缺失和靶向基因插入的植物得以恢复，并使用玉米优化的Wus2/Bbm构建体，在四个禾本科亚科的八个物种中成功产生了胚性愈伤组织和再生植株，这为禾本科植物转化和基因组编辑提供了新的方法。![]()
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禾本科植物的转化传统上依赖于未成熟的胚胎，因此仅限于少数主要禾本科作物。人们已经探索了包括叶组织在内的其他转化外植体，但成功率较低，这是阻碍基因组编辑在作物改良中广泛应用的主要因素之一。最近，使用形态发生基因Wuschel2(Wus2)和Babyboom(Bbm)的叶片转化已成功用于Cas9介导的诱变，但需要筛选大量再生植物的复杂基因组编辑应用仍然难以实现。Wus2和Bbm的使用扩大了用于转化的替代外植体的范围，然而，还需要进一步改进以提高转化频率、扩展禾本科植物中的方法并最终实现更复杂的基因组编辑应用。因此，作者叶转化的新目标是识别和评估启动子和组织培养条件，以实现快速叶转化和植物再生，并提高复杂基因组编辑应用（例如靶向基因插入）的效率。![]()
# 思维导图![]()
为了评估改善和加速叶中胚发生反应为目的的启动子组合，作者使用了根癌农杆菌菌株携带辅助质粒PHP71539（pVIR9）和二元供体载体PHP96037（图1a），用于转化Pioneer玉米品系PH1V69幼苗下部的叶组织。以叶片碎片产生的愈伤组织或直接体细胞胚的数量作为标准来评估调节Wus2和Bbm表达的启动子的各种组合（如图2所示）。表1中总结了玉米自交系PH1V69的实验结果。在所有测试的构建体中，PHP96037和PHP97334始终表现出强烈且快速的生长反应，并被选择用于进一步的实验。![]()
图1.农杆菌介导的玉米叶转化实验中使用的T-DNA构建体的示意图。(a)随机整合实验中使用的T-DNA载体。(b)用于Cas9介导的Wx1缺失的T-DNA载体。(c)Cas9介导的靶向基因插入实验的描述。
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图2.评价转化叶组织中体细胞胚形成的评分方法。这些图像显示了农杆菌感染14天后荧光细胞和体细胞胚胎生长评分的示例。
2.农杆菌介导的玉米幼苗叶组织转化
为了评估整个叶组织转化过程（包括T0植物再生），包含Wus2、Bbm、Cre、荧光标记基因(ZsGreen1)和选择性标记基因（高抗性ZmAls或NptII的双元载体）与缺乏Wus2/Bbm的对照载体(PHP86491)进行比较（图1a）。引入LoxP位点，允许在T0植物再生之前切除Wus2/Bbm和Cre表达盒。幼苗准备和转化过程如图3所示。表面灭菌的种子在琼脂固化培养基上发芽14天（图3a-c），然后中胚轴上方约3厘米的叶组织（图3d））被纵向平分并在食品加工机中机械切碎，同时浸入农杆菌中悬浮液（图3e）。将叶碎片分布在滤纸上并置于共培养培养基上24小时，然后置于静息培养基(RM)上7天(图3f)。感染后约7-10天，从叶子碎片中观察到绿色荧光体细胞胚胎形成（图3g）。在滤纸上选择三周后（图3h），将含有组织的板移入45°C培养箱中两小时以诱导Cre介导的切除，然后将健康胚胎发生组织的单块转移至成熟培养基（图3i），最后到生根培养基（图3j），在转移到温室土壤之前完成幼苗发育。体细胞胚胎的起源（扩展数据图1a，b）是从内部叶细胞开始（扩展数据图1d-f））。体细胞胚胎最终从叶子表面长出后这些簇继续生长（扩展数据图1c，f）。表2a显示了使用载体PHP96037进行的四次实验中玉米硬茎(SS)自交系PH1V69的叶组织转化结果。在四次重复中，每次从用于生成叶子片段的十棵幼苗开始，回收的转基因T0植物的数量从6株（实验1和4）到14株（实验2）不等，导致平均转化频率为98±43%（根据每个起始幼苗的T0再生体数量计算）。