2024年6月，西北农林科技大学李超和马锋旺教授团队在著名期刊The Plant Cell上发表一篇题为The MdHSC70–MdWRKY75 module mediates basal apple
thermotolerance by regulating the expression of heat shock factor genes的文章。作者创制了苹果MdWRKY75、MdHsfs、MdHSC70相关的转基因株系，利用DAB、NBT组织染色，测定总叶绿素含量、相对电解质渗透率等参数验证其对苹果的耐热性的影响。通过RNA-Seq、EMSA 、Y1H、GUS染色等实验验证MdWRKY75对MdHsfs的调控作用。通过Y2H、Split-LUC、BiFC、pull-down等实验验证MdHSC70-MdWRKY75互作关系。进一步阐述MdWRKY75和MdHSC70的作用关系，完善了苹果响应热胁迫的调控机制。![]()
近年来，苹果种植经常面临高温，高温会破坏光感受，降低叶绿素含量和水分利用效率，导致气孔关闭和活性氧积累增加。这些效应抑制植物生长并导致作物减产，因此探究苹果响应热胁迫的机制至关重要。WRKY家族在植物的热胁迫响应中起着至关重要的作用。百合中Ll WRKY22通过激活Ll DREB2B的表达成功诱导耐热性。水稻中WRKY10与VQ8互作，提高其耐热性。热激蛋白(HSPs)是一类分子伴侣，是植物响应热胁迫的核心转录因子，在热胁迫条件下，热激转录因子(Hsfs)磷酸化，进而调控HSPs的表达，维持细胞的稳态并增加植物的耐热性。此外，研究表明WRKY蛋白也调控着HSPs的表达。![]()
# 思维导图
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1、MdWRKY75提高了苹果的耐热性
作者发现，当苹果植株暴露于热胁迫时，MdWRKY75基因的表达水平和MdWRKY75蛋白丰度显著上调，为了研究MdWRKY75在热胁迫下的作用，作者创制了苹果过表达（OE1、OE2和OE3）和RNA沉默（Ri1、Ri2和Ri3）植株。经过8小时的热处理后，OE株系的转基因植株被发现更耐热，而Ri株系则表现出相反的表型（图1，A和B）。23°C下，WT和转基因株系之间没有显著差异（图1，C至F）。热处理后，OE株系中总叶绿素含量显著高于WT（图1C），OE株系的REL程度和MDA含量显著低于WT，（图1，D和E），脯氨酸含量在OE株系中显著高于WT（图1F），且Ri株系相较于OE株系均表现出相反情况。综上，MdWRKY75正向调节苹果对热胁迫的响应。![]()
图1. MdWRKY75正向调节苹果的热耐受性。(A)热处理0、4、8和14小时后MdWRKY75转基因苹果植株的表型。(B)热处理后叶片的表型。(C)总叶绿素含量。(D)相对电解质渗透率。(E)丙二醛含量。(F)脯氨酸含量。2、MdWRKY75增强了苹果在热胁迫下的ROS清除效率和光合效率为了进一步分析MdWRKY75在热胁迫下的功能，作者分析了ROS和光合参数。DAB和NBT染色显示，在热胁迫下，OE株系中染色结果均低于WT（图2A-B），OE株系的最大光合效率（Fv/Fm）值仍然显著高于WT（图2C-D），OE株系的净光合速率（Pn）值显著高于WT，Ri株系的Pn值显著低于WT（图2E）。综上所述，MdWRKY75可以通过清除ROS和提高Fv/Fm和Pn来增强苹果对热的抵抗力。![]()
图2.在热胁迫下MdWRKY75转基因苹果的活性氧（ROS）和光合能力。(A) DAB染色。(B) NBT染色。(C) Fv/Fm图像。(D) Fv/Fm比率。(E) 净光合作用速率（Pn）。3、MdWRKY75提高苹果耐热性的RNA-seq分析为了进一步探究MdWRKY75增强苹果耐热性的机制，作者进行了RNA-seq分析。差异表达基因（DEGs）和KEGG富集分析显示，正常生长时，OE株系与WT之间的DEGs主要富集在昼夜节律和光合作用中，而Ri株系主要富集在谷胱甘肽代谢和植物-病原体互作中（图3A-B）。