2024年1月，西南科技大学树木生物学团队于国际知名期刊The
Plant Cell在线发表了题为“ELONGATED
HYPOCOTYL 5a modulates FLOWERING LOCUS T2 and gibberellin levels to control
dormancy and bud break in poplar”的研究论文，揭示了HY5a在杨树季节性生长周期中的关键调控作用。
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植物进行生长-休眠的季节性周期调节是北方温带地区多年生植物的一个显著特征。当树木感知到冬季来临的环境信号变化(如光照、温度)时，植物会通过停止营养生长而进入休眠状态。树木已经进化出一个复杂的调节网络来感知光周期信号，包括光敏色素-光感受器、生物钟等一系列基因协同调节响应环境。
在木本模式植物杨树中，已经报道了部分光周期途径的调节模型，然而这些调节模型不能完全解释杨树在光温变化下产生的表型。FLOWERING LOCUS T (FT)杨树直系同源物的下调可触发SD诱导的杂交杨的休眠。已知FT2在木本植物的开花和季节性生长中发挥着双重作用，基于此作者推测还存在其他途径对FT2进行微调，以促使FT2在光温信号变化下合理发挥功能作用。# 思维导图：
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1. PtoHY5a直接结合并激活杨树FT2启动子作者首先利用酵母单杂交(Y1H)使用FT2启动子筛选得到了拟南芥ELONGATED HYPOCOTYL5的同源物，PtoHY5a (图1 A)。为进一步验证PtoHY5a和FT2之间的关系，作者在烟草叶片和杨树原生质体中瞬时表达进行双荧光素酶报告实验验证，相比对照，两者LUC活性分别增强了3倍和4.5倍。但当FT2上的ACE基序发生突变时，LUC活性没有显著变化(图1 B-E)。EMSA的实验结果同样支持了PtoHY5a可以通过与FT2启动子的ACE基序结合来激活其表达(图1 F)。图1. PtoHY5a通过直接结合PtoFT2的启动子来激活PtoFT2。(A) Y1H。(B-E)双荧光素酶报告实验。(F) EMSA。2. PtoHY5a进化保守、普遍表达且定位于细胞核作者进行系统发育分析鉴定，结果揭示了HY5在不同植物物种中高度保守。而杨属(毛白杨和毛果杨)中发生了基因复制，导致存在两个HY5同源基因HY5a和HY5b，RT-qPCR显示两者存在时空表达上的差异(图S3 A-B)。为测试PtoHY5b是否也能像PtoHY5a一样激活PtoFT2表达，作者进行了双荧光素酶报告测定。结果表明，PtoHY5b不能激活烟草或杨树原生质体中FT2的表达(图S3 C-E)。此外，瞬时过表达PtoHY5b的原生质体中，未能观察到FT2的表达水平变化，而在瞬时过表达PtoHY5a后可以检测到内源FT2的表达水平显著增加(图S3 F)。结果均证实了HY5a和HY5b存在时空上的表达差异。图S3. PtoHY5a和PtoHY5b的表达模式及其与FT2启动子结合的功能分析。(A) PtoHY5a和PtoHY5b在不同组织中的相对表达量。(B)不同季节野生型植株顶芽和叶片中PtoHY5a和PtoHY5b的相对表达量。(C-E)双荧光素酶报告实验。(F)空载、过表达PtoHY5a和PtoHY5b的叶片原生质体中PtoHY5a、PtoHY5b和PtoFT2的表达水平。基于PtoHY5a对FT2发生了直接激活，作者进行了GUS染色和亚细胞定位分析。发现PtoHY5a主要在根的表皮、茎的所有组织以及叶柄的表皮和维管组织中表达(图S4 A-G)。亚细胞定位的结果显示其主要定位于核内(图S4 H)。图S4. PtoHY5a的GUS植株染色和亚细胞定位分析。(A-G) GUS染色分析。(H)亚细胞定位。3. PtoHY5a影响拟南芥hy5突变体的生长并挽救其早花表型作者对PtoHY5a的转基因杨树(PtoHY5a-OE)和敲除突变体(PtoHY5a-KO)分析发现，OE系在正常条件下表现出生长抑制，包括更短的植物高度、更小的叶片尺寸和更少的生物量(图S7 A-H)。异源表达PtoHY5a的转基因拟南芥也呈现相似的生长抑制表型(图S8 A-C)。相比之下，KO系表现出更高的株高、更大的叶片和更多的生物量(S7 A-H)。
