2024年2月北京林业大学康向阳团队在New Phytologist上发表了题为MYC2 regulates stomatal density and water use efficiency via targeting EPF2/EPFL4/EPFL9 in poplar的论文。作者基于三倍体杨转录组数据和三基因互作算法构建了网络，发现PpnMYC2与气孔发育相关基因PpnEPF2、PpnEPFL4和PpnEPFL9相关。PpnMYC2和PagJAZ之间的相互作用经过实验验证。PpnMYC2过表达的杨树和拟南芥的气孔密度降低。过表达PpnMYC2的杨树具有更高的水分利用效率和抗旱性。PpnMYC2可以促进气孔密度抑制基因PagEPF2和PagEPFL4的表达，并抑制气孔密度激活基因PagEPFL9的表达。而在三倍体杨的气孔形成过程中，PpnMYC2、PpnEPF2和PpnEPFL4显著上调，而PpnEPFL9下调。本研究结果对于揭示植物气孔发生和多倍体气孔密度的调控机制，以及通过过表达MYC2降低气孔密度、提高植物水分利用效率具有重要意义。
=== 研究背景 ===
气孔是植物叶片表面的通道，主要通过气孔进行蒸腾作用和二氧化碳吸收，对维持植物光合作用和水分利用效率起着至关重要的作用。多种影响因素调控气孔发育，其中参与气孔发育各阶段调控的关键转录因子包括bHLH型转录因子成员SPEECHLESS（SPCH）、MUTE、FAMA、SCREAM（SCRM）和SCRM2，以及R2R3型MYB。还有EPF/EPFL家族的基因间接影响气孔发育，例如EPFL9正向调节气孔密度，EPF1和EPF2负向调节气孔密度。
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=== 研究结果 ===
1. 三倍体杨叶气孔密度较低，气孔尺寸较大
据报道，三倍体杨树与全同胞二倍体杨树（三倍体同一亲本的后代）相比，具有显著的营养生长和抗性优势。最显著的优点是高度更高、基部直径更大、抗旱性更强。作者发现三倍体杨树比二倍体杨树更高，叶片尺寸和叶面积更大（图1a，b，c）。较大的叶面积导致三倍体的气孔密度显著低于二倍体，气孔尺寸显著大于二倍体（图1d，e）。相比之下，FDR型和SDR型三倍体叶片的保卫细胞比二倍体叶片更长更宽（图1f，g）。作者又根据气孔和表皮细胞的数量进行气孔指数计算，发现FDR型和SDR型三倍体的气孔指数也显著低于二倍体（图1h）。
图1 二倍体和三倍体杨的表型。(a)三个月大的三倍体和二倍体杨树。(b)二倍体和三倍体杨叶。(c)二倍体和三倍体杨树的叶面积。（d）二倍体和三倍体杨树气孔的扫描电子显微照片。(e)二倍体和三倍体杨树的气孔密度。（f）二倍体和三倍体杨树保卫细胞的长度。(g)二倍体和三倍体杨树保卫细胞的宽度。(h)二倍体和三倍体杨树的气孔指数。
作者筛选出17个与上游转录因子相关的参与气孔形成过程的通路基因，以及上游转录因子和通路基因。利用基于TGMI算法的网络构建，作者发现MYC2与气孔发育相关基因高度相关（图2a）。同时，我们发现MYC2、EPF2和EPFL4在三倍体杨树中均上调，并且在数据集中呈正相关，而EPFL9在三倍体杨树中下调，并在数据集中与MYC2呈负相关。因此，作者假设PpnMYC2特异性靶向PpnEPF2、PpnEPFL4和PpnEPFL9来调节三倍体杨树的气孔密度和WUE。
根据转录组测序数据，PpnMYC2在三倍体杨的顶芽中高表达。为了研究MYC2的组织特异性表达模式，作者发现其主要在杨树的幼叶中表达（图1）。作者对从3个月大的三倍体及其全同胞二倍体杨树中收集的9个不同的组织使用qRT-PCR来定量MYC2、EPF2、EPFL4和EPFL9。PpnMYC2在二倍体和三倍体杨树中具有大致相似的组织特异性表达模式。PpnMYC2在顶芽中的表达最高，并且表达水平随着叶数的增加而降低（图2b）。因此，该基因可能主要在顶芽和幼叶中发挥作用。与二倍体相比，PpnMYC2在三倍体的顶芽、第三叶位置和幼茎段中显著表达（图2b）。此外，作者还发现PpnEPF2和PpnEPFL4在二倍体和三倍体杨树中的表达趋势与PpnMYC2非常相似，并且在幼苗组织中也有较高水平的表达（图2c，d）。但是PpnEPFL9在二倍体和三倍体杨树中具有与PpnMYC2相反的表达趋势（图2e）。