热处理后，OE与WT之间的DEGs富集在MAPK信号通路、角质层、木栓质和蜡质生物合成以及C5支链二基酸代谢中，而Ri与WT之间的DEGs富集在角质层、木栓质和蜡质生物合成以及脂肪酸延伸中，表明MdWRKY75可能通过这些途径调节苹果对热的耐受性（图3D-F）。图3.在热胁迫下MdWRKY75转基因苹果叶片中差异表达基因（DEGs）的KEGG富集分析。(A)、(C)和(E)野生型与OE株系在0、4和8小时热胁迫后的KEGG富集分析。(B)、(D)和(F)野生型RNAi株系在0、4和8小时热胁迫后的KEGG富集分析。作者通过RT-qPCR分析，在热胁迫下，鉴定了在MdWRKY75转基因苹果植株中5个MdHsfs表达水平，它们在过表达株系中的表达上调，在RNAi株系中表达下调，（附图S14）。此外，进行了DNA亲和纯化测序（DAP-seq）分析，以分析MdWRKY75的特定结合元件。结果显示MdWRKY75结合到DNA元件AGTCAA（附图S15A）。在分析MdWRKY75在转录起始位点（TSS）上游和下游2000 bp的结合区域后，发现它结合到TSS附近的序列（补充图S15C）。![]()
附图S14.在48°C热处理8小时后，MdWRKY75转基因苹果中MdHsfs表达水平的热图。![]()
附图S15. MdWRKY75的DAP-seq结果及其识别位点。(A) MdWRKY75的识别基序。(B)基因功能区域内峰值的注释统计。(C)富集峰值在TSS附近的分布。(D) MdWRKY75-DNA相互作用的全基因组图谱。为了鉴定Md WRKY75是否与MdHsfs的启动子结合，作者进行了电泳迁移率分析(EMSA)和酵母单杂交(Y1H)实验。EMSA结果显示，MdWRKY75只能够直接结合到MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d启动子上的W-box（图4A-B）。当W-box的核心碱基发生突变后，MdWRKY75无法结合到突变探针上（图4C）。Y1H结果显示，proMdHsf4、proMdHsfB2a、proMdHsfA1d分别和MdWRKY75共表达的酵母细胞能在-T/-L培养基上生长正常（图4D-H）。以上表明，MdWRKY75能够直接结合到MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的启动子上，但不能结合到MdHsfA2和MdHsfA3的启动子上。![]()
图4. MdWRKY75直接结合到MdHsfs的启动子上。(A)5个MdHsfs启动子中W-box（5′-AGTCAA-3′）的分布。(B) EMSA。(C)竞争性EMSA。(D) 至(H) MdWRKY75与MdHsf4、MdHsfA2、MdHsfB2a、MdHsfA3和MdHsfA1d启动子之间的Y1H实验结果。为了进一步验证MdWRKY75是否能够激活MdHsfs的表达，作者用了苹果愈伤组织进行了GUS染色和双荧光素酶（dual-luciferase）实验。GUS染色和LUC报告结果显示，共表达MdWRKY75和proMdHsf4、proMdHsfB2a、proMdHsfA1d的 GUS活性更高（图5A、B、D和F），荧光信号更强（图5G、H、J和L）。与对照组相比，共表达MdWRKY75和 proMdHsfA2和proMdHsfA3的GUS活性和LUC荧光信号无显著差异（图5C和E、图5I和K）。以上结果表明，MdWRKY75只激活了MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的表达。![]()
图5. MdWRKY75正调控MdHsfs的表达。(A)
GUS实验的报告基因和效应子载体的示意图。(B)至(F)
