2024年9月，中国科学院植物研究所乐捷教授团队在国际知名高水平期刊The Plant Cell上发表了题为The rice R2R3 MYB transcription factor FOUR LIPS
connects 3 brassinosteroid signaling to lignin deposition and leaf angle的论文。本研究通过研究水稻R2R3 MYB转录因子OsFLP，从其造成水稻叶片夹角增加的表型入手，观察了OsFLP的时空表达特性，找到了上游基因OsBZR1并发掘了其调控BR信号的功能，同时寻找到了下游的负调控因子OsGSK1，进一步完善了植物激素信号转导造成的木质素含量变化的转录水平通路，为后续的相关研究奠定了基础。![]()
=== 研究背景 ===
叶片夹角是评估水稻结构和产量的重要生物指标，研究叶片夹角形成的原因对提高水稻产量，促进其机械强度和抗逆性等方面有重要意义。油菜素类固醇信号（BR）已经被证实在叶片夹角的调节中发挥核心作用，因此发掘调控BR信号的转录因子对研究调控叶片夹角形成的分子机制十分重要。拟南芥中FLP是一种多效的转录因子，在对抗各种非生物胁迫中都发挥作用。但是对于水稻中的同系物OsFLP是否有类似的功能，目前还没有类似研究进展。
# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1. OsFLP突变导致水稻叶角增加
在先前的研究中，作者团队已经鉴定出了一种点突变的水稻Osflp-1。该突变体对非生物胁迫的耐受性降低，与野生型（ZH11）相比，Osflp-1幼苗的气孔发育异常，抗逆性降低，幼苗的叶片夹角显著增加（图1），而成年植株也呈结构松散的表型（图2A-B）。在重新导入Osflp-1 ProOsFLP:OsFLP-MYC（COM）后，突变体的表型呈回补趋势（图2C）。而RNAi的植株也和突变体呈现出了类似的表型（图1D）。以上的实验都验证了OsFLP对水稻植株结构的影响。为了进一步解析OsFLP对植株结构的影响，作者比较了植株第三片展开叶的叶片角度。野生型植株的展开叶角度为3°±3（图1E）。相比之下，在Osflp-1植株中，第三片展开叶的叶片角度增加（图1F），而互补系的叶片角度为相较突变体呈现出了回补表型。旗叶是水稻中靠近圆锥花序的最上部叶片，具有最高的光合能力。作者接下来测定了实验组中生长轴和旗叶的夹角。野生型夹角为3°±4，Osflp-1的旗叶弯曲形成了一个钝角。呈现出下垂的旗叶表型（图2L、J）。互补品系的旗叶夹角则减小（图2K、L）。为了进一步观察水稻植株的结构变化，作者对野生型水稻叶片的横切面进行了间苯三酚染色。结果发现，与叶片和叶鞘相比，叶片接合的位置在维管束边缘有更多被染成红色或深红色的细叶脉细胞。为了更好地描述叶片链接处发育的表型，作者将叶片远轴端和近轴端的中央维管束附近的叶脉细胞分别标记为0ab和0ad，并按顺序将其他部位按1-5分别编号。经过比较，作者发现野生型和Osflp-1在远轴端（Ab端）呈现出类似的细胞长度。但是在近轴端突变体的细胞长度显著变长。同时经过统计，作者发现位于0ab和1ab维管束之间的远轴侧的薄壁细胞的数量和长度相似（图2Q-S，图3F）。位于Osflp-1中4ab和5ab维管束（靠近边缘）之间的薄壁细胞明显长于野生型，而细胞数量相似（图2Q、T、U，图3F）。这些结果都表明OsFLP限制了叶缘附近的细胞伸长。![]()
图1：Osflp-1幼苗叶片夹角增加。
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图2：（A-D）Osflp突变体和RNAi苗呈叶片扩散表型，回补系中表型回补。（E-Q）突变体中第三片展开叶夹角变大，旗叶下垂，远轴端细胞长度增加，回补系表型回补。
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图3：（A-E）通过间苯三酚染色标记过后，作者定义的远轴端和近轴端叶片统计的方法。（F）近轴端突变体和野生型薄壁细胞的数量没有显著差别。（G）OsFLP的表达在发育中的叶连接处增强。（H-I）在1-3片展开叶中OsFLP的GUS信号均先出现于发育中的叶连接处。
