2024年9月，浙江农林大学卢孟柱/张进教授团队在植物学期刊Plant, Cell & Environment在线发表了题为“SUPERMAN targets PHRAGMOPLAST ORIENTING KINESIN to negatively regulate leaf cell division in poplar”的研究型论文。该研究指出C2H2型锌指蛋白PagSUPa可以调节胞质分裂相关基因的表达，特别是通过直接抑制PagPOKs的表达和膜质体扩张，从而阻碍胞质分裂导致形成异常的叶片形态，为叶片发育过程中细胞分裂的调控提供了新的见解。
研
究
背
景
叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的主要器官，是植物与外界进行水、气交换的重要门户。叶片的发育是一个复杂的、动态的过程，是连续的外观形态和分子水平上的变化，主要包括五个过程：叶原基起始、细胞增殖、过渡阶段、细胞扩张和分生组织分裂。细胞增殖与扩张能直接影响叶片大小和形态。
在植物细胞核分裂结束后，细胞中央形成细胞板，实现2个子代细胞的细胞分离。高等植物体细胞的胞质分裂是借助成膜体和细胞板的协同作用来完成。细胞板的形成是由细胞膜质体（PP）的囊泡运输引导的。PP是一种富含微管（MTs）、微丝（MFs）和内质网（ER）高度动态的细胞骨架结构，是后期和末期细胞板囊泡运输的轨道。早前期带（PPB）是另一富含MTs、MFs、ER的细胞骨架结构，形成于细胞膜下的细胞皮层，决定细胞分裂，预测新的细胞板和亲本细胞壁之间的皮质分裂区。成膜体定位蛋白PagPOKs参与细胞板形成，影响胞质分裂。
锌指蛋白（ZFPs）是一类大规模调控因子，在细胞生长、发育和分化过程中发挥着重要作用。ZFPs不仅作为转录因子调控转录，还参与RNA代谢、细胞发育、分化、增殖、凋亡等生物学过程，其中C2H2型锌指蛋白是最为经典的一种。SUPERMAN（SUP）是细胞增殖与分化的关键调控因子。SUP属于Q-type C2H2锌指蛋白，其特点为含有两个典型的C2H2锌指结构，一个是对其DNA结合活性至关重要的保守QALGGH基序，另一个是乙烯反应元件结合因子相关的抑制因子EAR。作者通过对PagSUPa基因的深入研究，阐明了其在叶片发育过程中的调控机制。
研
究
结
果
作者通过毛果杨中的C2H2-ZFP基因序列在‘84K’杨树中blast筛选出123个PagZFP，并对其进化关系分析，结果显示123个杨树C2H2-ZFP分为四个亚族（图1A），其中各亚族中包含的C-C-H-H基序有所不同（图1B），第一亚族中仅仅只包含一个C2H2基序。通过对其结构域分析发现第一亚族中均包含植物特异性序列“QALGGH”，并且在第一亚族中还包含有一些特异的“DLELRL”残基（图1C、D）。
随后作者又对‘84K’杨树中C2H2-ZFP基因的表达模式进行分析，基因的表达模式与基因的功能相关，而顺式作用元件在基因的调控中发挥着关键的作用。因此作者分析了‘84K’杨树C2H2-ZFP基因的启动子顺式作用元件，发现C2H2-ZFP基因可能主要响应环境胁迫、参与植物激素传导（图2A-C)。进一步在‘84K’表达数据库中分析发现第一亚族中含有抑制结构域的基因表达都比较特异（图2D）。这些基因在一些组织中的特异性表达表明它在组织发育过程中的独特作用，自发的抑制性结构域可能是关键原因。
3.PagSUPa的表达和亚细胞定位
（A）PagSUPa在非转基因杨树（CK）和两个PagSUPa过表达株系（OE#2和OE#7）中的相对表达量；（B）CK和PagSUPa OE植株叶片的表型；（C）叶面积；（D）叶长；（E）叶宽；（F）叶绿素含量。
