2024年12月2日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心林鸿宣研究团队于国际知名期刊Molecular Plant发表了题为“ATT1-SCE1 module integrates ubiquitination and SUMOylation to regulate heat tolerance in rice”的研究论文。该工作中作者揭示了TT1通过与一个下游关键调控因子SCE1互作，并通过SUMO化修饰调控水稻耐热性的分子机制。本研究为水稻耐高温性状的遗传改良以及分子育种增产提供了新的理论基础。
研
究
背
景
随着全球变暖，当前农业生产受到来自高温胁迫的重大威胁。水稻(Oryza sativa)作为全球最重要的粮食作物之一，会随高温环境下温度提高而减产。因此探究水稻耐高温的分子机制是当前水稻育种的重点和热点。
TT1作为26S蛋白酶体的a2亚基发挥作用，参与泛素化介导的蛋白降解。已知TT3.1可作为响应热应激的传感器，通过信号传导给TT2，TT1随后作为TT2的下游效应子，在促细胞毒性蛋白降解方面发挥功能，以提高水稻在热应激条件下的存活率。然而TT1通过互作蛋白发挥功能的分子机制尚不明确。
类泛素蛋白修饰(SUMO化，SUMOylation)作为一类蛋白质翻译后修饰途径，其与蛋白质的泛素化有高度相似之处，SUMO化同样参与调控各种蛋白质的活性。SUMO蛋白通过与靶底物蛋白上的特定赖氨酸残基形成异肽键，过程涉及泛素激活酶、泛素结合酶、泛素连接酶和SUMO蛋白酶参与。
本研究中，作者通过鉴定了一个与TT1互作的SUMO E2结合酶SCE1，通过揭示SCE1作为水稻耐热的负调节因子，影响小热激蛋白(sHSP)的SUMO化从而发挥作用。该研究为水稻耐高温性状的遗传改良以及分子育种提供了新的理论基础。
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研
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结
果
一、SCE1作为耐热性的负调节因子并与TT1互作
为研究TT1调控水稻热胁迫的分子机制，作者首先使用酵母双杂交在随机文库中筛选得到了TT1的互作蛋白SUMO E2结合酶SCE1。进一步地，作者使用体外Pull-down、co-IP和Split-LUC证实了两者在体内体外的互作(图1A-D)。nYFP-SCE1和TT1-cYFP的亚细胞定位结果显示，两者在细胞内全局定位，且在细胞区室内形成了蛋白质复合物(图1E)。
为验证SCE1在响应热应激时的生物学功能，作者使用CRISPR-Cas9技术在日本稻品种WYJ的基础上生成了过表达株系和敲除株系。对植株的热处理结果显示，sce1-ko在幼苗期热处理后表现出增强的生长和更高的存活率，SCE1-OE则相反(图1F-I)。
由于sce1-ko突变体并未表现出拟南芥sce1突变体类似的发育停滞和胚胎致死表型，且sce1-ko、SCE1-OE与野生型之间并未观察到显著的生长差异，因此作者猜测同源基因OsSCE2/3可能存在功能补偿。系统发育分析和多序列比对的结果表明，OsSCE1、OsSCE2、OsSCE3和其他同源物具显著的序列相似性，且在整个进化过程中高度保守。
图1. SCE1作为耐热性的负调节因子并与TT1互作。(A) Y2H酵母双杂交。(B)体外Pull down。(C) Co-IP。(D) Split-LUC。(E) BiFC。(F)热处理处理后的植株表型。(G)SCE1-OE植株叶片中的SCE1水平。(H-I)热处理前后野生型和转基因植株的存活率。
二、TT1靶向SCE1进行26S蛋白酶体介导的降解