为了进一步分析OsFLP发挥功能的位置，作者进行了RT-qPCR。结果发现，发育中的叶连接处OsFLP的表达增强（图3G）。作者又借助GUS系统观察OsFLP的表达情况。结果发现，GUS信号首先出现在了发育中的叶连接处（图4A-B），这种趋势在不同的展开叶上均相同（图3H-J）。接下来，作者检测了叶连接处发育过程中OsFLP的时空表达模式。在生长的第6天（S1期）没有检测到GUS信号，这表明OsFLP可能不需要启动叶连接处的发育。而在第9天（S2期）时，作者在中央维管束和其他较大的维管束中观察到了GUS信号（2ab、4ab等）。在12天（S3期）和15天（S4期）时，GUS信号出现在了新生的维管束里（图4C-F）。与此同时，近轴端也出现了GUS信号，而远轴端的GUS信号有所加强。
在18天（S5期）时，随着大多数的维管束停止发育，从远轴端中央维管束到叶缘附近的GUS信号逐渐减少，这表明OsFLP的表达情况和发育中叶连接处的生长情况是高度一致的。当来到23天（S6期）时，GUS信号仅存在于叶连接处了。（图4G-H）原位杂交也证实了OsFLP转录后首先出现在维管束和邻近的厚壁细胞中（图4I-J）。以上的实验表明，OsFLP在叶连接处动态表达与其生物学功能密切相关。![]()
图4：（A-B）OsFLP的GUS信号先出现于发育中叶连接处。（C/C’）叶连接处生长初期未检出GUS信号。（D/D’-F/F’）在6-15天时，GUS信号随维管束的逐渐发育增强（G/G’-H/H’）在18-25天时，GUS信号逐渐减弱。（I-J）原位杂交证实了OsFLP转录首先出现在发育中的叶连接处。
4.OsFLP介导BR信号造成叶连接处木质素沉积
接下来，为了进一步评估OsFLP是否也在植物激素相关的信号转导中发挥作用，作者检测了Osflp对IAA、BR和GA的反应。生长素的处理对叶片角度和叶片长度均无显著影响，而2-4油菜素内酯（eBL）和GA的处理会导致Osflp呈现处叶片松散的表型（图5A-D）。进一步的测量显示eBL促进了野生型和突变体的叶片伸长，并且显著增加了突变体的叶片间夹角（图5E-F）。为了研究OsFLP是否通过参与BR信号传导来影响叶片夹角，作者用不同浓度梯度的eBL处理野生型和突变体植株，发现eBL对叶片夹角的影响呈剂量效应（图6A），并且Osflp对eBL的敏感性更高。此外，在经过eBL和GSK3/SHAGGY样激酶抑制剂Bikini处理后，OsFLP转录水平显著降低。但是在经过BR生物合成抑制剂油菜素唑（BRZ）处理后，OsFLP转录水平则显著升高（图6B-C），这表明BR信号可能参与调控OsFLP的转录。eBL处理后48小时内，OsFLP转录水平呈下降趋势，这与先前GUS的结果一致（图6D）。同时，组织特异性GUS染色结果显示eBL处理后48小时内叶连接处OsFLP转录水平显著下降（图6E-L），证明了BR信号通路对OsFLP的转录起到了调节作用。接下来，作者选取了第二片叶连接处的横切面进行了木质素含量统计。经过间苯三酚染色后，作者发现Osflp突变体植株维管束和厚壁细胞中木质素含量显著低于野生型（图6M、N），而经过eBL和BRZ处理后，野生型植株维管束和厚壁细胞中的木质素水平受到eBL显著抑制和BRZ的显著增强（图6O-R）。但是突变体植株不受外源eBL和BRZ影响。经过统计作者发现，eBL会显著减少野生型近轴端和远轴端的木质素含量，而BRZ会显著增加木质素含量。但是突变体经过eBL和BRZ处理没有显著变化（图6S-T）。![]()
图5：（A-D）IAA处理对Osflp无显著影响，eBL和GA处理会造成植株叶片松散。（E-F）eBL促进了野生型和突变体的叶片伸长，并且显著增加了突变体的叶片间夹角。
