PP | 超氧阴离子通过促进形成层细胞活动诱导应拉木形成

2024年12月，浙江农林大学卢孟柱教授团队在植物科学领域期刊Plant Physiology上发表题为“Superoxide anions induce tension wood formation by promoting cambium cell activity”的研究论文。该研究发现了超氧阴离子通过促进形成层细胞活动诱导应拉木形成，阐明了维管形成层细胞增殖和分化的调控机制。

=== 研究背景 ===

维管形成层作为木材形成的发源地，其细胞增殖速度、分化形成的各种类型细胞的形状、大小、比量等特征决定木材产量、结构和性质。因此，形成层细胞活动的调控对木材的结构及性质至关重要。已有研究表明，许多调控因子参与木材形成过程中形成层细胞的增殖或分化。应拉木（TW）是研究木材发育的经典模型系统，其特征是形成层细胞增殖速度快，木质部导管数量减少。已有研究揭示了TW形成层区域激素及其下游转录调控网络的动态变化。然而，对激素（如生长素）上游参与形成层细胞活动的调节因子关注较少。

=== 研究结果 ===

1. 重力诱导处理促使应拉木维管形成层O₂^.-水平升高

作者将土培一个月的84K杨幼苗植株水平放置7天，取弯曲茎段中部节间切片，并用TBO对维管组织染色，用显微镜观察维管组织结构。结果显示弯曲茎段上侧呈现典型TW的结构特征，相较于茎段下侧的对应木（OW）或正常木材相比，TW维管形成层细胞层数增加，导管数量和面积比减少（图1A，B）。以此推测ROS可能参与重力诱导下维管形成层的活动。

通过NBT和DAB染色分别检测两种主要活性氧O₂^.-和H₂O₂的水平。在没有重力刺激的情况下，与OW和对照相比，TW的维管形成层产生了更高水平的O₂^.-，且在形成层中广泛分布。H₂O₂信号略有增加，并且集中在靠近发育木质部的形成层（图1C，D）。

图1 84K杨重力诱导处理

（A）对照、重力诱导处理7 d后应拉木和对应木维管组织形态结构观察。（B）对照、重力诱导处理后应拉木和对应木形成层细胞层数、次生木质部单位面积导管数量以及导管面积比统计。（C）对照、重力诱导处理后应拉木和对应木NBT组织化学染色结果。（D）对照、重力诱导处理应拉木和对应木DAB组织化学染色结果。

用不同浓度的O₂^.-激活剂甲基紫素（MV）处理14天后，采集处理后的节间段进行维管结构和ROS水平分析。MV处理的杨树茎段维管组织ROS水平与重力诱导处理相似，O₂^.-和H₂O₂水平均随MV浓度的增加而增加，但84K植株在10 mM MV处理下出现死亡症状(图2.1a，b)。与未处理对照相比，经2 mM MV处理的茎中形成层细胞层数增加了34%，且导管的数量和面积比分别减少了约28%和56%（图2.1c，d）。

图2.1 84K杨不同浓度MV处理

（a）对照与不同浓度MV处理14 d后茎维管组织NBT组织化学染色结果。（b）对照与不同浓度MV处理14 d后茎维管组织DAB组织化学染色结果。（c）对照与重力诱导处理茎维管组织形态结构观察。（d）对照与不同浓度MV处理14 d后茎维管形成层细胞层数、次生木质部单位面积导管数量以及导管面积比统计。

进一步通过间苯三酚和Calcoflu White染色分别统计了重力诱导7天和2 mM MV处理21天的节间木质素和纤维素含量（图2.2a-c）。结果显示与OW相比，TW表现为木质素含量减少，而纤维素含量增加；与对照相比，MV处理的茎中新形成的木质部木质素含量降低，而纤维素含量增加。进一步的细胞壁组分定量分析表明，TW处理的纤维素含量比OW处理的高29%，而木质素含量则降低了17%；与对照相比，经MV处理的茎段表现出类似的细胞壁成分变化，纤维素含量增加23%，木质素含量减少7%（图2.2d）。这些结果表明，MV处理下形成层细胞增殖和分化模式与TW的相似。

图2.2 重力诱导处理以及MV处理84K杨细胞壁组分

（a）重力诱导处理后应拉木和对应木以及对照与MV处理茎维管组织形态结构观察。（b）重力诱导处理后应拉木和对应木以及对照与MV处理后茎段维管组织间苯三酚组织化学染色结果。（c）重力诱导处理后应拉木和对应木以及对照与MV处理茎段维管组织Calcoflu White染液组织化学染色结果。（d）重力诱导处理后应拉木和对应木以及对照与MV处理茎段维管组织细胞细胞壁组分定量分析结果。

为了研究O₂^·−水平降低是否会影响TW的形成，构建过表达超氧化物歧化酶基因（SODs）的转基因植株。分析了84K杨11种SODs在植株茎中的表达模式（图3.1b），结果显示Cu/Zn-SOD型PagSOD2基因在树皮、发育木质部和成熟木质部中的转录水平都高于其他SODs（图3.1b）。进一步构建形成层和发育木质部特异表达的PagEXP1启动子驱动的PagSOD2过表达载体，并获取proPagEXP1::PagSOD2过表达转基因杨树。