此外，拟南芥hy5突变体中进行PtoHY5a的异源表达可挽救早花表型，同时，相对于Col-0和hy5，拟南芥PtoHY5a-OE转基因株系显示出延迟开花表型(图S8 H-I)。这些结果表明，PtoHY5a的过表达会导致营养生长延长，从而延迟开花。
图S7. PtoHY5a-OE和PtoHY5a-KO转基因杨树的表型。图S8. PtoHY5a影响杨树营养发育并挽救拟南芥hy5突变体的早花表型。(A-C)拟南芥Col-0和异源表达PtoHY5a/Col-0的表型。(D)光照/黑暗条件下拟南芥Col-0、hy5突变体、PtoHY5a-OE和PtoHY5a/hy5-1的表型。(E-F) RT-PCR。(G)下胚轴长度测量。(H-I) hy5突变体中PtoHY5a的异源表达挽救了早花表型。4. PtoHY5a抑制SD诱导的生长停止和寒冷诱导的芽萌发由于PtoFT2受到PtoHY5a的调节，作者对PtoHY5a是否参与树木的季节性生长展开了研究。定量水平检测分析表明，PtoHY5a在长日照LD中和短日照SD中都呈现出了变化的节律性(图2 A-B)，SD环境会导致PtoHY5a转录水平的下调(图2 C)。同样免疫印迹实验表明，HY5a在白天积累，在夜间减少(图2 D-E)。这表明PtoHY5a可能参与了受光周期调节的季节性生长过程。
为进一步进行研究，作者观察了转基因杨树从长日照16h转移到短日照8h时的表型变化。短光照下KO植株较WT更早发芽，而OE植株则相反(图2 F-H)。结果表明，PtoHY5a抑制SD诱导的生长停止和芽形成。
图2. PtoHY5a表达变化对杨树萌发的影响。(A-C) PtoHY5a在LD和SD环境中的表达分析。(D-E) PtoHY5a的蛋白积累水平。(F-H) WT、PtoHY5a-OE和PtoHY5a-KO在SD环境下的顶芽萌发表型。此外，作者还模拟暖春温度环境，将WT、OE植株和KO植株在SD 8小时光照处理下发芽10周，随后冷处理3个月，最后将这些植物在25°C下恢复到LD 16小时光照处理培养2周，并进行表型评估。结果显示，KO植株在回归温暖的LD光周期后较WT更早萌发，而OE植株则相反。相比到达芽萌发的同一阶段，KO植株用时最短，而OE植株则最长(图3 A-D)。户外种植的PtoHY5a-KO同样表现出了较早发芽的表型，OE植株发芽滞后，这与室内实验结果一致。综上，PtoHY5a抑制寒冷诱导的芽萌发。图3. PtoHY5a介导发芽的光周期控制。(A-D) WT、PtoHY5a-OE和PtoHY5a-KO在寒冷SD环境转移至温暖LD环境的芽萌发表型。(E)田间2年生植株的芽萌发表型。5. PtoHY5a通过正向调节杨树中FT2的表达影响出芽表型为进一步探究PtoHY5a的分子调控机制，作者首先检查了转基因植株和芽萌发相关的FT2、LAP1和AIL1的表达水平。发现在LD或SD环境下，PtoFT2的表达水平在PtoHY5a-OE系中增加，而在PtoHY5a-KO系中下降(图4 A-B)。此外，PtoFT2在WT中也表现出昼夜表达节律，但在LD环境下这种节律峰值出现的时间产生了时差。同时SD环境下，WT和转基因植物PtoFT2的表达没有表现出明显的昼夜表达和振荡节律(图4 C-D)，这进一步表明其受PtoHY5a控制。ChIP-qPCR的结果显示PtoHY5a通过ACE-box与PtoFT2的启动子区域结合(图4 E-F)。作者随后进行了PtoFT2-OE的转基因工作，并发现PtoFT2过表达足以抑制SD诱导的过早生长停止和因PtoHY5a功能丧失而导致的出芽缺陷(图4 G-I)。综上，这些结果支持了HY5a通过直接正向调节FT2的表达来控制SD诱导的杨树休眠的观点。
图4. PtoFT2的过表达会抑制SD下PtoHY5a-KO的芽萌发。(A) WT、PtoHY5a-OE和PtoHY5a-KO中PtoFT2的定量水平。(C-D) PtoFT2在LD/SD环境下，不同植株中的定量水平。(E-F) ChIP-qPCR分析。(G-I) WT、PtoFT2-OE、PtoHY5a-KO/PtoFT2-OE、PtoHY5a-OE和PtoHY5a-KO在SD环境中的芽萌发表型。6. PtoHY5a负调控杨树PtoLHY2的表达已有的研究证实，拟南芥中LHY是HY5的下游靶基因，但在拟南芥hy5突变体中未检测到LHY转录水平的变化。在杨树中LHY的下调可导致SD诱导芽萌发的延缓。因此作者检测了PtoHY5a-OE和PtoHY5a-KO中LHY2的表达水平，发现相较于WT，PtoLHY2在PtoHY5a-OE中下调，而在PtoHY5a-KO中上调(图5 A)，表明杨树中LHY2可以被PtoHY5a负调控。此外，杨树中的PtoLHY2表现出清晰的昼夜节律(图5 B-C)。