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图6：（A）eBL对叶片夹角的影响呈剂量效应。（B-C）eBL和Bikini处理后，OsFLP转录水平降低，BRZ处理后，OsFLP转录水平则升高。（D）eBL处理后OsFLP转录水平逐渐降低。（E-L）eBL处理后48小时内叶连接处OsFLP转录水平显著下降。（M-T）野生型植株木质素含量受eBL显著抑制，受BRZ显著增强。OsBZR1是水稻BR信号通路中重要的转录因子。在对OsFLP的启动子序列进行分析后，作者发现了两个可能用于与OsBZR1结合的顺式作用元件（BRRE），它们分别位于ATG上游29bp和下游139bp处（图7A），作者分别设置了包含这两个元件的区段P1和P2。酵母单杂显示，OsBZR1可以结合OsFLP启动子上分别包含P1、P2以及包含P1-P2的区域（图7B），EMSA也显示，OsBZR1可以与P1、P2的特异性探针结合（图7C-D）。接着，作者创制了Osbzr1-D-Flag的突变体材料，并进行了ChIP-qPCR，结果显示染色质沉淀的DNA中包含P1和P2。以上结果证明，OsFLP是OsBZR1的直接靶基因。接着，作者创制了Osbzr1单突植株和Osbzr1 Osflp双突植株。RT-qPCR结果显示，OsFLP的转录水平在Osbzr1中显著升高（图7F）。同时，Osbzr1突变体呈现与野生型类似的叶片直立表型，而Osbzr1 Osflp双突植株和Osflp则呈现相似的叶片分散表型，测定第三片展开叶夹角、旗叶夹角后发现，Osbzr1的叶夹角和旗叶下垂趋势和野生型无明显差异，而Osbzr1 Osflp双突和Osflp单突的叶夹角增加，旗叶下垂的趋势类似（图7K-T）。这些结果表明，OsFLP可能作为OsBZR1的下游参与调控叶片夹角的变化。![]()
图7：（A）OsBZR1结合的顺式作用元件位置（B-E）酵母单杂、EMSA和ChIP-qPCR验证OsBZR1与P1和P2结合。（F）OsFLP在Osbzr1中表达量显著提高。（G-T）Osbzr1的第三片展开叶夹角、旗叶下垂程度和野生型类似。Osflp和Osbzr1 Osflp第三片展开叶夹角、旗叶下垂程度均显著上升，趋势一致。6.OsFLP连接OsBZR1信号传导和木质素沉积
根据先前的研究，木质素的积累会造成叶片的机械强度加大，从而促进叶片的直立。同时作者发现Osflp的突变体和野生型的第三片展开叶、旗叶的叶长和鲜重都没有显著差异（图8）。因此，作者假设Osflp叶片夹角的增大和旗叶的下垂是由于其机械强度下降导致的。为了验证猜想，作者用间苯三酚对野生型、Osflp、Osbzr1-Osflp、Osbzr1的第三片展开叶连接处进行了染色。可以发现，野生型的木质素积累主要出现在0ab,1ab,1ab’,2ab,2ab’这些位置，沉积的幅度较小（图9A）；而Osflp的表型跟野生型是类似的，但远轴端和近轴端的木质素积累显著变少（图9D-F），间苯三酚染色的总面积也小于野生型（图9M-N）。而在Osbzr1中，木质素主要积累在维管束附近的细胞中（图9G-I），间苯三酚染色的面积也要显著高于野生型（图9M-N），但是在近轴端与Osflp类似。这表明OsFLP可能在OsBZR1的下游发挥作用。先前的研究中，作者对Osflp进行了RNA-seq测序，并从中挑选出了115个在代谢途径中富集的DEG。其中第25和23个DEG分别富集在苯丙素的生物合成和苯丙氨酸的代谢中。于是作者选出苯丙素合成通路的相关转录因子家族OsPAL中的9个成员，测定了在eBL处理后各突变体中的表达情况。结果发现在Osflp和Osbzr1 Osflp中，OsPAL4和OsPAL6水平下调，表明它们可能受到OsFLP介导的BR通路的影响（图10）。为了进一步验证OsFLP对OsPAL4和OsPAL6转录的影响，作者通过双荧光素酶系统，将OsFLP和突变的mOsFLP设为E1和E2，OsPAL4和OsPAL6设为R1和R2。结果发现，R1和R2均可显著增加E1的LUC活性，而对E2无明显影响（图11A-C）。免疫共沉淀发现，OsFLP会显著增强OsPAL4和OsPAL6的富集（图11D-E）。EMSA进一步证实OsFLP与OsPAL4和OsPAL6启动子上特异性探针结合，而突变体mOsFLP则无法结合探针（图11F-G）。综上所述，作者认为OsFLP通过特异性调控OsPAL4和OsPAL6的转录，正向介导BR信号转导。![]()
