2023年12月，中国科学院分子植物科学卓越创新中心ChanHong Kim研究团队在The Plant Cell上发表了一篇题为The m6A reader ECT1 drives mRNA sequestration
to dampen salicylic acid–dependent stress responses in Arabidopsis的研究论文。作者发现ECT1是响应SA的m6A Reader，并且PrLD在ECT1凝聚中起关键作用，ECT1通过其保守的芳香笼隔离SA诱导的m6A修饰倾向的mRNA，以促进它们在胞质凝聚物中的衰变，从而抑制SA介导的胁迫反应。作者明确地将ECT1相关的胞质凝聚物与SA依赖的植物胁迫响应联系起来，推进了目前对m6A Reader和SA信号网络的理解。
=== 研究背景 ===
甲基化修饰是RNA的主要修饰之一，在真核生物mRNA中，N6-甲基腺苷(m6A)是最丰富的甲基化修饰形式，参与mRNA稳定性、剪接、翻译效率、核质输出等各种mRNA代谢过程，并最终调控植物生长发育及胁迫响应。m6A是一种动态可逆的转录后修饰，其与m6A甲基转移酶(Writer)、去甲基化酶(Eraser)和m6A结合蛋白(Reader)协同作用。有研究表明ECT2与m6A标记的mRNA（m6A-mRNA）亚组结合，参与毛状体形态发生，增加其在细胞溶质中的稳定性，并可能影响细胞核中的3′UTR过程。也有报道ECT2与ECT3和ECT4在调节叶发育和植物或植物器官发生方面具有冗余功能。ECT2还通过调节蛋白酶体调节剂和几种20S蛋白酶体亚基的mRNA水平来调节26S蛋白酶体活性，从而影响植物发育的多个方面。在拟南芥中，m6A
Reader可以识别YTH结构域，然而，大多数m6A
Reader在植物中的详细机制仍然不清楚，对于它们是否参与这一调控过程仍有待深入研究。本次研究拟南芥ECT1作为一个m6A Reader，通过诱导植物激素水杨酸（SA）去调节植物胁迫反应。其m6A结合能力允许将具有SA诱导的m6A修饰倾向的mRNA隔离到胞质凝聚物中以促进它们的衰变，从而减弱SA诱导的胁迫反应对植物发育的负面影响。# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1. 多种YTH家族蛋白与LESION SIMULATING DIEASE1相互作用
LESION SIMULATING DIEASE1是一种核细胞质代谢蛋白，其缺失导致植物中SA依赖性非受控细胞死亡。有研究表明LSD1与GARP家族的GOLDEN 2-LIKE（GLK）转录因子相互作用后会抑制光合作用相关核基因（PhANGs）的表达，从而降低拟南芥中响应SA的光合活性氧特异性水平。此外，通过免疫共沉淀（Co-IP）和质谱分析相结合发现LSD1与几种YTH家族蛋白相互作用。以上研究使作者假设m6A
Reader可能参与SA介导的植物胁迫反应。随后作者使用BiFC系统在烟草中验证了LSD1和YTH家族蛋白之间的相互作用。除了ECT4和ECT12的YFPC融合物之外，其他YTH家族蛋白都能与LSD1在细胞质中观察到荧光互补（图1A）。有研究报道称加剧的SA信号传导对植物生长产生负面影响，因此，作者研究了每个YTH家族蛋白的敲除突变体中的SA响应性。在正常生长条件下，所有突变体的表型与野生型（WT）植物是不可区分的。然而，与其他突变体相比，在SA处理后，ect1和ect2植物显示出比WT更严重的生长迟缓（图1，B和C），这表明ECT1和ECT2在拮抗SA诱导的胁迫反应中可能起作用。与该表型一致，响应于外源SA，SA应答基因（SARG）的表达，包括PATHOGENESIS RELATED1（PR1）和PR2，在ect1和ect2突变体中显著增强（图1D）。在此作者主要研究了未知的蛋白质ECT1，以进一步阐明其功能。由于成熟的lsd1突变体植物在没有外部刺激的连续光照（CL）条件下会发生SA依赖性非受控的叶细胞死亡，也称为失控细胞死亡（RCD），因此通过监测lsd1ect1双突变体与lsd1相比的相对RCD水平，以了解ECT1在SA驱动的胁迫反应中的潜在作用。ECT1的缺失显著增强了lsd1中的RCD（图S3，A和B），同时伴随着离子泄漏的增加（图S3C）和SARG的上调（图S3D），该观察结果进一步证实了ECT1在SA介导的RCD中的拮抗作用。![]()