为了研究气孔密度是否与三倍体中的高PpnMYC2表达相关，作者测量了从三个群体中随机选择的三个基因型中的PpnMYC2表达。通过qRT-PCR反应检测各基因型顶芽、第三叶和第五叶中PpnMYC2的表达水平（图S6）。结果表明，PpnMYC2在不同二倍体和三倍体基因型中的表达量与气孔密度呈负相关。
为了确定PpnMYC2的亚细胞定位，作者获得了35S::PpnMYC2-GFP和35S::GFP载体，并在本塞姆氏烟草叶子中瞬时表达它们（图2f）。DAPI染色证实35S::PpnMYC2-GFP融合蛋白定位于细胞核，而35S::GFP对照蛋白分布于细胞核和细胞质（图2g）。
为了确定PpnMYC2是否具有转录活性，作者进行了转录活性测定。结果显示，携带GALBD-PpnMYC2和阳性对照的转化子在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/Ade/-His培养基上生长良好，而携带阴性对照pGBKT7载体的转化子则不能正常生长（图2h），表明GALBD-PpnMYC2融合蛋白在酵母细胞中具有激活活性。
图2 PpnMYC2、PpnEPF2、PpnEPFL4、PpnEPFL9在三倍体杨中的表达分析及PpnMYC2的亚细胞定位和转录激活分析。（a）由三基因相互作用（TGMI）算法生成的气孔发育途径的调控网络。PpnMYC2(b)、PpnEPF2(c)、PpnEPFL4(d)和PpnEPFL9(e)在二倍体和三倍体杨树中的组织特异性表达。(f)pBI121-PpnMYC2-GFP的载体构建图。(g)PpnMYC2蛋白的亚细胞定位。(h)酵母细胞中PpnMYC2的反式激活测定。
为了研究PpnMYC2是否与杨树中的JAZs相互作用，作者从84 K杨树中克隆了四个JAZ基因：PagJAZ10、PagJAZ1-2、PagJAZ1-5和PagJAZ1-6。作者使用Y2H系统测试了PpnMYC2与四个PagJAZ之间的互作。PpnMYC2和PagJAZ10、PagJAZ1-2、PagJAZ1-5和PagJAZ1-6之间的相互作用通过梯度稀释得到证明（图3a）。作者又使用分裂荧光素酶互补测定来验证PpnMYC2和PagJAZs之间的相互作用。结果表明，只有PpnMYC2和PagJAZs在同一位点共表达才会引起荧光素酶重塑和更强烈的荧光信号（图3b）。使用GST-PpnMYC2重组蛋白的体外Pull-down实验显示其与PagJAZ10-His6、PagJAZ1-2-His6、PagJAZ1-5His6和PagJAZ1-6-His6直接相互作用（图3c）。基于以上结果，PpnMYC2与PagJAZ10、PagJAZ1-2、PagJAZ1-5和PagJAZ1-6相互作用。
图3 PpnMYC2与PagJAZs相互作用。(a)PpnMYC2和PagJAZs的共转化子的酵母细胞在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基上于30°C生长3 d。(b)分裂荧光素酶互补测定揭示了PpnMYC2和PagJAZs之间的相互作用。(c) Pull-down 测定显示PpnMYC2和PagJAZs之间的体外相互作用。
4.PpnMYC2调节PpnMYC2转基因系中的气孔密度
为了测试三倍体杨树气孔密度的降低是否是由PpnMYC2的高表达引起的，作者首先在拟南芥中过表达PpnMYC2。结果显示过表达的PpnMYC2品系的气孔密度和气孔指数显著低于WT。过表达的PpnMYC2株系的保卫细胞的长度和宽度显著大于WT。作者又构建了杨树PpnMYC2过表达和干扰转基因系（35S::PpnMYC2-GFP-nos和35S::PpnMYC2-Loop-PpnMYC2-nos载体）。
根据之前获得的基因调控模块结果，作者认为PpnMYC2调控EPF2、EPFL4和EPFL9的表达，从而改变叶片中的气孔密度。为了验证这一点，作者观察了转基因杨树和野生杨树的气孔密度。过表达转基因株系第10片叶的气孔密度比WT的小，而RNAi转基因株系则更大（图4b，c）。气孔指数显示出类似的趋势，PpnMYC2-OE品系的气孔指数显著低于WT，而PpnMYC2-RNAi品系相反（图4d）。但保卫细胞长度和宽度差异不显著（图4e，f）。