在使用对照载体PHP86491的三个重复处理中（图1a），观察到与其他含有Ubi::ZsGreen1的质粒相当的T-DNA传递，但这些叶片中没有发生绿色荧光体细胞胚形成，也没有转基因T0使用相同的转化方案回收植物。这些叶转化实验产生了高百分比（从0%到57%，平均值为36±25%）的高质量T0再生体，其具有单拷贝的整合T-DNA（包含选择性和荧光标记基因），并且通过定量PCR(qPCR)确定没有插入到其他位置的主链序列。将转基因植株的数量与这些实验中使用的起始幼苗的数量进行比较，可以清楚地衡量生产单拷贝T0植物的总体效率，平均频率为40±29%。单拷贝转基因再生体在温室中生长至成熟。T0植物表型与野生型（非转基因）种子植物相当。![]()
图3.用于玉米的叶转化方法。(a)玉米种子的表面灭菌。(b)在发芽培养基上的玉米种子。(c)十四天大的玉米幼苗用作外植体来源。(d)在中胚轴正上方制备3厘米的叶轮片段，然后纵向切片组织(未显示)。(e)将组织放入迷你搅拌机中的100 ml农杆菌悬浮液中，并进行十次短暂脉冲以进一步切片叶组织。(f)叶碎片分布在固体RM上的滤纸上。(g)农杆菌感染后7-10天观察到的荧光体细胞胚胎生长。(h)在RM上培养后，将叶组织转移至选择培养基中。(i)在选择培养基上的滤纸上三周后，将组织转移至成熟培养基并再培养三周。(j)在生根培养基上两周后T0再生体的形成。
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扩展图1.体细胞胚胎的早期生长。(a)农杆菌感染PHP97334四天后ZsGreen1瞬时表达的荧光图像。(b)随着体细胞胚胎在感染后九天开始生长，生长的独立荧光灶。(c)感染后九天的更高放大倍数显示从叶子表面出现的荧光体细胞胚胎。(d)分裂细胞的小簇，描绘感染后五天叶段中早期发育的体细胞胚胎(箭头)。(e)分裂细胞簇感染后十天，细胞准备穿过叶段的表皮层。(f)感染后15天，较大的体细胞胚推动叶段中的叶片表面（箭头）。
3.玉米幼苗生长和热处理过程中的嘧啶醇（Acymidol）可提高叶片转化频率
在幼苗快速生长过程中，叶子经常接触生长容器的盖子，导致组织坏死和酚类物质的产生。为了缓解这个问题，作者在发芽和幼苗生长培养基中添加了ancymidol（一种赤霉素调节伸长的拮抗剂），以产生更短、更紧凑的幼苗。此外，作者观察到，用PHP97334载体证明，对幼苗进行acymidol预处理可以提高转化频率，该载体含有与PHP96037中相同的Wus2、Bbm、Cre和ZsGreen1表达盒的T-DNA，只是用SiUbi::NptII取代了SbAls::ZmHra作为选择标记基因（图1a）。对于在三种不同培养基上使用三个独立种植的幼苗进行的三个重复实验（表2b），在没有acymidol（对照）的情况下生长的幼苗平均转化频率为103±6%，而在2 mg/L和4 mg/L ancymidol上生长的幼苗的平均转化频率分别为299 ± 50%和246 ± 9%。两种ancymidol处理之间没有显著差异(P=0.32)，但显著高于对照（P<0.02）。所有三种处理（使用0、2和4mg/Lancymidol预处理）都产生T0植物。温度处理可以对下游转化结果产生积极影响，在28°C下在补充有2 mg/L ancymidol的培养基上生长的PH1V69幼苗子集在45°C下孵育和70%相对湿度（RH）三小时，如表2c所示，对照处理的平均转化频率为260±101%。在45°C下预处理幼苗3小时，转化频率显著提高，达到560±85%(P=0.002)。![]()
