2023年12月，西南大学罗克明教授团队在著名期刊New Phytologist上发表一篇题为SPL16 and SPL23 mediate photoperiodic control of seasonal growth in Populus trees的文章。作者创制SPL16和SPL23的超表达和突变体植株，统计腋芽分支和花芽分化表型差异，研究基因调控关系，发现短日照抑制了miR156的表达，同时在杨树叶子和茎尖中上调了miR156靶向的SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 16 (SPL16)和SPL23的表达。过表达MIR156a/c或SPL16/23的突变体导致短日照下生长停止和芽形成的减弱，而SPL16和SPL23的过表达则导致早期生长停止。揭示了phyB-PIF8模块介导的光周期感知与短日照诱导的生长停滞中与miR156-SPL16/23-FT2/BRC1调控级联之间的联系，为杨树季节性生长调控研究提供了新的思路。
=== 研究背景 ===
寒带和温带地区的多年生树木在短光周期下会经历生长停止和花芽分化，这受到光敏色素B ( phyB )光受体和光敏色素相互作用因子8 ( PIF8 )蛋白的调控。光敏色素( phyA和phyB)是高等植物中监测日长变化的光受体。杨树基因组包含1个PHYA和2个旁系同源PHYB基因。此外，一些生物钟基因还参与生长停止、花芽分化和花芽分化的季节性调控。最近在杨树中的研究表明phyB-PIF8模块在光周期感知和控制季节性休眠的发生和解除中起关键作用，但对感知短日照（short days，SD）后信号向季节性生长下游介质的转导仍不完全清楚。
SQUAMOSAPROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL)是多种植物开花和分枝的特征性调控因子在拟南芥中，已经证明PIF蛋白直接降低多个微RNA156(MIR156)基因的表达，进而提高SPL家族基因的表达来调节避荫反应。
本文作者通过转基因技术、CRISPR/Cas9基因编辑、芽变评分法、qRT-PCR、亚细胞定位、Y1H、LUC、EMSA等研究方法，发现SD条件下SPL16和SPL23基因在杨树成熟叶片和茎尖中的表达上调，正调控因子PIF8.1和PIF8.2可以直接结合并抑制MIR156a和MIR156c的表达，揭示了PIF8-miR156SPL16/23-FT2/BRC1级联调控在介导树木季节性生长的光周期控制中的作用。
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=== 研究结果 ===
1. 短光周期抑制miR156的表达，上调SPL16和SPL23的表达
为了研究miR156及其下游SPL基因是否参与杨树短光周期反应并介导季节性生长，将毛白杨WT植株在LD (16h : 8h , L : D)下生长7 wk后转移至SD (10 h : 14 h , L : D)继续培养3 wk。通过qRT-PCR检测miR156和下游SPL基因的表达变化。作者发现LD-to-SD转移显著降低了叶片中成熟miR156的表达水平(图1a )。在18个miR156靶向的SPL基因中，有11个基因在SD条件下表达上调，包括SPL16、SPL23和SPL24(图1b )。在类似SD反应的杂交杨PHYB RNA干扰( PHYB-RNAi )植株中，敲低PHYB导致SPL16/23在茎尖中上调而SPL20/25下调(图1c )。作者比较了LD和SD处理的WT植株茎尖中miR156和SPL16/23的表达水平，发现在杨树茎尖(图1d , e)中，SD同样抑制了miR156的表达，而促进了SPL16和SPL23的表达。此外，SPL16/23-GFP融合蛋白在烟草叶片中的瞬时表达显示它们定位于细胞核中(图1f )。阐明了miR156及其下游SPL16和SPL23基因在控制杨树SD介导的生长停止和花芽分化中的作用。
