2024年10月，东北林业大学树木遗传与育种国家重点实验室王玉成团队在New Phytologist发表了题为“The BpPP2C-BpMADS11-BpERF61 signaling confers drought tolerance in Betula platyphylla”的研究论文，揭示了BpPP2C22-BpMADS11-BpERF61模块调控桦树耐旱性的分子机制：BpMADS11通过与BpPP2C22的相互作用发生去磷酸化，促进了BpERF61的表达。随后，BpERF61通过与特定的DNA基序结合来调控下游基因，从而提高桦树的耐旱性。![]()
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干旱是限制植物生长和降低作物产量的主要不利环境因素之一。植物对非生物胁迫的反应涉及复杂的胁迫信号和基因调控网络。MADS-box转录因子在多种生物通路调控网络的发挥重要作用。蛋白质磷酸化是参与多种信号通路的关键机制，可通过去磷酸化快速逆转。植物蛋白磷酸化已经从蛋白激酶（PKs）和磷酸化的角度进行了广泛的研究，而对蛋白磷酸酶（PPs）和去磷酸化的关注较少。之前的研究研究表明，桦树中MADS-box基因BpMADS11处于基因表达调控网络的顶层，可赋予其耐旱性，MADS-box蛋白对非生物胁迫的耐受性至关重要，但它们是否通过磷酸化或去磷酸化来调节非生物胁迫耐受性？MADS-box TFs在介导非生物胁迫耐受性中的调控级联是什么仍尚不清楚。# 思维导图：
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1. 干旱胁迫下BpMADS11的表达谱
RT-qPCR结果显示，BpMADS11在成熟叶片中的表达水平最高，在成熟茎中的表达水平最低（图1a）。作者用PEG诱导的干旱胁迫处理，诱导了桦树根部和叶片中BpMADS11的表达（图1b），表明BpMADS11参与了对干旱胁迫的响应。GUS染色显示，与正常生长条件相比，PEG诱导的干旱胁迫下BpMADS11在根部和叶片中高表达（图1c）。GUS活性测定显示了相同的结果（图1d）。亚细胞定位结果显示MADS11定位于细胞核（图1e）。这些结果表明，MADS11是一种定位于细胞核的核蛋白，PEG可以诱导其表达。![]()
图1. BpMADS11的表达和亚细胞定位
（a）BpMADS11在桦树不同组织中的表达。（b）20% PEG6000处理后BpMADS11的表达。（c）GUS染色分析。（d）通过定量GUS活性分析BpMADS11的表达。（e）BpMADS11的亚细胞定位分析。2. BpMADS11赋予桦树耐旱性
为了探究BpMADS11是否参与干旱响应，作者创制了BpMADS11过表达（BpMADS11-OE1、2和3）和敲除（bpmads11#-3、5和10）株系。分别对正常和干旱条件下，野生型、BpMADS11-OE和bpmads11#株高、根长、鲜重进行测定（图2a-e）。此外，与BpMADS11-OE相比，干旱胁迫后bpmads11#和WT植株的叶绿素含量显著降低（图2f）。以上结果表明，在干旱条件下过表达BpMADS11可使植株变矮，但没有减少其生物量。过表达BpMADS11具有显著的耐旱性。与此同时，敲除BpMADS11增加了植物的生长速率和生物量，增强了植物对干旱胁迫的敏感性。![]()
图2. BpMADS11使桦树具有耐旱性
（a）野生型（WT）和过表达、敲除BpMADS11的生长表型。（b）株高比较（无根）。（c）根长的比较。（d）植物鲜重分析（全株重，包括根重）。（e）根部鲜重分析。（f）Chl含量的比较。
3. BpMADS11提高了干旱胁迫下桦树ROS清除能力
在干旱胁迫条件下，BpMADS11-OE株系的电解质泄漏率、过氧化氢和MDA含量显著低于野生型植株，而bpmads11#株系三个含量显著增加（图S3b-d）；NBT和DAB染色均表明，过氧化氢和O2-积累量依次是：bpmads11#株系、WT、BpMADS11-OE株系。通过测定SOD、POD和CAT活性，进一步研究BpMADS11是否对ROS清除能力产生影响（图S3f-h）。结果表明，BpMADS11可以提高桦树抗氧化能力，减少ROS的积累，从而降低桦树的氧化损伤，提高其耐旱性。![]()
图S3. 通过生理和组织化学分析鉴定桦树耐旱性。
4. BpPP2C22与BpMADS11相互作用，BpMADS11在干旱胁迫下发生去磷酸化