图3.1 杨树SODs基因筛选

（a）杨树SODs基因系统发育关系分析。（b）杨树SODs基因在树皮、发育木质部和成熟木质部中的表达水平分析。

对proPagEXP1::PagSOD2过表达转基因杨树以及野生型植株施加10天的重力刺激后，通过NBT染色发现，与野生型相比，转基因植株显示形成层O₂^·−水平降低（图3.2a），且表现出延迟的重力响应（图3.2b）；通过维管组织形态结构观察，发现转基因植株重力刺激后木质部宽度（XFAG）/重力刺激前木质部宽度（XFBG）比值小于对照植株（图3.2c），这些结果表明在低水平O₂^·−下转基因植株的重力响应受到抑制。

图3.2 proPagEXP1::PagSOD2转基因植株重力诱导处理

（a）对照与转基因植株重力处理10天后应拉木和对应木NBT组织化学染色结果。（b）对照与转基因植株重力处理10天后茎弯曲情况。（c）对照与转基因植株重力处理10天后茎维管组织形态结构观察。（d）转基因植株重力处理10天后木质部宽度（XFAG）和重力刺激前木质部宽度（XFBG）比值统计结果。

为了解IAA和O₂^·−在介导形成层细胞活动方面是否存在关联，在0、3、6、12、24和48 h时间点检测重力弯曲响应过程中形成层O₂^·−和IAA水平。从12 h开始，TW的O₂^·−水平相较于OW有所升高，在24和48 h时间点差异变得明显（图4.1a）。在24 h时间点，TW中检测到明显的IAA信号增加，并在48 h时间点差异变得明显（图4.1b）。

图4.1 重力诱导下84K杨生长素和超氧阴离子信号分析

（a）重力处理0、3、6、12、24和48 h时间点应拉木和对应木NBT组织化学染色结果。（b）重力处理0、3、6、12、24和48 h时间点应拉木和对应木IAA水平检测结果。

对84K杨茎进行IAA处理，与对照相比，新形成的次生木质部的导管数量和导管面积比都减少了（图4.2a，b），这表明IAA和O₂^·−可能在相同的途径上起作用，IAA在O₂^·−的下游作用，诱导TW的形成。为了验证IAA与O₂^·−之间的关系，检测MV处理期间84K杨在0、24、48和72 h时间点形成层区的IAA动态变化（图4.3a）。在24 h的时间点，与对照相比，MV处理茎中IAA含量随着O₂^·−的积累而相应增加，并且随着处理时间的延长，这种现象更加明显（图4.3b）。这些结果表明，O₂^·−通过诱导IAA积累参与了TW形成调控。

图4.2 84K杨IAA处理

（a）对照与IAA处理后84K杨茎维管组织形态结构观察。（b）对照与IAA处理后84K杨茎维管组织次生木质部单位面积导管数量以及导管面积比统计。

图4.3 MV处理84K杨生长素信号检测

（a）对照与在0、24、48和72 h时间点形成层NBT组织化学染色结果（b）对照与在0、24、48和72 h时间点形成层IAA动态变化。

为了验证TW中形成层细胞层数的增加是由O₂^·−激活的形成层细胞增殖引起的，通过使用F-ara-EdU作为DNA复制的代谢标记，分析植物形成层细胞在重力刺激和2 mM MV处理下的细胞增殖率。用F-ara-EdU处理植株7天，使DNA在s期被F-ara-EdU完全标记。然后擦除并进行MV处理或重力诱导处理，检测标记丢失的速度，并将其作为细胞增殖速度的指标。在重力刺激4天后，TW形成层含F-ara-EdU的细胞比OW侧少（约32%）且信号强度低（图5.1a，b）。在4天MV处理后，形成层含F-ara-EdU信号的细胞比对照组少（约31%）且强度低（图5.1a，b）。这些结果表明，超氧阴离子促进了形成层细胞的增殖。

图5.1重力诱导处理和MV处理下形成层细胞增殖速率分析

（a）应拉木、对应木、2 mM MV处理茎段和对照茎段维管形成层F-ara-EdU标记丢失速度以及信号强度检测。（b）应拉木、对应木、2 mM MV处理茎段和对照茎段维管形成层F-ara-EdU标记丢失速度以及信号强度结果统计。

此外，细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是木质部细胞分化过程中至关重要的生物过程，通过检测组蛋白变体H2AX的磷酸化来分析PCD状态。组蛋白变体H2AX的磷酸化形成γ-H2AX，其中γ-H2AX是导致PCD的DNA双链断裂的高度敏感标记（Kinner et al., 2008）。免疫荧光检测显示，在OW或H₂O处理（MV处理的对照）的形成层中，几乎没有观察到γ-H2AX聚集，而在TW形成和MV处理的形成层中，分别约有17%和28%的细胞检测到γ-H2AX聚集（图5.2a，b），这表明重力刺激和MV处理均可诱导形成层细胞PCD。这些结果表明，在O₂^·−激活剂处理的杨树茎段和TW之间存在相似的形成层细胞行为模式，即细胞增殖加速和PCD程度增加。

图5.2 重力诱导处理和MV处理下形成层细胞细胞程序化死亡程度检测

（a）应拉木、对应木、2 mM MV处理茎段和对照茎段维管形成层PCD荧光信号检测。（b）应拉木、对应木、2 mM MV处理茎段和对照茎段维管形成层PCD荧光信号检测结果统计。

=== 总结 ===

本研究阐明了O₂^·−通过促进形成层细胞活动诱导应拉木形成机制。本研究首次聚焦O₂^·−调控维管形成层细胞活动的研究，并引入TW系统开展维管形成层细胞活动调控机制研究，成果为维管形成层活动调控机制的研究提供新视角，为分子设计培育高产优质林木新品种提供育种新思路。

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