PPB | 葡萄糖传感器TaHXK7-1A诱导活性氧产生降低转基因拟南芥和小麦的抗旱性

2024年01月30日西北农林科技大学闵东红教授团队在Plant Physiology and Biochemistry期刊上发表了题为Active oxygen generation induced by the glucose sensor TaHXK7-1A decreased the drought resistance of transgenic Arabidopsis and wheat (Triticum aestivum L)的研究论文。该研究初步揭示了TaHXK7-1A对干旱胁迫响应的分子机制，对小麦新品种创新和抗旱育种具有重要意义。

=== 研究背景 ===

=== 研究结果 ===

1. TaHXK7-1序列分析、表达模式分析和亚细胞定位

图1. TaHXK7-1的生物信息学分析。(A) TaHXK7-1与其他物种同源序列的系统发育关系。(B) TaHXK7-1与OsHXK7、OsHXK1与AtHXK1同源蛋白序列比对可视化。(C) TaHXK7-1与OsHXK7、OsHXK1和AtHXK1同源基因编码的蛋白三级结构预测图。

图2. TaHXK7-1表达模式及亚细胞定位分析。(A)TaHXK7-1在小麦成熟组织中的组织特异性表达。(B) 20% PEG6000处理后小麦叶片中TaHXK7-1的表达量。(C)干旱处理后小麦叶片组织中TaHXK7-1的表达量。(D)ABA处理后麦叶片中TaHXK7-1的表达水平。(E)TaHXK7-1A的亚细胞定位。

将TaHXK7-1A连接到修饰后的pCAMBIA2300-35S载体上(图3A)，转染拟南芥，获得TaHXK7-1A拟南芥系(OE株系)。RT-PCR结果显示，TaHXK7-1A基因存在于OE1、OE2和OE3株系中，且表达量高，而在WT中未检测到该基因的表达(图3B)。干旱胁迫处理12 d后，水分损失率下降。对3周龄的WT和OE株系的叶片进行观察，结果表明，与WT相比，OE株系的叶片出现了严重的黄变和卷曲现象(图3C)， OE株系的失水率明显更高(图3E)。同时，干旱处理后OE1、OE2和OE3叶片叶绿素含量显著降低(图3F)。经过12 d的干旱胁迫和3 d的水分恢复，WT的存活率为76.53%，OE-1、OE-2和OE-3的存活率分别为45.7%、48.4%和47.2%(图3D)。

图3. TaHXK7-1A过表达拟南芥品系干旱胁迫表型及耐受性分析(A) pCAMBIA2300-35S植物表达载体过表达TaHXK7-1A基因示意图。(B)过表达TaHXK7-1A拟南芥的RT-PCR分析。(C) WT和OE株系干旱12天和复水后3天的表型分析。(D) WT和OE株系复水3天的存活率。(E)干旱12 d后WT和OE株系叶片的相对含水量。(F)WT和OE株系干旱12 d后叶片叶绿素含量。

连续干旱12天后，与WT系相比，OE株系叶片NBT染色更深(图4A)，叶片中O₂^－含量更高，分别是WT系的1.98倍、1.93倍和2.03倍，差异极显著(图4B)。干旱处理后OE株系MDA含量为1.38;分别是WT系的1.42倍和1.36倍(图4B)。此外，作者还分析了5个呼吸爆发氧化酶相关基因(AtRBOHa、AtRBOHb、AtRBOHc、AtRBOHd和AtRBOHf)在WT和OE株系中的表达模式。结果表明，与WT相比，干旱胁迫下OE株系中5个呼吸爆发氧化酶基因的表达显著上调(图4C)。上述结果表明，TaHXK7-1A诱导RBOHs表达上调，从而刺激OE株系ROS的产生和积累，使OE株系在干旱条件下更容易受到胁迫。

图4. 干旱胁迫下拟南芥TaHXK7-1A过表达系O₂^－和MDA含量及RBOHs相关基因转录丰度分析(A) WT和OE叶片的NBT组织化学染色。(B) WT系和OE株系叶片O₂^－含量和MDA含量测定。(C)干旱12天后WT和OE叶片中AtRBOHa、AtRBOHb、AtRBOHc、AtRBOHd和AtRBOHf基因的转录丰度。

4.过表达TaHXK7-1A拟南芥对葡萄糖的敏感性增加

将WT、athxk1突变体和过表达TaHXK7-1A的拟南芥系(OE株系)的种子散布在含有6%葡萄糖和6%甘露醇的MS培养基上。9 d后，两个子叶完全展开，在显微镜下观察。结果表明，在含6%葡萄糖的MS培养基中，WT的生长受到明显抑制，对OE株系的抑制作用更为明显，而athxk1突变系的生长未受到明显抑制(图5A)。在6%甘露醇中，WT、athxk1和OE株系的幼苗生长正常，表明OE和WT株系的生长抑制程度为不是由葡萄糖的渗透胁迫引起的(图5A)。同时，对WT、athxk1和OE株系的幼苗进行NBT染色。与WT相比，OE株系染色更深，而athxk1染色较浅(图5A)。根系测量结果显示，OE品系的根长度明显短于WT和athxk1品系(图5B)。同时，OE系中O₂^－含量较WT显著增加，而athxk1中O₂^－含量较低(图5C)。上述结果表明，TaHXK7-1A过表达可刺激拟南芥植株葡萄糖敏感性升高，促进ROS积累，抑制拟南芥生长。