图1.短日照抑制miR156表达，同时促进杨树叶子和茎尖中miR156靶向的SPL16和SPL23的表达。(a)将七周大的杨树野生型（WT）植物在长日照（LD，16小时光照：8小时黑暗，L:D）下生长约7周，然后转移到短日照（SD，10小时光照：14小时黑暗，L:D）下3周。qRT-PCR检测成熟miR156的表达水平。(b)qRT-PCR检测LD和SD条件下生长的WT植物叶子中miR156靶向SPL基因的表达变化。(c)热图显示WT和PHYB-RNAi植物在SD条件下收集的茎尖中SPL16/23/20/25基因的表达。(d)qRT-PCR检测LD生长和SD处理的WT植物茎尖中成熟miR156的表达水平。(e) qRT-PCR分析LD生长和SD处理的WT植物茎尖中SPL16和SPL23的表达。(f)在烟草叶片中瞬时表达SPL16/23-GFP融合蛋白显示它们定位在细胞核中。
2. 过表达MIR156a和MIR156c导致杨树生长停滞和花芽分化减弱
为了研究miR156在调控花芽分化中的作用，作者构建了过表达MIR156a和MIR156c的转基因杨树植株(图2a )。研究表明，MIR156a和MIR156c的过表达均导致毛白杨腋芽分支的增加(图2b )。从LD条件转移到SD条件后，与WT植株(图2c , d)相比，MIR156a-OE和MIR156c-OE株系均表现出明显的生长停止延迟和花芽分化延迟。表明miR156在拮抗SD诱导的生长停止中的作用具有剂量依赖性。qRT-PCR分析显示，在LD和SD条件下，MIR156a-OE和MIR156c-OE植株的第10片成熟叶中FT2表达较高，SPL16和SPL23基因在MIR156a-OE和MIR156c-OE的叶片中表达下调(图2e )。表明SPL16和SPL23受miR156转录后调控，SPL16/23直接参与光周期调控杨树新梢生长。
图2. 杨树中MIR156a和MIR156c的过表达导致生长停止和芽形成减弱。(a)杨树MIR156a和MIR156c过表达株系。(b)在WT、MIR156a-OE和MIR156c-OE株系间比较腋生分枝的数量。(c)WT、MIR156a-OE和MIR156c-OE植物在短日照（SD，10小时光照：14小时黑暗，L:D）处理3周后的茎尖表型。(d)在转移到SD条件下后，对WT、MIR156a-OE和MIR156c-OE植物的芽形成评分。(e) qRT-PCR分析FT2和miR156靶向的SPL16和SPL23基因的表达。
为了阐明SPL16/23在调控杨树季节性生长中的功能，作者构建了杨树spl16单突变体和spl16/23双突变体。与MIR156过表达植株腋枝增多的表型一致，spl16单突变体和spl16/23双突变体表现出比WT植株更多的腋枝(图3a、c )。spl16单突变体表现出对SD条件的敏感性降低，表现出比WT植株更晚的生长停止，而spl16/23双突变体表现出更晚的生长停止(图3b , d)。作者利用qRT-PCR检测了LD和3 wk处理的spl16单突变体和spl16/23双突变体及野生型植株叶片和茎尖中FT2和BRC1s的表达变化。FT2的表达水平在LD下spl16/23突变体的成熟叶片中显著高于WT，并且在SD转变3 wk后仍保持较高的表达水平(图3e )。茎尖中BRC1.1和BRC1.2的转录水平在spl16单突变体中下调，而在spl16/23双突变体中下调幅度更大，且在SPL16/23敲除的SD诱导下下调幅度较小(图3f )。结果表明，SPL16和SPL23在SD诱导的杨树生长停止和花芽分化中起正调控作用。