基于上述表型变化，气孔密度也应该影响WUE；因此，作者确定了不同线路的气体交换参数。作者发现PpnMYC2-OE杨树的净CO2同化量（A）、气孔导度和瞬时WUE（Gs）显著高于WT杨树，蒸腾速率（Tr）低于WT，而PpnMYC2-RNAi则相反（图4g-j）。因此，作者推测PpnMYC2可能通过影响EPF2/EPFL4/EPFL9的表达来降低气孔密度，从而增加杨树的WUE。
图4 PpnMYC2过表达和干扰对杨树气孔密度和WUE的影响。5周龄幼苗表型(a)、气孔表型(b)、气孔密度(c)、气孔指数(d)、保卫细胞长度(e)，保卫细胞宽度(f)。(g)净二氧化碳同化(A)–光曲线。（h）气孔导度（Gs）-光曲线。(i)蒸腾速率(Tr)–光曲线。(j)瞬时WUE-光曲线。
5.PpnMYC2-OE转基因杨树的转录组分析表明气孔发育相关基因被激活
由于表型变化，特别是PpnMYC2-OE系中较低的气孔密度，作者在PpnMYC2-OE和WT 84K杨树上进行了RNA-seq实验。通过比较转基因和野生型84K杨树，总共鉴定了14741个DEG。在这些DEG中，7480个上调，7261个下调（图5a）。对14741个DEG进行Gene Ontology富集分析，揭示了细胞应激反应途径（GO：0033554，59个基因）、碳水化合物生物合成过程（GO：0016051，55个基因）、超氧化物代谢过程（GO：0006801，11个基因）和光系统I反应中心（GO：0009538，12个基因）显著富集（图5b）。通过KEGG富集分析发现，光合生物中的碳固定、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、赖氨酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢以及植物昼夜节律显著富集（图5c）。
作者又筛选了PpnMYC2-OE和WT植物中与气孔发育相关的基因，发现与气孔密度相关的基因，如PagEPF2、PagEPFL4、PagTMM、PagERECTA和PagYDA显著过表达，而PagEPFL9显著下调表达，同时直接促进气孔形成的基因（例如PagSCRM、PagMUTE和PagFAMA）的表达水平降低。PpnMYC2的过表达还影响气孔分化相关基因PagMYB88、胞质分裂相关基因PagSCD1和PagCYCA2;1、MAP激酶相关基因PagMPK6、PagMPK15、PagMPK20、PagMPK3、PagMPK4、PagMKK2、PagMKK3、PagMKK4和PagMKK6的表达。PagPHYB的表达水平也显著不同（图S11；表S5）。因此，作者利用qRT-PCR检测这些基因的表达水平。PpnMYC2-OE植物中PagEPF2、PagEPFL4、PagTMM、PagERECTA、PagYDA、PagMYB88、PagSCD1、PagCYCA2;1、PagPHYB、PagMKK6和PagMPK20的表达水平显著上调，PagEPFL9、PagMUTE和PagFAMA的表达水平显著下调（图5d）。所以作者推测PpnMYC2对植物气孔密度的影响是由于上述基因的影响。
图5 PpnMYC2-OE和野生型(WT)杨顶芽的转录组分析。(a)火山图中显示了已识别的差异表达基因(DEG)。(b)PpnMYC2-OE和WT植物中DEG的GO术语富集。(c)PpnMYC2-OE和WT植物中DEG的KEGG富集分析。(d)WT和PpnMYC2-OE植物中相关基因的qRT-PCR。
6.PpnMYC2通过调节PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9来调节气孔密度
基于前文发现，作者假设PpnMYC2直接促进PagEPF2和PagEPFL4的表达，并直接抑制PagEPFL9的表达。为了测试这一点，作者首先使用PlantCARE数据库分析了PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9启动子的顺式元件，发现了一系列参与植物发育的顺式元件，包括光响应元件，又分别在PagEPFL4和PagEPFL9启动子序列中发现了一系列与植物发育相关的顺式元件和可以被MYC转录因子结合的基序。
