2023年12月5日北京大学贺新强教授团队在Journal of Integrative Plant Biology期刊发表了题为“Gibberellin promotes cambium reestablishment during secondary vascular tissue regeneration after girdling in an auxin-dependent manner in Populus”的研究论文，通过研究赤霉素与生长素对次生维管组织的发育的影响，进一步完善了次生维管组织发育与再生的调控网络。![]()
在植物中，次生生长由形成层主导，形成层是一种由多能干细胞组成的圆柱形分生组织，负责协调细胞分裂和分化。形成层以严格的双向方式，向内分化为次生木质部，向外分化为次生韧皮部，形成次生维管组织（SVT）。植物SVT具有养分运输、信号转导和机械支撑等重要功能，是木材形成的基础。了解SVT的形成机制对于木材形成有非常重要的作用。赤霉素（GA）是一种二萜植物激素，可调节整个植物生命周期的多种生物活性。在维管组织中，GA 的前体主要在韧皮部中检测到，研究表明它可能通过射线细胞转运到发育中的木质部合成活性GA。在植物SVT发育过程中，GA作为基本调节剂来调节生物过程，包括形成层活性、木质部纤维分化、木质部扩张和细胞壁合成。DELLA蛋白是GA信号传导的主要负调节因子。GA调节生长素转运和信号传导，而生长素和GA对于SVT的发展至关重要，并且生长素/GA合成和响应基因在SVT再生过程中动态变化。但对于生长素和GA如何参与SVT再生调节知之甚少。因此，作者对生长素和GA在SVT发育和再生中的调节机制进行了深入分析。![]()
# 思维导图
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1.赤霉素在毛白杨次生维管组织再生过程中促进生长素诱导的形成层建立
为了确定生长素和GA在SVT再生中的功能，作者从次生生长活跃的树上采集毛白杨茎碎片，并在树皮环剥后在含有植物激素的培养基上培养（图 1A）。分别用10 μM NAA、1μM GA、二者混合以及用GA合成抑制剂多效唑（PAC）进行处理（图1B）。结果表明，10 μM NAA条件下再生形成层可以进行分化，而单独用GA处理不能诱导体外SVT再生。将不同浓度的GA与10 μM NAA进行混合处理发现用10 μM NAA和1 μM GA处理的样品形成层细胞数量更多（图1C、D）。用PAC处理可抑制形成层再生。这些结果表明，单独的GA可能不会诱导形成层再生，但在生长素存在的情况下，它可能会在SVT再生过程中促进形成层细胞的建立和分裂。为了确定应用GA后形成层基因的表达是否升高，通过定量检测发现在生长素和GA联合处理的样品中，维管形成层标记基因PtoWOX4a的表达显著增加（图S1B、C）。GUS染色发现在NAA处理样品的再生形成层区域观察到强烈的GUS信号。在用NAA和GA处理的样品中，GUS信号分布在再生形成层以外更广泛的区域，响应更强（图1E）。以上结果表明，GA可以增强树皮环剥后形成层基因的表达，并促进生长素诱导的SVT再生。![]()
图1.生长素和赤霉素双重处理促进毛白杨形成层再生。（A）环剥茎段与不同的植物激素处理。（B、C）横切面甲苯胺蓝O染色。（D）形成层细胞数。（E）PtoWOX4apro:GUS表达情况。
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图S1.（B、C）WT茎段经不同激素处理后PtoWOX4a在不同时间的表达水平。
2.PtoKS1介导的内源性GA生物合成影响SVT的发生和再生
为了研究在SVT再生过程中改变内源GA的效果是否与应用外源GA的效果一致，作者分析了杨树的GA生物合成途径，并确定了一个在维管组织中高表达的基因PtoKS1。创制了过表达PtoKS1的转基因植株。与WT植物相比，35S:PtoKS1植株生长更快，株高与茎粗增加（图2A）。过表达株系中生物活性GA含量增加（图S4G、H）。使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统生成了PtoKS-CRISPR突变体株系，表现出生长迟缓且茎段变细（图2A），而生物活性GA含量显著减少。随后，作者又在体外SVT再生系统中测试了35S:PtoKS1和 PtoKS-CRISPR株系的SVT再生情况。结果表明，在WT样品中观察到新的再生形成层细胞与未成熟木质部细胞相邻。在过表达株系中，形成层细胞重建过程显著加速并开始形成新的木质部。敲除株系中，残留木质部上仅观察到少量不连续的再生形成层细胞和愈伤组织细胞，新的维管组织未能恢复（图2B、D）。使用外源GA恢复了PtoKS-CRISPR株系的表型，而过表达株系WT相比，再生形成层细胞数量减少（图 2C、D）。这些结果表明，GA水平影响杨树SVT再生；适当的GA含量可以促进形成层再生，而过量的GA则会减弱其作用。在没有任何外源植物激素处理的情况下，WT和过表达株系都能够再生愈伤组织细胞，但没有观察到新的维管组织（图2E）。为了研究内源性GA含量升高对SVT发生的影响，作者观察了茎节间维管组织的形态。与WT相比，过表达株系维管形成层细胞层数量以及木质部面积和木质部细胞数量都显著增加，而敲除株系与之相反（图3A-E）。综上所述，这些结果表明PtoKS1介导的GA生物合成可能在SVT再生和发育中发挥重要作用。图2.PtoKS1调节毛白杨次生维管组织再生过程中形成层的建立。（A）3月龄与4月龄植株表型。（B、C）甲苯胺蓝O染色。（D）再生形成层的统计数据。（E）WT和过表达株系中未经外源激素处理的茎段横切面染色。