图3. 杨树spl16单突变体和spl16/23双突变体表现出延迟的生长停止和芽形成。(a)WT、spl16单突变体和spl16/23双突变体的腋生分枝表型。(b)WT、spl16和spl16/23植物在短日照处理3周后的茎尖。(c)在WT、spl16和spl16/23突变体株系间比较腋生分枝的数量。(d)在转移到SD条件下后，对WT、spl16和spl16/23突变体的芽形成评分。(e)qRT-PCR分析在LD生长和3周SD处理的spl16单突变体和spl16/23双突变体以及WT植物的成熟叶子中FT2的表达。(f)在(e)中 BRC1.1和BRC1.2的表达量。
为了阐明SPL16和SPL23在SD诱导的杨树生长停滞和花芽分化调控中的功能，作者构建了非靶向过表达SPL16Δ和SPL23Δ(缺乏30UTR)的转基因毛白杨植株。与WT植株相比，SPL16Δ-OE植株的腋枝数目减少，而SPL23Δ的过表达对腋枝(图4a , c)的生长表型影响不大。SPL16Δ-OE和SPL23Δ-OE株系对SD条件表现出超敏反应，与WT植株相比，表现出更早的生长停止现象(图4b , d)。qRT-PCR结果表明，在LD条件下，与WT植株相比，FT2在SPL16Δ-OE和SPL23Δ-OE的叶片中表达下调。SD转移进一步降低了SPL16Δ和SPL23Δ过表达株系叶片中FT2的表达(图4e )。BRC1.1和BRC1.2的表达在SPL16Δ-OE和SPL23Δ-OE植株的茎尖中上调(图4f )。结果表明，SPL16和SPL23是光敏色素信号调控芽停止生长下游的功能节点，可能通过同时调控FT2和BRC1.1/1.2的表达发挥作用。
图4. 转基因杨树过表达SPL16和SPL23表现早期生长停止表型。(a)比较WT、SPL16Δ-OE和SPL23Δ-OE株系的腋生分枝表型。(b)WT、SPL16Δ-OE和SPL23Δ-OE植物在短日照处理2周后的茎尖。(c)在WT、SPL16Δ-OE和SPL23Δ-OE株系间比较腋生分枝的数量。(d)在转移到SD条件下后，对WT、SPL16Δ-OE和SPL23Δ-OE植物的芽形成评分。(e)通过qRT-PCR分析在LD生长和3周SD处理的WT、SPL16Δ-OE和SPL23Δ-OE中FT2的表达。(f)在(e)中BRC1.1和BRC1.2的表达。
5. SPL16和SPL23直接抑制FT2的表达，同时激活BRC1s的表达
为了研究SPL16/23是否直接调控杨树FT2和BRC1的表达，作者进行了生物信息学分析，鉴定FT2、BRC1.1和BRC1.2启动子中假定的SPL结合位点( GTAC ) (图5a )。Y1H实验表明SPL16和SPL23能够与BRC1.2的启动子结合(图5b )。突变BRC1.2启动子中的GTAC序列(代之以CCGG)证实了这种结合的特异性(图5b )。EMSA结果表明，SPL16可以与FT2，BRC1.1和BRC1.2的启动子探针结合(图5c )。LUC实验显示SPL16和SPL23蛋白抑制FT2的启动子活性，(图5d )。相反，作者观察到SPL16和SPL23显著激活BRC1.1和BRC1.2的启动子活性(图5e , f)。BRC1s启动子序列中SPL结合位点的突变阻止了SPL16/23对BRC1基因(图5e , f)的转录激活作用。以上结果表明，SPL16和SPL23在抑制FT2的转录同时促进BRC1.1和BRC1.2的转录中发挥双重作用。
图5. SPL16和SPL23直接抑制FT2表达，同时激活BRC1.1和BRC1.2表达。(a)在FT2、BRC1.1和BRC1.2的启动子中（大约在ATG上游3 kb处）分析GTAC顺式元件。(b) Y1H显示SPL16和SPL23与BRC1.2启动子有很强的结合。(c) EMSA显示SPL16能够与FT2、BRC1.1和BRC1.2的启动子探针结合。(d-f) LUC显示SPL16和SPL23抑制FT2启动子活性，同时激活BRC1.1和BRC1.2启动子活性。
6.杨树miR156-SPL16/23模块由PIF8.1和PIF8.2控制