作者首先通过Y2H来探究与BpMADS11互作的蛋白（图3a），随后阳性克隆的测序显示BpPP2C22富集，表明其可能与BpMADS11相互作用，进一步用Y2H验证（图3a）。双分子荧光互补实验和体外下拉实验也验证了BpPP2C22与BpMADS11的相互作用（图3b，3c）。鉴于BpMADS11与BpPP2C22相互作用，而BpPP2C22具有潜在的蛋白去磷酸化功能，作者推测BpMADS11可能被BpPP2C22去磷酸化。在非胁迫条件下，BpMADS11处于磷酸化状态，而随着干旱胁迫暴露时间的增加，磷酸化的BpMADS11水平持续下降，在干旱处理9 h后磷酸化完全消失（图3d）。用CIAP处理的非胁迫条件下的BpMADS11作为阴性对照（图3d）。这一结果表明，干旱处理诱导了BpMADS11的去磷酸化。![]()
图3. BpPP2C22在体内和体外与BpMADS11相互作用。（a）酵母双杂。（b）BiFC。（c）GST下拉实验。（d）桦树中PEG6000处理后BpMADS11磷酸化反应分析。
5. BpPP2C22在体外去磷酸化BpMADS11，增强植株耐旱性
鉴于PP2C蛋白具有去磷酸化酶的作用，作者进一步研究BpPP2C22是否能使BpMADS11去磷酸化。结果显示，在没有BpPP2C22的情况下，BpMADS11具有很强的磷酸化信号。然而，随着BpPP2C22蛋白浓度的逐渐增加，磷酸化信号降低，最终消失（图4a）。作者创制了敲除BpPP2C22（BpMADS11-OE/pp2c22）的桦树株系。在正常条件下，BpMADS11-OE和BpMADS11-OE/pp2c22植株中BpMADS11蛋白处于磷酸化状态。干旱胁迫后，BpMADS11-OE植株中BpMADS11的磷酸化水平消失，而BpMADS11-OE/pp2c22中BpMADS11的磷酸化水平并没有被消除（图4b）。BpPP2C22在干旱条件下被诱导高表达。这些结果表明，PP2C在干旱胁迫下去磷酸化BpMADS11。作者推断BpMADS11的去磷酸化在耐旱性中起着一定的作用。在正常条件下，BpMADS11-OE、WT和BpMADS11-OE/pp2c22植株生长正常，无显著性差异。在干旱条件下，BpMADS11-OE植株的状态更好，而WT和BpMADS11-OE/pp2c22植株的叶片均有卷曲和枯萎（图4c）。复水5 d后，所有BpMADS11-OE植株和大部分BpMADS11-OE/pp2c22植株均恢复，而WT植株均死亡。然而，尽管BpMADS11-OE/pp2c22植株恢复但仍表现出严重的干旱损害表型，而BpMADS11-OE植株恢复到正常的表型（图4c）。生理分析表明，在干旱胁迫后，野生型植株的电解质泄漏率、MDA含量和过氧化氢含量最高，其次是BpMADS11-OE/pp2c22和BpMADS11-OE株系。POD和CAT活性依次是：BpMADS11-OE、BpMADS11-OE/pp2c22和WT植株（图4e，f）。这些结果表明，BpMADS11的去磷酸化显著提高了其耐旱能力。![]()
图4. BpMADS11的去磷酸化提高了其赋予抗旱性的能力。（a）体外磷酸化检测。（b）BpMADS11-OE和BpMADS11-OE/pp2c22植株中BpMADS11磷酸化分析。（c）生长表型分析。（d）过氧化氢含量分析。（e）POD活性分析。（f）CAT活性分析。6. BpERF61是BpMADS11的直接靶基因
在之前的研究中就已建立桦树响应干旱的基因调控网络（GRN），其中BpMADS11占据顶层，能够调控BpERF61的表达，从而植株获得耐旱性。作者发现BpMADS11可显著诱导BpERF61的表达。酵母单杂交（Y1H）结果显示，BpMADS11特异性结合到BpERF61启动子区域pro-2和pro-3，其中包含一个CArG-box（图5a）。此外，ChIP-qPCR和EMSA均表明，BpMADS11可以与截断的BpERF61启动子pro-2和pro-3结合（图5b，S6b）。dual-LUC报告基因检测结果显示，BpMADS11与BpERF61启动子相互作用，激活其表达（图5c）。这表明BpMADS11与BpERF61的启动子结合，正向调控其表达。![]()
图5. BpERF61直接受BpMADS11的调控，以及BpERF61的表达特征（a）酵母单杂。（b）EMSA测定BpERF61结合到CArG-box。（c）双荧光素酶实验验证BpMADS11通过与靶基因BpERF61的启动子结合来激活其表达。（d）ChIP-qPCR分析。（e）测定BpMADS11去磷酸化对其反转录活性的影响。（f）BpERF61在WT和转基因株系中的表达。7. BpMADS11的去磷酸化增强了BpERF61的转录