图8：Osflp的突变体和野生型的第三片展开叶、旗叶的叶长和鲜重无显著差异。
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图9：（A-L）间苯三酚染色显示Osbzr1与野生型无显著差异，Osflp、Osbzr1 Osflp在近轴端呈类似表型。（M-N）染色面积结果显示Osflp、Osbzr1 Osflp在近轴和远轴端木质素含量均降低。
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图10：Osflp和Osbzr1 Osflp中，OsPAL4和OsPAL6水平下调。
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图11：（A-C）双荧光素酶证明OsFLP特异性激活OsPAL4和OsPAL6转录。（D-E）免疫共沉淀显示OsFLP会显著增强OsPAL4和OsPAL6的富集。（F-G）EMSA证明OsFLP与OsPAL4和OsPAL6启动子特异性结合。
7.OsFLP在负反馈通路中调节OsGSK1
接下来，作者通过对OsFLP进行ChIP-seq后发现，先前报导于BR信号转导相关的几个基因包含OsGSK1、OsBZR1、OsMADS22等。其中只有OsGSK1在Osflp中表达水平显著上调并在OsFLP-OE中显著下调（图12）。并且OsGSK1先前被证明过在植物发育中叶连接处表达。因此作者假设OsGSK1的组织特异性表达受到OsFLP的影响，分析了其启动子上OsFLP可能的结合位点。酵母单杂显示OsFLP与OsGSK1启动子中ATG上游500 bp内的区域结合（图13A-B）。EMSA显示，所设探针中Probe5包含3个假定的OsFLP结合位点，而mOsFLP无法与其结合（图13C-D）。ChIP-qPCR也证明OsFLP在体内与OsGSK1启动子直接结合（图13E）。接着，作者创制了Osgsk1单突和Osgsk1 Osflp双突植株，并发现它们也有叶片松散的表型（图13F-I）。经过统计，Osgsk1第三片展开叶夹角大于野生型，但显著小于Osflp。Osgsk1 Osflp的夹角在Osgsk1和Osflp之间（图13J-N）。而下垂旗叶的表型显示Osgsk1和野生型类似，Osgsk1 Osflp也造成了Osflp表型的回补。这表明OsFLP造成叶片下垂的表型可能受到于下游OsGSK1的抑制信号影响（图13O-S）。作者又通过免疫印记证明了OsBZR1更多积累在Osflp中，非磷酸化蛋白所占比例从野生型中的1.08上升到Osflp中的1.48，而在Osgsk1中下降到0.8。这与先前与报导OsGSK1在调节OsBZR1中的已知作用一致（图13T）。![]()
图12：OsGSK1在Osflp中表达水平显著上调并在OsFLP-OE中显著下调。
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图13：（A-B）酵母单杂显示OsFLP与OsGSK1启动子中ATG上游500 bp内的区域结合（C-D）mOsFLP不于OsGSK1启动子上特异性探针结合。（E）EMSA证明OsFLP与OsGSK1启动子体内特异性结合（F-S）Osgsk1第三片展开叶和下垂旗叶的表型与野生型类似，Osgsk1-Osflp也回补了Osflp造成叶片下垂的表型。（T）免疫印迹表明OsGSK1降低OsBZR1磷酸化蛋白比例。
=== 总结 ===
本文中，作者发现OsFLP传递通过OsBZR1介导的BR信号调控木质素生物合成，并通过OsGSK1-OsBZR1的反馈回路调节BR信号，从而整合BR信号以维持适当的叶片角度。本研究发现了一个新的转录因子介导的木质素生物合成通路，为进一步研究水稻的机械支撑结构提供了参考。
------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
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