先前的研究表明，PIF蛋白可以直接结合并抑制多个MIR156基因的表达，从而释放下游SPL基因来调节避荫反应。为了研究miR156-SPL16/23模块是否作用于phy B-PIF8模块的下游，以控制SD感知时芽的生长停止，作者构建了杨树PIF8.2的CRISPR突变体。结果表明，与野生型植株(图6a , b)相比，pif8.2单突变体表现出显著延迟的花芽分化，成熟miR156的表达水平在pif8.2突变体的茎尖中显著上调(图6c )。MIR156a、MIR156b、MIR156c/e和MIR156h基因的表达水平在pif8.2突变体中升高，并且它们的表达水平在pif8.2突变体(图6c)中被SD抑制。相反，SPL16和SPL23在pif8.2突变体茎尖中的表达水平显著下调(图6d )。在LD和SD条件下，与WT相比，pif8.2茎尖中BRC1.1和BRC1.2的表达水平下调，而FT2在pif8.2叶片中的表达水平上调。以上结果表明，PIF8是杨树中miR156-SPL途径的关键调节因子，miR156可能在光周期感知和下游SPL16 / 23调节的途径之间起联系作用，以调节SD条件下芽的生长停止。
图6. 杨树中miR156和下游靶标SPL16/23的表达受PIF8调控。(a)pif8.2突变体从长日照转移到短日照大约3周后，表现出延迟的芽生长停止。(b) WT和pif8.2突变体转移到短日照后的芽形成评分。(c)在WT和pif8.2突变体茎尖中，成熟miR156和MIR156基因的表达水平。(d)在(c)中SPL16和SPL23及其下游靶标BRC1.1和BRC1.2的表达水平。(e)在WT和pif8.2突变体的第10片叶子中，FT2的表达水平。
为了研究PIF8.1和PIF8.2是否直接抑制MIR156s的表达，作者分析了PIF结合位点，即G-box和PBE-box。Y1H实验表明PIF8.1和PIF8.2都可以与MIR156a和MIR156c的启动子片段结合，而MIR156a/c启动子中的G-box/ PBE-box的突变阻止了(图7a , b)的结合。为了验证PIF8s是否可以直接调控MIR156a和MIR156c的转录，共表达PIF8.1或PIF8.2蛋白强烈抑制MIR156a和MIR156c内源启动子驱动的LUC报告基因活性，但这种抑制作用被这些PIF结合基序的突变所取消(图7c )。双荧光素酶实验进一步证实了PIF8.1/8.2对MIR156a和MIR156c启动子活性的抑制作用(图7d )。以上表明PIF8.1和PIF8.2可以直接抑制MIR156的表达，进而去抑制下游的SPL16 / 23基因，介导SD诱导的生长停止。
图7.PIF8.1和PIF8.2直接结合并抑制MIR156a和MIR156c的表达。(a)在MIR156a和MIR156c的启动子中PIF结合位点。(b)Y1H。(c)在烟草叶片中的瞬时表达实验显示PIF8.1和PIF8.2抑制MIR156a和MIR156c启动子驱动的LUC报告基因活性。(d)双荧光素酶实验证实PIF8.1和PIF8.2抑制MIR156a和MIR156c的表达。
=== 总结 ===
在杨树中，miR156-SPL16/23模块已经进化出重组的信号通路，通过协调抑制FT2和激活BRC1来调节季节性生长。此外，作者发现PIF8s在LD-to-SD转变过程中直接抑制miR156的表达，从而在多年生树木中建立了SD介导的生长停止和花芽分化的phyB-PIF8-miR156-SPL16/23-FT2/BRC1调控级联。此研究结果为未来旨在提高森林生态系统生产力和可持续性的研究提供了基础。
模式图 LD-to-SD过程中phyB-PIF8-miR156-SPL16/23-FT2/BRC1级联调控
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