表2.玉米自交系PH1V69叶片(a–c)和高粱品种Tx430(d)农杆菌感染后的转化频率（转基因T0植株占起始幼苗的百分比）、单拷贝频率和逃逸频率。(a)根据再生的推定T0植物数量相对于用于转化的起始幼苗。(b)根据含有单拷贝T-DNA且无表达质粒主链的T0植物数量相对于分析的T0植物数量。(c)总体SC/BB无频率基于含有单拷贝T-DNA且无表达质粒骨架的T0植物数量，相对于转化的起始幼苗数量。(d)根据非转基因植物数量相对于分析的T0植物总数进行计算
4.适合高粱农杆菌介导的幼苗叶片转化
为了测试另一种作物中的玉米叶转化方法，作者使用相同的农杆菌菌株、构建体、幼苗生长、叶材料的制备、感染、共培养、静息培养、选择、Wus2/Bbm切除、体细胞胚成熟和生根的高粱叶转化培养基。此外，在这组实验中，作者比较了两种静息培养基(RM)：13266P培养基加50 mg/L美罗培南和RM+CB（100 μM硫酸铜和0.5 mg/L苄氨基嘌呤）。四种高粱（Tx430品种）实验的结果如表2d所示。使用PHP96037载体进行的高粱叶转化产生了高再生频率，根据每个起始幼苗回收的转基因T0植物的数量计算，RM和RM+CB的平均频率分别为166±96%和297±126%，两种没有显著差异。T-DNA中不含Wus2/Bbm的对照处理(PHP86491)未产生再生植物。用PHP96037转化时，高质量T0高粱植株的平均频率在35%至37%之间，两种培养基之间没有显著差。通过快速叶转化产生的二十三个单拷贝T0高粱植物在温室中生长至成熟。这些植物是健康的，表现出与野生型Tx430植物相似的整体表型。5.叶片转化导致玉米基因缺失效率分析
为了评估玉米自交系PH1V69幼苗衍生的叶组织中基因缺失的效率，作者使用了T-DNA载体（PHP98784，图1b）。在这些实验中，在近交系PH1V69的发芽培养基中使用2mg/L ancymidol，并在农杆菌感染之前对幼苗进行三小时热预处理。表3总结了三个Wx1缺失实验的结果。观察到的高转化频率为636%、544%和363%，平均值为514±139%。对T0植物进行的定量PCR分析表明，这三个实验的缺失频率分别为4.4%、8.1%和8.0%，平均值为6.8±1.7%。![]()
表3.在使用PHP98784进行农杆菌介导的叶片转化之前进行热预处理后，玉米自交系PH1V69中的转化效率和Cas9介导的Wx1基因缺失频率。
6.叶片转化能在玉米中有效促进HDR介导的靶向基因插入
为了测试玉米叶细胞中HDR介导的靶向基因插入，构建了两个几乎相同的T-DNA载体（PHP99721和PHP103735）。幼苗在含有cymidol的发芽培养基上生长，总共进行了五次实验。实验1-4在近交系PH1V69上进行，而实验5使用近交系PHR03进行。在实验1中，没有对幼苗进行热预处理，而在实验2和3中，一半幼苗在农杆菌感染前暴露于45℃、70%RH下3小时，另一半幼苗没有进行热预处理。在实验4和5中，所有幼苗都经过热预处理。在实验1、2、3和5中，NptII（供体模板内）用作选择性标记基因。在实验4中，使用G418作为选择剂（对于NptII）再生一组T0植物，而第二组植物在含有胺苯磺隆的培养基上再生（对于Hra）。所有五个实验的结果总结在表4中。当使用温度预处理时，转化频率显著增加(P=0.001)，分别达到560%、570%和524%。逃逸率（未检测到选择性标记基因的再生体数量）范围为9.0%至10.9%。仅HR1或HR2连接点qPCR呈阳性的T0植物范围在5%至12.6%之间。两个连接处均呈阳性的T0植物（表4中的HR1和HR2列）表明，四个实验中的目标插入频率相似；未经热处理时分别为4.5%、6.8%和5.2%，经预处理时分别为7.0%、5.6%和5.0%，未经热处理和热处理的重复，频率非常相似。这些结果清楚地表明，尽管热预处理导致T0植物的初始恢复显著增加，但目标基因插入频率非常一致。此外，实验1-3中未经热预处理重复的频率分别为72%、41%和58%，而对于热预处理重复，该值分别为40%和45%。