图1. 多个YTH家族蛋白与LSD1相互作用，ect1和ect2突变体对SA敏感。A）BiFC验证LSD1与YTH家族蛋白的互作。B）WT和突变体拟南芥植物在有无SA处理的表型分析。C）基因型的平均植株大小。D）有无SA处理的PR1和PR2的相对表达水平。
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图S3. ECT1的缺失增强了SA引发的lsd1中的RCD。(A)至(C)WT、lsd1和lsd1ect1植株在CL条件下生长的植物变化(A)。叶面RCD的相对程度(B)，离子泄漏的含量(C)。(D)RT-qPCR检测SA应答基因（SARGs）的相对表达水平。
早期发现，一些胞质YTH家族蛋白在暴露于某些外部刺激后重新定位到胞质凝聚物中，所以作者检查了SA是否也可以引起ECT1凝聚。通过外源SA在烟草叶片中瞬时表达的ECT1-GFP融合蛋白进行观察，SA处理后观察到胞质ECT1-GFP胞质凝聚物，但在对照样品中未观察到（图2、A和B）。GFP信号与来自红色荧光蛋白（RFP）融合的PB或SG（图2C），证明SA诱导的ECT1凝聚成PB和SG。大约53%的ECT1-GFP胞质凝聚物似乎与UBP1B-RFP共定位，而45%与DCP5-RFP共定位（图2D）。ECT1胞质凝聚物的这种异质性表明其在SG和PB相关的细胞过程中具有独特的作用，或者它在形成SG和PB作为支架蛋白的普遍作用。然而，在SA处理后，与WT相比，在ect1中观察到的DCP5-RFP或UBP1B-RFP胞质凝聚物数量几乎相当（补充图S4、A和B);该结果排除了ECT1在PB和SG形成中充当支架蛋白的可能性。先前研究报道PB和SG是由RNA和蛋白质复合物的相分离形成的生物分子凝聚物。因此，作者想要去探究ECT1的相分离是否是胞质凝聚物形成的原因，通过在大肠杆菌细胞中纯化GFP标记的ECT1重组蛋白，并进行体外液-液相分离（LLPS）测定。结果表明，ECT1-GFP倾向于在体外形成液滴（图2E）。此外，附近的ECT1-GFP液滴在几秒钟内迅速融合（图2F），光漂白后的荧光恢复（FRAP）测定显示光漂白ECT1-GFP液滴的荧光信号在100秒后恢复到近60%（图2，G和H）。在多种RNA结合蛋白中发现的PrLD和IDR对于由内部和外部线索形成的RNA-蛋白质复合物的相分离至关重要。计算机预测表明ECT1还包含多个IDR，其中一些与PrLD和YTH结构域重叠（图2I）。为了测试ECT1凝聚成PBs和SGs是否需要PrLD或YTH，作者观察了PrLD缺失的ECT1（ECT1ΔPrLD）和YTH结构域缺失的ECT1（ECT1ΔYTH）在烟草叶片中瞬时表达时与GFP融合。SA处理后，ECT1-GFP和ECT1ΔYTH发现GFP位于相当数量的胞质凝聚物（CF）中;然而，PrLD缺失显著减少了CF的数量（图2，J和K），表明PrLD在介导ECT1的胞质凝聚中起着至关重要的作用。![]()
图2.ECT1和SA的LLPS驱动ECT1重新定位为胞质凝聚物。A）ECT1-GFP在烟草叶片中的亚细胞定位。B）亚细胞ECT1-GFP定位的3D图像。C）SA处理后ECT1-GFP与SG或PB标记蛋白的共定位。D）ECT1-GFP胞质凝聚物与UBP1B-RFP或DCP5-RFP共定位的频率（%）。E）重组GFP标记的ECT1蛋白（ECT1-GFP）的体外LLPS。F）ECT1-GFP的荧光延时显微镜图像显示2个液滴的动态融合。G）图像代表来自FRAP的ECT1-GFP。H）图显示了ECT1-GFP液滴漂白区域中回收荧光强度的定量，如G）所示。I）顶部：图表显示了完整的含有ECT1蛋白的PrLD和YTH结构域及其结构域缺失的变体，用于J）中的体内定位测定。J）处理后烟草叶片中PrLD或YTH结构域缺失的ECT1-GFP的亚细胞定位。
4.ECT1的作用是一个m6A Reader