通过将PpnMYC2的蛋白序列与毛果杨和拟南芥的MYC2进行比较，作者发现它们在447-501区域具有相同的结构域，推测其与拟南芥的MYC2具有相同的结合元件。在分析84K杨中PagEPF2翻译起始位点上游的2kb近端启动子区域后，作者发现PpnMYC2结合位点的顺式元件（CACGTG）位于PagEPF2启动子上游785bp处。为此作者扩增了2kb启动子区域和c基序侧翼150bp（总共300bp），并将它们命名为PagEPF2p和PagEPF2p-1。用相同方法作者扩增了PagEPFL4和PagEPFL9的启动子区域，并分别命名为PagEPFL4p、PagEPFL4p-1和PagEPFL9p、PagEPFL9p-1（图6a）。然后，作者使用启动子区域来驱动酵母单杂交系统中的LacZ报告基因。作者发现PpnMYC2与PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9启动子区域中的CACGTG和CATGTG基序稳定地相互作用。PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9启动子片段中该顺式元件序列的突变使PpnMYC2无法结合（图6b）。
为了进一步验证结合，进行EMSA以确定PpnMYC2是否能够在体外直接结合PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9启动子。如图6(c-e)所示，PpnMYC2特异性结合含有正常CACGTG和CATTGG序列的启动子片段。此外，ChIP-qPCR显示，与WT相比，ChIP中PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9的启动子片段在OE叶中显著富集，富集程度>10倍（图6f-h）。这些结果证实PpnMYC2可以在体内结合PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9启动子。
为了检查了PpnMYC2是否可以直接调节PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9的转录，作者使用双荧光素酶报告基因测定。作者先构建了35S::PpnMYC2 effector,、PagEPF2p::LUC、PagEPF2p_mutant::LUC、PagEPFL4p::LUC、PagEPFL4p_mutant::LUC、PagEPFL9p::LUC、PagEPFL9p_mutant::LUC报告质粒（图6i），将含有上述质粒的农杆菌注射到本塞姆氏烟草叶片的表皮细胞中。结果表明在PpnMYC2和PagEPF2p、PpnMYC2和PagEPFL4p、PpnMYC2和PagEPFL9p存在的情况下，PagEPF2p::LUC或PagEPFL4p::LUC报告基因被激活，PagEPFL9p::LUC报告基因被抑制，但在其他情况下则不然（图6j–m,o,q)。接下来，作者验证了转基因株系中PagEPF2、PagEPFL4、PagEPFL9和PpnMYC2表达之间的相关性。qRT-PCR反应分析表明，PagEPF2和PagEPFL4在PpnMYC2-OE叶片中的表达得到促进，而在PpnMYC2-RNAi叶片中的表达受到抑制（图6n，p），PagEPFL9则相反（图6r）。实验结果证明PpnMYC2直接结合PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9的启动子，促进PagEPF2和PagEPFL4的表达并抑制PagEPFL9的表达。