作者进一步研究了BpMADS11的去磷酸化是否会影响BpERF61的表达。将BpMADS11-OE和BpMADS11-OE/pp2c22植株在干旱胁迫下进行ChIP-qPCR检测。结果表明，在BpMADS11-OE植株中，BpMADS11可以与BpERF61、pro-2和pro-3的截断启动子结合；而在BpMADS11-OE/pp2c22植株中，结合显著降低（图5d）。在正常和干旱胁迫条件下，与单独过表达BpMADS11相比，BpPP2C22和BpMADS11共表达显著提高了BpERF61pro:LUC的转录水平。此外，与正常条件相比，干旱胁迫显著诱导了BpERF61pro:LUC的转录水平（图5c）。BpMADS11的去磷酸化，在干旱胁迫条件下基因表达的激活中起着至关重要的作用。RT-qPCR分析结果显示，与BpMADS11-OE植株相比，BpMADS11-OE/pp2c22植株中BpERF61的表达量显著降低。与正常条件相比，PEG处理后除bpmads11#外，所有转基因株系中BpERF61的表达均增加（图5f）。这些结果表明，BpPP2C22对BpMADS11的去磷酸化对调控桦树抗旱过程中下游靶基因的表达至关重要。8. BpERF61赋予转基因桦树耐旱性
作者创制了BpERF61过表达（BpERF61-OE5、6和7）和CRISPR诱导的敲除（bperf61#-2、4和9）株系。比较正常生长条件和干旱胁迫后野生型和转基因株系的鲜重、高度和根重（图6a）。并且干旱胁迫后，bperf61#的电解质泄漏率和MDA含量最高。过表达BpERF61增强了桦树的耐旱性。为了解BpERF61在耐旱性中发挥的作用，通过RNA-seq鉴定其靶基因，并在干旱胁迫条件下鉴定了BpERF61-OE植株与WT之间的DEGs。鉴定出3346个DEGs，其中包括1301个上调基因和2045个下调基因。DEGs参与了许多与非生物胁迫相关的过程。此外，BpERF61诱导了许多与ROS清除相关的基因。作者进一步检测了BpERF61是否能增强对ROS的清除能力。DAB和NBT染色结果显示，与野生型植株相比，BpERF61-OE系在干旱胁迫后的过氧化氢和O2-积累显著降低，而bperf61#系的过氧化氢和O2-积累最高（图6b）。过氧化氢测量结果也与DAB染色结果一致（图6c）。此外，BpERF61-OE和bperf61#植株的POD、SOD和CAT活性分别相较于WT显著增加和降低（图6d-f）。这些结果表明，BpERF61通过诱导与抗氧化系统相关的基因表达来提高ROS的清除能力。![]()
图6. BpERF61通过清除桦树中的活性来提高耐旱性
（a）WT和过表达、敲除BpERF61植株的生长表型分析。（b）NBT和DAB染色分析。（c）过氧化氢含量分析。（d）POD活性分析。（e）SOD活性分析。（f）CAT活性分析。9. BpERF61靶基因在不同BpMADS11表达水平桦树中的表达
通过ChIP-seq鉴定与BpERF61结合的DNA基序和直接调控的靶基因，18.85%的结合位点位于与1552个基因相关的启动子区域，202个直接调控基因（DRGs）（图7a）。RT-qPCR验证参与非生物胁迫的18个DRGs的表达与RNA-seq结果一致。GO富集分析显示，诱导的DRGs主要与非生物胁迫有关（图7b）。利用MEME-ChIP分析了ChIP-seq数据中的所有启动子定位峰序列（图7c），进一步通过EMSA鉴定与BpERF61结合的DNA基序（图7d-f）。这些结果表明，BpERF61可以结合不同的基序来调控下游基因的表达。![]()
图7. BpERF61通过与基序结合来调控靶基因的表达
（a）RNA-seq和ChIP-seq分析。（b）20% PEG6000处理下，WT和BpERF61-OE株系之间的差异表达基因（DEGs）的GO富集。（c）可能与BpERF61结合的基序。（d-f）EMSA分析BpERF61与G-box、“TTGGAT”和“GGGCCCC”基序的结合。作者随后探究了BpERF61靶基因在BpMADS11相关的转基因桦树植物中的表达，随机选择10个通过RNA-seq鉴定的BpERF61靶基因进行RT-qPCR分析。结果显示，所有这些基因在BpMADS11-OE和BpERF61-OE植物中都存在差异调控（图S10）。这些基因可以同时受到BpMADS11和BpERF61的控制，从而证实了BpMADS11对BpERF61的调控作用。与WT植物相比，BpMADS11-OE/pp2c22系中许多BpERF61靶基因的表达水平更高或更低（图S10）。![]()
图S10. BpERF61调控下游基因的表达水平。
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干旱胁迫诱导BpMADS11的表达，随之BpMADS11与BpPP2C22相互作用形成复合物，用于BpMADS11的去磷酸化。去磷酸化的BpMADS11随后结合到BpERF61启动子中的CArG-box，以诱导BpERF61的表达。BpERF61通过与G-box等基序的结合来调节干旱耐受相关基因的表达，最终增强白桦的干旱耐受性。本研究为深入了解BpMADS11在干旱胁迫响应中的作用机制提供了依据。![]()
图8. 干旱胁迫下的BpMADS11的调控网络模型。
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