5.PagSUPa过表达植株抑制细胞分裂
（A）CK和PagSUPa OE植株叶片细胞；（B）细胞面积统计；（C）细胞扩增速率统计。
6. PagSUPa过表达调节叶近轴-远轴极性导致叶片弯曲
作者通过比较叶片表型，发现过表达植株的叶片相比于CK更加卷曲，叶片大多是凹陷的，并且向近轴侧弯曲，这在叶尖边缘更为明显（图6A）。统计分析发现过表达植株叶片纵向曲率指数和横向曲率指数均显著高于CK（图6C、D）。这些结果表明PagSUPa过表达可以影响叶片的曲率。为了确定弯曲叶片的极性是否发生改变，作者研究了不同层叶片细胞的排列和形状。发现CK植株叶片中栅栏叶肉细胞垂直拉长且密集排列，而海绵状叶肉细胞形状不规则且排列松散。而在PagSUPa过表达植株中却很难区分这两种细胞（图6B）。作者通过测量叶片近轴和远轴高宽比<1的细胞来进行量化比较，结果表明在近轴侧，PagSUPa过表达植株叶片中高宽比<1的细胞数显著高于CK，导致叶片近轴-远轴极性发生改变，引起叶片卷曲。
（A）CK和PagSUPa OE植物叶片表型；（B）叶片的横截面图，PM，栅栏叶肉细胞；SM，海绵叶肉细胞；（C）叶片纵向曲率指数。（D）叶片横向曲率指数；（E）叶肉细胞高宽比<1统计结果。
为了研究PagSUPa如何影响细胞分裂和细胞大小，作者对CK和过表达植株叶片进行RNA-seq分析，共鉴定出3000个下调差异表达基因，3767个上调差异表达基因（图7A，B）。由于PagSUPa可能是转录抑制因子，作者进一步分析了这些下调差异表达基因，蛋白质功能分类表明，下调的DEG主要富集在微管过程、细胞壁组织或生物发生中（图7C）。作者对参与囊泡运输、微管运动和细胞壁组织相关的一些主要差异表达基因进行qRT-PCR检测，结果发现在转基因植物中这些基因都下调，与RNA-seq结果一致（图7D、E）。以上结果表明PagSUPa过表达会抑制微管运动及细胞壁合成相关基因的表达，进而影响细胞分裂。
（A、B）RNA-seq结果中差异表达基因；（C）下调差异表达基因GO富集分析；（D）微管过程相关差异表达基因的表达水平；（E）细胞壁组织相关差异表达基因的表达水平。
成膜体定位蛋白PagPOKs参与细胞板形成，影响胞质分裂。为了研究PagSUPa是否通过结合PagPOKs的启动子直接调控PagPOKs的表达而参与细胞分裂，作者首先分析了它们的启动子序列发现都含有C2H2的结合位点（图8A）。随后通过酵母单杂杂交（Y1H）、电泳迁移试验（EMSA）和双荧光素酶报告基因实验证实了PagSUPa直接抑制PagPOK1和PagPOK2的表达而负调控细胞分裂。
总
结
通过系统发育树、基因结构、保守基序和基因表达模式对‘84K’杨树的C2H2-ZFPs进行了全面的鉴定。PagSUPa是I型C2H2-ZFP基因，包含植物特异性保守的“QALGGH”和抑制残基“DLELRL”，PagSUPa基因参与杨树叶片发育，PagSUPa过表达抑制叶片细胞增殖使叶片面积减小，此外，PagSUPa能够直接负调控成膜体定位蛋白PagPOKs基因的表达抑制细胞有丝分裂过程细胞板的形成，减缓胞质分离，改变细胞形态，最终影响叶片发育。
正常情况下，PagSUPa的表达维持一般水平，下游基因PagPOKs以及相关微管和细胞壁组织相关的基因大量表达，参与细胞板的形成。而在干旱胁迫下，PagSUPa的表达显著增加，从而抑制PagPOKs和微管过程相关基因的表达，导致细胞骨架排列错位和细胞壁错位，影响细胞板与细胞壁形成。
投稿日期：2024.07.25
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