由于在芳香族氨基酸残基中，色氨酸Trp267、Trp324和Trp329对建立疏水性芳香族笼至关重要。所以作者在CaMV35S启动子（35S）的控制下生成了表达ECT1-GFP或具有Trp267Ala、Trp324Ala和Trp329Ala突变的ECT1（muECT1）-GFP的拟南芥转基因系。尽管过表达了不同的ECT1突变体，但在正常生长条件下，与WT相比，转基因植株未观察到表型变化。用SA处理转基因植物叶面后，在共聚焦显微镜下监测ECT1-GFP的GFP信号，与之前在烟草中的观察结果一致（图2C），ECT1-GFP与DCP5-RFP和UBP1B-RFP共定位于拟南芥转基因植物中SA诱导的胞质凝聚物中。此外，在SA处理后，与ECT1-GFP相比，ECT1ΔPrLD-GFP而非muECT1-GFP显示CF的形成显著减少（图S8、C和D)。RNA免疫沉淀（RIP）与使用m6A抗体的斑点印迹测定偶联显示无论SA处理如何，m6A-mRNA都优先与ECT1-GFP结合，而muECT1失去了与m6A结合的能力（图3A），表明ECT1通过其芳香笼与m6A-mRNA结合，而不依赖于SA。此外，PrLD缺失似乎不会影响ECT1与m6A-mRNA的结合（图3A），进一步表明SA驱动的ECT1凝聚对于促进ECT1和m6A-mRNA之间的相互作用并非必不可少的。为了进一步确保ECT1和SA-m6A-mRNA的物理关联，作者利用了m6A-Atlas数据库分析了从先前发表的微阵列数据中获得的SARG（204个基因），并发现一组具有m6A修饰的基因。这些推测的SA-m6A-mRNA包括WRKY33、WRKY40、WRKY53、PAD4、TIR-NBS3（TN3）、METACASPASE2（MC2）和SENESCENCE-ASSOCIATED GENE21 (SAG21)，使用SA处理的RIP样品的所得RIP-RT-qPCR测定证实，与muECT1-GFP-免疫沉淀RNA相比，除了WRKY53之外，大多数这些潜在的SA-m6A-mRNA在ECT1-GFP和ECT1ΔPrLD-GFP免疫沉淀RNA中更富集（图3B）。然而，在所有免疫沉淀的RNA样本中均未观察到m6A倾向性非SARG的显著富集，包括TRANSPARENT
TESTA GLABRA1 (TTG1), IRREGULAR TRICHOME BRANCH1 (ITB1)和DISTORTED TRICHOMES2 (DIS2)，其功能与ECT2参与的毛状体形态发生相关（图3B）。
与muECT1-GFP的受损m6A结合能力一致，作者观察到相对于ect1植物中的SA驱动的生长抑制和SARG表达，ect1 muECT 1-GFP中SA驱动的生长抑制和SARG表达的程度相当（图3C至E）。相反，ECT1-GFP的表达挽救了ect1表型。此外，与muECT1-GFP类似，尽管ECT1ΔPrLD-GFP保留了与SA-m6A-mRNA的结合能力，但也未能恢复ect1表型（图3B至E）。这些结果表明，芳香笼所需的m6A的结合和PrLD驱动的胞质凝聚ECT1行为在减轻SA驱动的应激反应是必不可少的。![]()
图3.m6A结合能力和PrLD驱动的ECT1胞质凝聚是调节SA引起的应激反应所必需的。A）RIP偶联斑点印迹测定。B）SA处理样品（A）的RIP-RT-qPCR测定。C）WT及转基因植物的叶片表型。E）RT-qPCR检测的SARGs的相对表达水平。
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图S8. (A)采用GFP抗体免疫印迹法检测WT及转基因植物中GFP融合蛋白的研究。(B) ECT1-GFP与PB共定位。(C)拟南芥中ECT1-GFP、muECT1-GFP和ECT1△PrLD-GFP的亚细胞定位。(D)同一区域内富含的胞质凝聚物数量。
5.SARGs的mRNAs被隔离到ECT1胞质凝聚物中
考虑到响应SA的PrLD驱动的ECT1胞质凝聚物的快速出现（图2J和K;图S8C和D）及其内部函数m6A结合载量（图3、A和B），作者预计ECT1可能会隔离SA-m6A-mRNA转化为胞质凝聚物进行某种生物过程。为了研究这一概念，从SA处理的WT、ect1、表达游离GFP的WT转基因植物和表达ECT1-GFP、muECT1-GFP或ECT1ΔPrLD-GFP的ect1转基因植物的细胞裂解物中通过4个连续离心步骤分离出CF（图4A）。作者在这个过程中也表达SG标记蛋白（UBP1B-RFP）的WT转基因植物，以确保在细胞裂解液组分中富集CF。使用从富集的CF组分中提取的蛋白质进行免疫印迹分析，检测到ECT1-GFP、muECT1-GFP和ECT1ΔPrLD-GFP以及SG标志蛋白的存在（图4B）。然而，ECT1ΔPrLD-GFP与ECT1-GFP和muECT1-GFP相比，GFP显示分离的CF组分的富集减少，证实了PrLD在ECT1凝聚中的关键作用。随后作者使用RT-qPCR检测分离的CF中SA-m6A-mRNA和m6A倾向的非SARG的相对丰度。与WT和ect1之间观察到的模式相似，相对于ect1