GUS染色和活性。(G)LUC实验的报告基因和效应子载体的示意图。(H)至(L)荧光素酶图像和LUC/REN相对活性。为了进一步验证MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d在热胁迫响应中的功能，作者创制了它们的过表达株系。热处理后，过表达MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的植株比对照组的萎蔫程度要小（图6A）。RT-qPCR结果显示，MdHsfs-OE株系的表达水平显著高于各自对照组（图6B）。DAB和NBT染色表明，MdHsfs-OE株系的叶片在热胁迫后ROS水平低于WT-2300GFP（图6C）。Fv/Fm值在热胁迫后都有所下降，但MdHsfs-OE的值仍然显著高于WT（图6D）。为了进一步确定MdHsfs是否导致MdWRKY75的耐热性，作者在MdWRKY75-Ri3植株的背景下创制了MdHsfs的过表达系。结果表明，MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的过表达缓解了MdWRKY75-Ri3的热敏感表型（图6E）。热处理后，三个MdHsfs的表达水平降低，表明其对热的敏感性（图6F）。DAB和NBT染色表明，三个MdHsf过表达可以降低ROS水平（图6G），叶片的Fv/Fm值显著增加（图6H）。![]()
图6. MdHsfs正向调节苹果的热耐受性。(A)过表达MdHsfs的表型。(B)相对表达水平。(C)DAB和NBT染色。(D)叶绿素荧光图像和Fv/Fm值。(E) MdWRKY75-Ri3+MdHsfs-OE在热胁迫下的表型。(F) E中MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的相对表达水平。(G) DAB和NBT染色。(H)叶绿素荧光图像和Fv/Fm值。通过Y2H试验，作者发现与MdWRKY75相互作用的蛋白主要是转录因子(TFs)和热休克蛋白(HSPs)。其中，作者选择MdHSC70作为候选蛋白，探究其在热胁迫下的作用。RT-qPCR显示，MdHSC70的表达水平在热胁迫时上调。Y2H、Split-LUC和BiFC结果显示，MdWRKY75与MdHSC70相互作用（图7A、7B、7C）。Pull-down结果显示，MdWRKY75-His和MdHSC70-MBP与抗His磁性珠共孵育，使用MBP抗体进行免疫印迹时可以检测到MdHSC70-MBP。（图7D）。这些结果表明MdWRKY75和MdHSC70在体内和体外都发生相互作用。![]()
图7. MdWRKY75与MdHSC70相互作用。(A) Y2H。(B) Split-LUC。(C) BiFC。(D) pull-down。为了验证MdHSC70在响应热胁迫中的作用，作者创制了MdHSC70过表达株系。结果表明，过表达MdHSC70的植株在热胁迫下表现出更敏感的表型，其叶片的萎蔫和卷曲程度比WT-2300GFP植株更为严重（图8A）。RT-qPCR显示，MdHSC70的表达水平增加（图8B）。在热胁迫后，三个MdHsfs在MdHSC70过表达植株中的表达水平显著低于WT-2300GFP植株（图8C）。DAB染色没有差异，而NBT染色显示MdHSC70过表达植株在热处理后的叶片更深（图8D）。MdHSC70过表达植株的Fv/Fm值显著降低（图8E）。
为了进一步验证MdHSC70在热胁迫下的功能，作者创制了沉默株系MdHSC70-Si。MdHSC70-Si株系在热胁迫处理后更耐热（图8F）。MdHSC70的表达水平在正常和热胁迫条件下降低（图8G）。热胁迫后，三个MdHsfs的表达水平显著上调（图8H）。DAB和NBT染色也表明，MdHSC70-Si株系的叶片在热胁迫下的ROS水平低于WT（图8I）。Fv/Fm值更高（图8J）。这些结果表明MdHSC70负向调节苹果的热耐受性。![]()
图8. MdHSC70在响应热胁迫中起负调控作用。(A) MdHSC70过表达株系的表型。(B) RT-qPCR鉴定。(C)MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的相对表达水平。(D)DAB和NBT染色。(E)叶绿素荧光图像和Fv/Fm值。(F) MdHSC70基因沉默植株的表型。(G) RT-qPCR鉴定。(H)相对表达水平。(I)DAB和NBT染色。 (J)叶绿素荧光图像和Fv/Fm值。10、MdHSC70抑制MdWRKY75与MdHsfs的结合活性作者通过GUS染色证明，与单独共表达35S:MdWRKY75 +proMdHsfs:GUS相比，共表达35S:MdHSC70 +