为进一步证实PtoHY5a对PtoLHY2的调节，作者使用双荧光素酶报告实验测定证实了PtoHY5a可以结合PtoLHY2启动子区域，且依赖于其ACE基序(图5 D-G)。此外，作者通过序列分析发现PtoLHY2启动子中存在四个ACE-box基序。EMSA和ChIP-qPCR实验表明PtoLHY2启动子上的ACE-box基序可直接与PtoHY5a结合(图5 H-K)。
综上，PtoHY5a可以通过与PtoLHY2启动子上的ACE-box基序结合来抑制PtoLHY2的表达，PtoHY5a通过直接调节PtoLHY2来间接调节FT2。
图5. PtoHY5a影响生物钟基因PtoLHY2的表达。(A) WT、PtoHY5a-OE和PtoHY5a-KO中PtoLHY2的表达分析。(B-C)在LD和SD下不同植株PtoLHY2的昼夜表达分析。(D-G)双荧光素酶报告实验。(H-K) EMSA和ChIP-qPCR。7. PtoHY5a作为PtoPHYB2下游的转录因子，调节杨树的季节性生长已知PHYB2在光周期感知和杨树SD诱导的休眠中发挥着关键作用。作者检测了PtoPHYB2的表达模式，发现其表现出昼夜表达模式(图6 A-B)。在SD下，PtoPHYB2没有表现出明显的昼夜表达模式，进一步表明光周期对PtoPHYB2的调节作用(图6 C)。基于先前研究，作者通过创制PHYB的转基因株系来探究PtoPHYB2和PtoHY5a之间的调控关系。作者首先检查了PtoHY5a在PHYB转基因植物中的水平，发现PtoHY5a在PtoPHYB2-OE中上调，而在PtoPHYB1/2-RNAi系中下调(图6 D)。转基因植株芽萌发实验证实了PtoHY5a-KO可以消除SD下PtoPHYB2-OE造成的生长停止和芽萌发的延迟(图6 E-G)。因此，PtoHY5a充当PtoPHYB2下游的转录因子，调节季节性生长。
图6. PtoPHYB2的过表达不影响PtoHY5a-KO植物在SD期间的芽形成。(A-B)在LD和SD下杨树PtoPHYB2的昼夜表达分析。(D) PtoHY5a在WT、PtoPHYB2-OE和PtoPHYB1/2-RNAi中的表达。(E) WT、PtoHY5a-KO、PtoHY5a-KO/PtoPHYB2-OE、PtoPHYB2-OE和PtoPHYB1/2-RNAi处理后的芽萌发表型。8. PtoHY5a通过调节顶芽中GA生物合成和分解代谢酶相关基因的表达来降低GA水平有研究表明，杨树冬季休眠解除和春季芽萌发与GA水平有关。因此作者分析了主要在茎尖表达的GA失活和生物合成基因的转录本丰度。发现GA生物合成基因在PtoHY5a-OE植物的顶芽中急剧减少，而其在PtoHY5a-KO植物中表达显著上调(图7 A-B)。
此外，作者还检测了低温处理和LD温暖环境处理后，WT和转基因植物顶芽中GA的含量。结果显示活性GA(GA1和GA4)、GA前体(GA9和GA20)和代谢物(GA8和GA34)相关基因的水平在PtoHY5a-KO顶芽中显著增加，而在PtoHY5a-OE顶芽中显著降低(图7 C-E)。这些结果表明PtoHY5a通过调节GA生物合成和分解代谢途径参与控制芽的萌发。图7. PtoHY5a参与杨树发芽过程中的GA代谢。(A-E) GA合成代谢相关基因的转录水平分析。![]()
综上所述，本研究揭示了PtoPHYB2-PtoHY5a-PtoFT2/GA调控模型，阐述了杨树响应光温变化，通过FT2途径、生物钟途径和GA途径调节树木季节性休眠和萌发，丰富了人们对树木气候适应调控的新认知。![]()
期刊：The Plant Cell
------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
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