图5. 过表达TaHXK7-1A拟南芥系葡萄糖敏感性试验和O₂^－测定。(A) WT、athxk1和OE系NBT染色。(B)WT、athxk1、OE株系的根长。(C) WT、athxk1、OE株系O₂^－含量。

5.bsmv介导的TaHXK7-1基因沉默增强小麦抗旱性

当小麦达到两叶期时，用BSMV_TaHXK7-1病毒接种第二叶，14d后观察到第三叶的漂白和病毒症状。以接种BSMV₀和BSMV_PDS的小麦叶片为阴性对照和阳性对照。结果表明，接种PBS后小麦第三叶呈现绿色，接种BSMV_PDS病毒后小麦第三叶呈现光漂白症状，接种BSMV₀和BSMV_TaHXK7-1病毒后小麦第三叶呈现光漂白症状表现为黄条症状(图6A)。干旱处理后，BSMV_TaHXK7-1的TaHXK7-1表达水平低于模拟系和BSMV₀系(图6B)。此外，干旱处理后，模拟和BSMV₀小麦叶片显著变黄和枯黄，而BSMV_TaHXK7-1小麦叶片变黄和枯黄相对轻微(图6C)。上述结果表明，干旱胁迫下TaHXK7-1基因表达的降低可以显著提高小麦的抗旱性。

图6. BSMV介导的TaHXK7-1基因沉默小麦在干旱胁迫下的表型分析(A) BSMV处理14天后小麦叶片的光漂白和病毒症状。(B)干旱处理16天后BSMV介导的TaHXK7-1基因沉默效率检测。(C)小麦TaHXK7-1沉默株系在对照和干旱胁迫下16 d的表型分析。

图7. 干旱胁迫下BSMV诱导的TaHXK7-1基因沉默小麦O₂^-和MDA含量测定及RBOHs相关基因转录丰度分析(A) NBT组织化学染色。(B)叶片O₂^－含量和MDA含量测定。(C)干旱处理16 d后，叶片中TaRBOHa、TaRBOHb、TaRBOHc、TaRBOHe和TaRBOHh基因的转录丰度。

7.TaHXK7-1A上游转录调控因子的筛选与验证

对TaHXK7-1A启动子序列的分析显示，它包含5个CANNTG基序。通过酵母单杂实验筛选上游转录调控因子，结果显示，存在TabHLH148-5A、TaRF2b-2B、TaABI5-3D、2个40S核糖体蛋白和2个未知蛋白。先前的研究发现，bHLH转录因子可以结合到含有核心CANNTG基序(ZH)的DNA序列上。因此，选择bHLH转录因子TabHLH148-5A作为候选基因。通过酵母单杂交及EMSA实验验证TabHLH148-5A编码蛋白作为TaHXK7-1A上游调控因子，可结合TaHXK7-1A启动子调控TaHXK7-1A基因表达。双荧光素酶检测结果显示，TabHLH148-5A抑制TaHXK7-1A启动子激活LUC基因表达(图8E和F)。这些结果表明，小麦TabHLH148-5A作为负调控因子，可以结合TaHXK7-1A启动子的CACGTG基序，进一步调控TaHXK7-1A的表达。

图8. TabHLH148-5A结合TaHXK7-1A启动子，调控TaHXK7-1A基因的表达。(A)酵母单杂交(Y1H) 载体结构示意图。(B)酵母单杂交TabHLH148-5A直接结合到TaHXK7-1A启动子上。(C) EMSA检测用WT探针和MT探针示意图。(D)EMSA。(E)双荧光素酶测定的效应因子和报告因子示意图。(F) LUC荧光成像及LUC荧光强度定量分析。

8.TaHXK7-1A相互作用蛋白的筛选和验证

通过酵母双杂交筛选小麦cDNA文库，其中4个阳性克隆为TaGRF3-4A。TaGRF3-4A基因编码14-3-3蛋白。据报道，大多数14-3-3蛋白在植物抗旱性中发挥重要作用。本研究将TaGRF3-4A作为候选基因。通过酵母双杂交，结果表明，Y2HGold酵母与pGBKT7-TaHXK7-1A和pGADT7-TaGRF3-4A共转化在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+X-α-gal培养基上均能正常生长(图9B)。荧光素酶测试结果显示，TaHXK7-1A-nLUC和TaGRF3-4A-cLUC可以在烟草叶片中瞬间表达，产生LUC信号(图9C)。这些结果表明TaHXK7-1A与TaGRF3-4A相互作用。

图9.酵母双杂交实验和荧光素酶互补成像实验。(A) pGBKT7-TaHXK7-1A酵母自激活实验。(B)候选基因相互作用的TaHXK7-1A酵母双杂交点对点检测。(C) 荧光素酶互补试验。

=== 总结 ===

 图10. TaHXK7-1A基因作用机制模型

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