作者使用位于供体模板内部的两种不同选择标记基因比较靶向插入频率，比较这两种处理，在含有G418的培养基上选择时为524%（逃逸频率为9.8%），在含有胺苯磺隆的培养基上选择时为579%（逃逸频率为12.6%）。对于用供体模板内的选择性标记基因进行的处理，阳性事件的频率为5.0%，与前三个实验中观察到的频率相似。相比之下，当选择性标记基因位于供体模板之外时，目标基因插入事件的频率较低，为2.9%。两组的长PCR阳性事件发生率分别为2.6%和1.5%。实验5使用相同的T-DNA设计和NptII作为选择性标记基因，转化频率为205%（逃逸频率为9.6%），而HR1和HR2的组合率为2.2%，最终长PCR频率为1.2%。为了评估基于HDR的靶向整合的传递和分离模式，作者使用qPCR分析了实验1中三个T0插入事件的32个T1植物（表4），以确定基因插入和T-DNA成分（Cas9、gRNA、Bbm）的存在情况。对来自十个T1选择植物（三个或四个植物对应三个T0事件）的长PCR产物进行测序并组装成重叠群。所有10个重叠群的比较显示没有序列变异，证实每株植物都有精确的HDR介导的基因插入。![]()
表4.使用含有Wus2/Bbm/Cas9/gRNA和侧翼同源区（HR1和HR2）供体模板的T-DNA进行农杆菌介导转化后，通过HDR分析玉米自交系PH1V69和PHR03中的靶向整合，以及NptII选择标记作为供体序列。
7.禾本科植物中几个物种的叶片转化
受到玉米和高粱研究结果的鼓舞，作者使用禾本科植物的九个物种对叶片转化进行了初步评估，包括画眉草、柳枝稷、美洲千尾草、狐尾草、先锋春小麦、黑麦、大麦、甘蔗和水稻（图4a）。本次评估使用了针对玉米优化的方法，但未对幼苗进行acymidol或热处理。从幼苗的基部收获叶组织，并手动切成1.5至3毫米的碎片（扩展数据图2）。然后用含有PHP97334的农杆菌感染叶片（图1a）。不同物种/品种使用6至120棵幼苗（某些物种的数量较少是由于起始材料的可用性有限）。使用荧光显微镜评估感染后四到五天的ZsGreen1表达，作者在所有测试的物种中观察到良好的T-DNA传递（图4b，左侧显微照片）。叶组织进一步培养四到五周产生荧光胚性愈伤组织（图4b）。Wus2/Bbm切除后，将组织在胚胎成熟培养基上培养三周，然后在生根培养基上培养两周，此时拍摄再生植株的照片（图4b，右图）。在所有测试的物种中都产生了胚性愈伤组织并且在九个物种中的七个中再生了具有健康芽和根的T0小植株（图4b）。小麦和甘蔗这两个物种未能产生T0植物。![]()
扩展图2.外植体的准备和感染。(a)将农杆菌悬浮液等分到六孔培养板中的渗透性培养插入物中。(b)玉米幼苗描绘了为手动外植体准备而收获的区域。(c)在农杆菌悬浮液中手动切割叶组织外植体。(d-e)渗透性培养插入物中的叶组织，过量的农杆菌悬浮液被吸掉，叶组织在位于固体培养基表面的滤纸上培养。
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图4.使用玉米叶转化方案转化的选定草种。(a)实验中使用的物种和相应的亚科。(b)所有成功转化草种的结果。
作者的结果清楚地证明增强Wus2/Bbm的表达可显著改善玉米和高粱的叶片转化，从而使Cas9介导的基因缺失和靶向基因插入的植物得以恢复，作者展示了该方法在玉米转基因的T0植物生产和基因组编辑方面的高效率潜力。此外，使用玉米优化的Wus2/Bbm构建体，在四个禾本科亚科的八个物种中成功产生了胚性愈伤组织和再生植株，这表明这可能会导致禾本科植物转化和基因组编辑的通用家族范围。作者的方法可用于多种禾本科植物，从而为在整个禾本科家族中扩展转化和基因组编辑方法提供了可能性。
期刊：Nature Plants
投稿日期：2022.08.22
接收日期：2022.12.21
发表日期：2023.02.09
评述/编辑：吴凤霞
校对：朱晨昊