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图S4.（G、H）WT、过表达和敲除株系中生物活性GA含量。
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图3.PtoKS1调节毛白杨形成层增殖和木质部发育。（A-B）WT、35S:PtoKS1和PtoKS-CRISPR转基因植物中第四（A）和第八（B）节间的甲苯胺蓝O染色。（C-E）形成层和木质部细胞层数据统计。
赤霉素生物合成和信号转导广泛调控植物生长发育。GA含量的变化会影响 SVT再生，DELLA蛋白在GA信号通路中发挥着至关重要的作用。因此作者通过序列比对鉴定了杨属中的DELLA同源物发现PtoRGA、PtoGAI、PtoRGL1、PtoRGL2在杨树茎维管组织中表达较高。并通过定量和数据分析发现PtoGAI和PtoRGA在SVT再生过程中呈现动态表达模式（图4A，B）。为了鉴定DELLA在杨树SVT发育和再生中的功能。作者创制了35S:PtoGAI过表达株系（图4D），与WT植物相比，过表达株系生长迟缓，株高降低、茎直径更小、叶片更小（图 4C）。进一步的形态学观察表明，PtoGAI的过度表达阻碍了SVT的形成（图4E，F）。综上所述，这些结果表明PtoGAI的过度表达导致发育迟缓并抑制次生生长。为了确定 过表达株系中SVT再生是否发生改变。单独用NAA处理后，与WT相比，过表达株系中的SVT再生受到抑制。经过NAA和GA双重处理后，过表达株系恢复的SVT再生，但与WT相比，它们的再生形成层细胞层数较少（图4G、H）。这些结果表明DELLA在SVT再生中发挥重要作用，并且抑制GA信号传导会抑制形成层再生。图4.PtoGAI调节次级维管组织发育和再生。（A）微阵列数据中PtoRGA和PtoGAI的表达。（B）RT-qPCR检测SVT再生过程中PtoRGA 和PtoGAI的表达。（C）2月龄植株表型。（D）PtoRGA表达水平。（E）4、6节间横切面染色。（F）形成层和木质部细胞层数统计。（G）经激素处理12天后横切面染色。（H）再生形成层细胞层数统计。
4.赤霉素刺激生长素反应和PIN1表达，促进形成层再生
为了确定GA是否通过影响生长素信号传导来调节形成层再生。作者使用了杨树生长素响应DR5报告系PtaDR5:GUS去确定GA处理是否增强了生长素反应。在SVT再生过程中，仅在存在生长素的情况下观察到DR5信号（图5A）。单独使用GA处理不能在体外SVT再生过程中激活生长素反应。在SVT再生早期阶段，DR5信号出现在木质部区域，表明损伤诱导可能需要生长素的作用，在9天时，DR5信号在用10 μM NAA和1 μM GA4处理的样品中分布最为广泛（图5A、B）。这些发现表明，GA的应用可以增强SVT再生过程中的生长素反应，并且这种富集效应是生长素依赖性的。有研究表明，生长素信号调节因子IAA和ARF在维管组织发育中发挥重要作用。因此，作者通过定量检测分析确定了PtoIAA4、PtoARF7和PtoARF8的表达水平。三个基因在SVT再生过程中都被诱导，并且在用1 μM GA4 进行额外处理后，它们的表达水平增加（图5C）。仅用GA4处理的样品中它们的表达水平仍然较低，与模拟处理组没有显著差异（图5C）。过表达KS1诱导的内源性GA水平的增加也可以促进三个基因的表达（图5D）。PIN1主要作用是控制植物发育过程中生长素在各种组织中的积累。作者发现在未去皮杨树的维管组织中，PIN1主要位于形成层区域。在对照组和1 μM GA4处理组中均未观察到 PIN1的信号峰（图6A），也未诱导PtoPIN1表达（图6B、C）。与生长素响应基因的表达模式类似，PtoPIN1仅在SVT再生过程中在生长素存在的情况下被诱导（图6B），其信号峰主要出现在再生的形成层区域图（图6A）。此外，作者发现PIN1的表达受到DELLA蛋白的负调节，并通过应用GA恢复（图6D）。这些结果表明GA在形成层的建立和维持中发挥积极的调节作用，但不能发挥生长素在SVT再生调节中的作用。图5.赤霉素增强次生维管组织再生过程中的生长素梯度重新分布和信号传导。（A）不同激素处理后PtaDR5的GUS表达情况。（B）不同激素处理后9天和12天的GUS信号面积测量数据。（C）不同激素处理后PtoIAA4、PtoARF7和PtoARF8在不同时间的表达水平。（D）WT和35S:PtoKS1在9天时PtoIAA4、PtoARF7和PtoARF8的表达。
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图6.赤霉素促进并扩大再生组织中PIN1的表达。（A）WT茎段经不同激素处理12天后横切面中AtPIN1蛋白的免疫定位。（B）不同激素处理后PtoPIN1在不同时间的表达水平。（C）WT和35S:PtoKS1中PtoPIN1的表达。（D）WT和35S:PtoGAI中PtoPIN1的表达。
赤霉素以生长素依赖性方式促进形成层再生，而模拟处理或单独用GA处理不能在SVT再生过程中诱导形成层重建。赤霉素可以通过解除DELLA蛋白对形成层再生的抑制作用、增强生长素反应以及介导生长素转运的PIN1的表达来促进生长素诱导的形成层再生。![]()
图7.次生维管组织再生过程中生长素和赤霉素调节形成层重建的模型。
期刊：Journal of Integrative Plant Biology
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