图6 PpnMYC2直接结合PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9启动子。(a)PagEPF2/PagEPFL4/PagEPFL9启动子中推定的PpnMYC2结合元件。(b)Y1H测定显示PpnMYC2与PagEPF2/PagEPFL4/PagEPFL9启动子中的元件直接结合。(c-e)电泳迁移率变动测定显示GST-PpnMYC2重组蛋白与生物素标记的PagEPF2、PagEPFL4和PagEPFL9探针结合。(f–h)ChIP-qPCR分析。(i)效应子和报告子的载体结构图。(j)瞬时表达测定显示PpnMYC2直接促进PagEPF2的表达。(k)瞬时表达测定显示PpnMYC2直接促进PagEPFL4的表达。(l)瞬时表达测定显示PpnMYC2直接抑制PagEPFL9的表达。(m)PagEPF2p:: LUC表达的双荧光素酶测定。(n)PagEPF2表达的qRT-PCR分析。(o)PagEPFL4p:: LUC表达的双荧光素酶测定。(p)PagEPFL4表达的qRT-PCR分析。(q)PagEPFL9p::LUC 表达的双荧光素酶测定。(r)PagEPFL9表达的qRT-PCR分析。
7.PpnMYC2增强干旱胁迫下杨树的耐旱性
为了探讨PpnMYC2在干旱胁迫响应中的作用，作者将WT、PpnMYC2-OE和PpnMYC2-RNAi杨树置于干旱胁迫下。第12天，PpnMYC2-RNAi植株的叶子严重枯萎，WT植株的叶子也开始枯萎，而PpnMYC2-OE植株的叶子仍然丰满（图7a）。恢复浇水2d后，WT和PpnMYC2-OE植物的表型恢复，而PpnMYC2-RNAi植物的表型没有显著变化（图7a）。
对照条件下，WT、PpnMYC2-OE和PpnMYC2-RNAi杨的生理指标没有显著差异（图7b-g）。干旱胁迫下，PpnMYC2-OE杨的过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）酶活性显著高于WT杨，而PpnMYC2-RNAi杨树的各项指标显著低于WT杨树（图7b-e）。同时，PpnMYC2-OE杨树的MDA含量和H2O2含量显著低于WT杨树，而PpnMYC2RNAi杨树的这些含量显著高于WT杨树（图7f，g），这表明PpnMYC2-RNAi杨树的细胞膜受害最严重。数据显示，自然脱水条件下，PpnMYC2-OE杨树成活率最高，显著高于WT，PpnMYC2-RNAi杨树成活率最低（图7h）。 并且PpnMYC2-OE杨叶离体失水速率比WT和PpnMYC2RNAi杨叶慢（图7i）。总体而言，在干旱胁迫下，PpnMYC2通过降低气孔密度来增强植物抗旱性。
图7 PpnMYC2增强杨树的耐旱性。(a)干旱测定中的形态差异。正常和干旱胁迫条件下WT、PpnMYC2-OE和PpnMYC2-RNAi植物叶片中的CAT(b)、POD(c)、SOD(d)和APX(e)酶活性。正常和干旱胁迫条件下，WT、PpnMYC2-OE和PpnMYC2-RNAi植物叶片中的MDA含量(f)、H2O2含量(g)、成活率(h)和失水量(i)。
=== 总结 ===
研究表明，气孔密度受EPF/EPFL家族多个基因的影响，但迄今为止，它们在多倍体杨树中的作用仍不清楚，多倍体植物叶片气孔密度低于二倍体植物叶片的原因也不清楚。本研究证明MYC2是调节气孔密度抑制因子EPF2和EPFL4以及气孔密度促进因子EPFL9的转录因子并且可以与JAZ10、JAZ1-2、JAZ1-5、JAZ1-6相互作用（图8a）。因此，PpnMYC2可能通过促进PagEPF2和PagEPFL4的表达并抑制PagEPFL9的表达来促进气孔发育相关基因PagTMM和PagERECTA的表达，从而影响植物中的气孔密度。同时气孔形成过程中MYC2和EPF2/EPFL4表达显著上调以及EPFL9表达下调是三倍体杨气孔密度降低的部分原因（图8b）。本研究揭示了PpnMYC2影响植物气孔密度的分子机制，为分析多倍体植物气孔密度变异的原因提供了一定的理论支持，并为节水植物的分子设计育种提供了有意义的靶基因。
图8 MYC2调节植物的气孔密度模式。(a)MYC2与JAZ蛋白相互作用并促进EPF2或EPFL4的表达并抑制EPFL9的表达。EPF2、EPFL4和EPFL9可以与受体TMM或ERECTA结合并促进或抑制它们的表达，最终降低气孔密度。（b）多倍体植物叶片气孔密度降低的调控模型。橙色表示多倍体植物气孔形成过程中上调的基因，蓝色表示多倍体植物气孔形成过程中下调的基因。基因旁边的直方图表示该基因在二倍体和三倍体杨树中的FPKM值。实线箭头代表促进作用，没有箭头的实线代表抑制作用。
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