由于TT1常作为26S蛋白酶体的a2亚基参与泛素化蛋白的降解，因此作者猜测TT1同SCE1互作，在热应激期间将SCE1靶向26S蛋白酶体进行降解。使用抗SCE1的抗体对内源性SCE1蛋白水平进行检测，发现其蛋白水平随热处理的进行而降低(图2A、图S4A)，同时TT1的蛋白质水平随着热处理的延长而逐渐积累。对SCE1-OE中的SCE1进行泛素化水平的检测，发现多泛素化的SCE1水平增加，且K48连接的泛素化在SCE1中占主导地位(图2B)。由于该位点修饰常导致26S蛋白酶体介导的降解，这意味着SCE1很可能主要参与26S蛋白酶体介导的降解。
随后作者检查了TT1转基因系中SCE1的蛋白丰度。同野生型WYJ相比，tt1-ko中检测到了较高水平的SCE1蛋白，而过表达株系中则较低(图2C、图S4B)。在对野生型和TT1-OE进行4小时热处理，期间SCE1蛋白明显快速减少，而tt1-ko中未被观测到。这种变化趋势可以被26S蛋白酶体抑制剂MG132所抑制(图2D、图S4C)。作者还使用His标签标记，使用源自大肠杆菌原核表达的SCE1蛋白进行体外泛素化实验，得到了相同的结果，即MG132显著减弱了SCE1的降解(图2E、图S4D)。为研究26S蛋白酶体其他亚基是否参与调节SCE1，作者同样创制了编码a亚基的PAA2的敲除株系，并通过热处理实验和蛋白丰度和泛素化水平检测证实了PAA2与TT1一样，影响26S蛋白酶体的功能，从而影响SCE1的稳定性。
为进一步了解SCE1和TT1在遗传上的关系，作者创制了SCE1和TT1的双过表达株系和双敲除株系。在热处理下，sce1/tt1-ko与野生型相比表现出增强的耐热性，类似于sce1-ko。而SCE1/TT1-OE植物表现出更低的耐热性，类似于SCE1-OE(图1F、图2F-I；图S7D)。这些发现表明，SCE1在与TT1共同的遗传途径中响应热应激发挥作用，并可能在TT1的下游起作用。
图2. TT1靶向SCE1进行26S蛋白酶体介导的降解。(A)在热处理后SCE1蛋白水平检测。(B)使用泛素-K48抗体进行的泛素化水平检测。(C-E) SCE1蛋白质水平检测。(F-I)转基因植株表型及存活率。
图S4.体内和体外SCE1蛋白水平检测。
图S7.TT1-OE、tt1-ko、sce1/tt1-ko植株的表型特征。
三、SCE1编码SUMO E2结合酶，可在热处理时调节SUMO化水平
由于SCE1作为SUMO E2结合酶。为进一步研究SCE1在SUMO化途径中的作用，作者使用酵母双杂交筛选得到了SCE1在SUMO化活动中的潜在互作蛋白。结果显示SCE1与SUMO1及E3连接酶SIZ1、SIZ2和MMS21间存在相作(图3A)。为评估SCE1对SUMO结合物的影响，作者使用AtSUMO1抗体进行检测，发现SCE1-OE株系中SUMO结合物的水平明显高于野生型WYJ，而sce1-ko中SUMO结合物的水平则降低(图3B)。热胁迫下水稻中SUMO结合物的诱导模型则显示，SUMO结合物的水平在sce1-ko中下降得更快，在SCE1-OE中下降得更慢(图3D)，而tt1-ko显示出与SCE1-OE类似的动态模式，在热应激处理的1-4小时内观察到更高水平的此类结合物(图3E)。因此结合先前在这些材料中观察到的耐热表型，作者提出，高水平的SUMO结合物不一定赋予耐热性，而维持较低水平的SUMO结合物似乎可以提高高温下的耐热性。
图3. SCE1编码SUMO E2结合酶，可调节热处理后蛋白的SUMO化水平。(A) Y2H酵母双杂交。(B-E) SUMO化缀合物水平检测。
四、SCE1调节蛋白质折叠和重折叠过程以响应热应激
为了更深入地研究SCE1的分子机制，作者对正常条件和热处理下的sce1-ko和WYJ幼苗进行了转录组分析。正常条件下，两者仅检测到了498个DEG；通过热处理，相比于野生型，sce1-ko存在887个DEG上调，656个DEG下调(图4A)。富集分析表明，在热处理下，WYJ和sce1-ko间的DEG存在四个功能的富集，即翻译、错误折叠或不完全合成的蛋白质分解代谢过程、蛋白质折叠、蛋白质重折叠和未折叠蛋白质结合相关。