35S:MdWRKY75 + proMdHsfs:GUS时，GUS活性降低（图9A-C）。LUC结果显示，共表达中荧光信号更弱（图9D-F）。EMSA实验表明MdHSC70不能结合到MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的启动子上，同时，当MdWRKY75-His和MdHSC70-MBP与生物素标记的探针共孵育时，MdWRKY75-His对生物素探针的结合效果降低。这种抑制效应随着MdHSC70-MBP蛋白量的减少而降低（图9G）。这些发现表明MdHSC70与MdWRKY75相互作用，并抑制了MdWRKY75对MdHsfs的激活活性。![]()
图9. MdHSC70抑制MdWRKY75与MdHsfs的结合。(A)至(C) GUS实验表明MdHSC70抑制了MdWRKY75激活活性。(D)至(F)双荧光素酶实验表明MdHSC70抑制了MdWRKY75激活活性。(G) EMSA表明MdHSC70抑制MdWRKY75与5'生物素标记探针的结合。11、MdHSC70抑制MdWRKY75对高温胁迫的耐受性为了验证MdHSC70是否参与了由MdWRKY75介导的耐热性，作者分别在MdWRKY75-OE苹果植株背景中过表达了和沉默了MdHSC70。热处理结果显示，MdWRKY75-OE + MdHSC70-OE株系降低了MdWRKY75-OE的耐热性，但与野生型相比仍具有较高的耐热性。然而，MdWRKY75-OE + MdHSC70-Si株系表现出与MdWRKY75-OE相似的热耐受性（图10A）。RT-qPCR结果表明，MdHSC70表达量分别升高和下降（图10B）。此外，过表达 MdHSC70三个MdHsfs的表达水平下调，ROS水平增加，而基因沉默MdHSC70株系中这三个MdHsfs的表达水平升高（图10，C至E、图10F），并且MdWRKY75-OE + MdHSC70-OE株系的Fv/Fm在热处理后显著低于MdWRKY75-OE和MdWRKY75-OE + MdHSC70-Si株系（图10，G和H）。以上结果表明，MdHSC70通过抑制MdWRKY75对MdHsfs的调控影响苹果耐热性。![]()
图10. MdHSC70抑制MdWRKY75的热胁迫耐受性。(A)过表达和沉默MdHSC70的MdWRKY75-OE苹果植株在热胁迫下的表型。(B)过表达和沉默MdHSC70的MdWRKY75-OE苹果植株的相对表达水平。(C)至(E)热胁迫下过表达和沉默MdHSC70的MdWRKY75-OE苹果植株中MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的相对表达水平。(F)热胁迫后过表达和沉默MdHSC70的MdWRKY75-OE苹果植株叶片的DAB和NBT染色。(G)至(H)热胁迫后过表达和沉默MdHSC70的MdWRKY75-OE苹果植株的叶绿素荧光图像和Fv/Fm值。附图S1.苹果MdWRKY75响应热胁迫。(A)热胁迫下MdWRKY75的相对表达量。(B)热胁迫下MdWRKY75的蛋白丰度。![]()
附图S5.热胁迫下，MdWRKY75转基因苹果中活性氧（ROS）的积累和抗氧化酶活性。(A) DAB和NBT染色的相对强度。(B) H2O2含量。(C) O2-含量。(D)超氧化物歧化酶（SOD）活性。(E)过氧化物酶（POD）活性。(F)过氧化氢酶（CAT）活性。![]()
综上所述，MdWRKY75是苹果热胁迫响应的正向调节因子，MdWRKY75-OE苹果转基因植株拥有更高的耐热性，MdWRKY75通过激活MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的表达提高耐热性。此外，MdHSC70通过与MdWRKY75相互作用并抑制其对MdHsfs的调控，负向调节苹果的耐热性。
模式图：MdHSC70 - MdWRKY75模块通过调控热激因子的表达介导苹果耐热性
期刊：The
Plant Cell
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