muECT1-GFP，ect1 ECT1-GFP的CF中SA-m6A-mRNA的丰度明显更高，这进一步表明ECT1是SA响应性m6A阅读器（图4C）。此外，作者还观察到SA-m6A-mRNA的丰度与ECT1凝聚物之间存在强正相关。由于PrLD缺失导致的ECT1凝聚物的减少对应于CF中SA-m6A-mRNA富集的减少（图4C）。然后使用荧光激活颗粒分选（FAPS）进一步纯化预分选的CF级分，以富集ECT1（或muECT1或ECT1ΔPrLD）-GFP焦点（下文称为EEF）。基于大小和荧光信号的双密度，EEF可与表达游离GFP的WT的CF中检测到的非EEF颗粒区分开（图4D）。![]()
图4. ECT1与胞质凝聚物中的SA-m6A-mRNA相互作用。A）SA诱导的凝聚物的富集程序，以及随后使用FAPS的分离。B）使用免疫印迹分析来自指定基因型的CF的蛋白积累。C）RT-qPCR结果代表指定基因型CF中SA-m6A-mRNA和m6A倾向性非SARG的相对丰度。D）基于其大小和荧光，通过FAPS系统将标记的凝聚物与CF分离。
6.ECT1凝聚物促进SA诱导的mRNA的衰变。
鉴于ECT1与DCP5共定位（图2、C和D）;图S8B），DCP5是mRNA降解中实现的mRNA-去帽复合物的组分，作者使用WT、ect1、ect1ECT1-GFP、ect1muECT1-GFP和ect1ECT1ΔPrLD-GFP的幼苗进行了mRNA降解分析(图5A）。用SA处理幼苗，然后在6小时后用转录抑制剂虫草素渗透以确定所选SA-m6A-mRNA和m6A倾向的非SARG的衰减速率。所得的RT-qPCR分析揭示，ECT1或其m6A结合帽能力的丧失或CF的降低选择性地导致SA-m6A-mRNA的稳定性增加。此外，通过BiFC和Co-IP测定，作者观察到ECT1及其突变体与mRNA衰变因子的相互作用，包括DCP5、RH12和TUDOR STAPHYLO COCCAL
NUCLEASE2 (TSN2)（图5、C和D）.![]()
图5. ECT1的m6A结合能力和胞质凝聚是SA-m6A-mRNA的衰变的关键。A）mRNA衰变分析的实验设计。B）SA-m6A-mRNA和m6A倾向性非SARG子集的衰变速率。C和D）使用烟草叶片瞬时共表达，通过BiFC（C）和Co-IP（D）测定检测几种不同基因系的mRNA衰变因子的相互作用。
7.ECT1负调控植物对PstDC3000的防御反应
由于SA促进对活体营养型病原体的防御，因此在植物-病原体相互作用期间研究了ECT1的生物相关性。首先确定病原体感染是否诱导ECT1冷凝物。将Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000接种到4周龄的ect1 ECT1-GFP植物中，并在共聚焦显微镜下监测GFP信号。类似于SA诱导的ECT1-GFP信号，在用细菌病原体感染后观察到CF（图6A）。与WT植物相比，Pst DC3000的生长在ect1、ect1
muECT1-GFP和ect1 ECT1ΔPrLD-GFP植物中降低，但在ECT1-GFP过表达系中增加（图6B）。此外，ECT1过表达显著抑制SARG的表达，而它们在ect1、ect1
muECT1-GFP和ect1 ECT1ΔPrLD-GFP中的表达水平高于WT（图6C），表明ECT1凝聚物在与活体营养型病原体相互作用期间负调控SA介导的植物防御反应。![]()
图6. ECT1凝聚物负向调节植物免疫。A）用Pst DC3000浸润1天后，ECT1-GFP在4周龄拟南芥稳定转基因植株中的亚细胞定位。B和C）用Pst DC
3000浸润WT及转基因拟南芥植物。在浸润后2天测量细菌生长（B）。在浸润后第1天通过RT-qPCR测定SARG的表达水平（C）。
=== 总结 ===
综上所述，在SA增加的应激条件下，ECT1通过其芳香笼结合SA-m6A-mRNA，将它们隔离成胞质凝聚物。随后的mRNA衰变途径和mRNA储存在ECT1相关凝聚物中可能会减慢这些SARG的翻译，从而限制SA诱导的应激反应。![]()
图7: ECT1凝聚物如何抵消与SA相关的植物胁迫反应的模型
------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
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