将以上四个簇进行热图构建，可发现正常环境下WYJ和sce1-ko的代表性基因转录水平之间并没有显著差异。在植株暴露于热应激环境时，sce1-ko相关基因转录水平上调以提高消除未折叠或错误折叠蛋白质的能力(图4E)。其中代表性基因Cpn60β1、CYP20-2和Hsp78.4水平上调的结果通过RT-qPCR得以进一步确定(图4F-H)。
为进一步确定SCE1作为SUMO E2结合酶如何影响细胞内蛋白质水平，作者使用免疫沉淀串联质谱分析(IP-MS)筛选了体内SCE1的互作蛋白(图4I)。其中Hsp24.1和Hsp40可以充当分子伴侣以促进受损蛋白质的重新折叠过程，随后作者使用Split-LUC验证了其与SCE1的互作(图4J-K)。结果表明了SCE1可能在转录和蛋白质水平上直接或间接地影响各种生物过程，包括与蛋白质折叠相关的途径。
图4. SCE1通过影响蛋白质折叠和重折叠途径以调节耐热性。(A)正常环境和热处理下WYJ和sce1-ko间DEG的Venn图。(B-E)基因注释、富集分析及热图。(F-H)相关基因表达水平验证。(I) IP-MS互作蛋白筛选。(J-K) Split-LUC。
五、小热激蛋白Hsp24.1参与SCE1介导的耐热途径
由于SCE1具负向调节耐热性，HSP可能正向调节耐热性，因此作者创制了Hsp24.1和Hsp40的敲除植株并评估了其耐热性，发现hsp24.1-ko和hsp40-ko对热应激更敏感(图5A)。作者由此推测SCE1可能通过SUMO化调节Hsp24.1的蛋白质稳定性，因此分析了野生型WYJ和sce1-ko幼苗中的Hsp24.1蛋白水平。发现热应激后sce1-ko中的Hsp24.1蛋白水平明显高于WYJ幼苗，过表达株系则相反(图5B-C)，此外tt1-ko中Hsp24.1蛋白水平显著下降(图5D)。
由于WYJ和sce1-ko幼苗中并未检测到Hsp24.1转录水平的上调，因此Hsp24.1的积累可能受到其SUMO化的影响。作者在随后体外SUMO化测定确认了Hsp24.1和Hsp40为SUMO底物，并确认了K157、K192、K206和K208为Hsp24.1的潜在SUMO化位点，当这四个赖氨酸残基突变为精氨酸残基时，Hsp24.1无法被SUMO化(图5F)。作者同样发现了Hsp24.1的SUMO化会影响其蛋白质稳定性，而sce1-ko中SCE1的缺失会阻止Hsp24.1的降解(图5G-H)。
图5. Hsp24.1响应耐热性，其蛋白丰度在sce1-ko植株中得到积累。(A)热处理前后植株表型。(B–D)植株中Hsp24.1的蛋白水平检测。(E-F)使用水稻和拟南芥的SUMO1和SCE1进行Hsp24.1的SUMO化水平检测。(G-H) Hsp24.1及其SUMO化位点突变体(Hsp24.1M)的蛋白降解水平检测。
六、SCE1编码SUMO E2结合酶，并影响植物高温耐受性
为评估水稻于高温胁迫下SCE1的耐热性在生产中的意义，作者使用温室内抽穗期的水稻植株进行了高温处理(整个生长季处理温度高于38°C)，相较于野生型WYJ，敲除SCE1可赋予水稻植株作物高温耐受性，并显著减少由高温胁迫造成的粮食产量损失，为培育高耐热作物提供了新的策略。
图6.sce1-ko植株在高温胁迫下表现出更高的结实率和谷物产量。(A)温室培养下，野生型WYJ和sce1-ko的穗部形态及单株总粒数。(B-D)谷物产量指标测定，包括结实率(B)、千粒重(C)和单株产量(D)。(E)地块产量统计。
总
结
在本研究中，作者通过鉴定SUMO E2结合酶SCE1这一与TT1互作的关键因子，揭示了SCE1作为水稻耐热的负调节因子，通过影响小热激蛋白(sHSP)的SUMO化水平最终影响水稻的高温耐受性。该研究为水稻耐高温性状的遗传改良以及分子育种提供了新的理论基础。
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