2022年8月，四川大学生命科学学院林宏辉和张大伟团队在高质量期刊New Phytologist发表了题为Nitrogen-inducible GLK1 modulates phosphate starvation
response via the PHR1-dependent pathway的论文。作者发现GARP型转录因子GLK1通过PHR1依赖途径在拟南芥中作为磷酸盐饥饿反应（PSR）的正调节因子，调控对无机正磷酸盐（Pi）饥饿的多重反应。这一研究发现为探究植物磷饥饿反应机制提供新的理论依据。
=== 研究背景 ===
磷是植物生长的重要营养物质，无机磷酸盐（Pi）是植物吸收磷的主要形式。为应对Pi饥饿胁迫，植物进化出许多促进Pi吸收和使用的策略，这些被称为Pi饥饿反应（PSRs）。氮（N）是[花叶1] 植物生长发育的另一个重要元素。已有研究表明氮和磷信号通路之间存在很强的相互作用，但对N-P相互作用的分子机制仍存在很多未知。Golden2-like（GLK）基因是GARP（Golden2,ARR-B,Psr1）转录因子家族的成员，先前研究表明，GLK1参与了Pi饥饿下根系构型（RSA）的重塑，但其调控机制尚不清楚。
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=== 研究结果 ===
1.GLK1是一个PSR转录因子
已知GLK1参与PSR并介导初生根生长的抑制。作者对其进行定量分析，结果显示IPS1（Pi饥饿的标记基因）的表达被高度诱导（图1a）GLK1在LP条件下的转录水平与HP条件下相似（图1b）。表明Pi饥饿不影响GLK1基因的表达。然后作者检测了GLK1在蛋白水平上的反应模式。与HP处理相比，Pi饥饿显著诱导GLK1蛋白的积累（图1c，e）。为进一步了解Pi饥饿对GLK1蛋白的影响，作者添加蛋白质合成抑制剂环己亚胺（CHX）。免疫印迹分析显示，Pi饥饿延迟了GLK1的蛋白降解，降解被MG132（26S蛋白酶体途径抑制剂）阻断（图1d,f)。这些结果表明，GLK1是一种PSR转录因子，Pi饥饿增加了GLK1蛋白的积累和稳定性。MG132对蛋白质降解的抑制作用提示蛋白质泛素化/26S蛋白酶体途径可能参与了这一过程。图1.拟南芥中无机磷酸盐（Pi）饥饿诱导GLK1蛋白积累。（a,b）定量PCR检测Pi饥饿下IPS1和GLK1的表达。（c,d）Pi饥饿下GLK1蛋白的响应模式。（e,f）（c,d）中GLK1蛋白丰度的定量。为进一步评估GLK在PSR中的作用，作者创制了GLK的过表达和突变株系。HP条件下，各株系主根长度没有明显差异（图2a，b），但GLK1-O3和GLK1-O5的根毛长度增加（图2c，d）。LP培养时，与Col-0相比，glk1和glk2单突变体在主根和根毛的长度上没有明显的变化（图2a-d）。glk1glk2双突变体表现出pi饥饿敏感性的降低，包括主根和根毛的长度（图2a-d）。GLK1-O3和GLK1-O5幼苗抑制初生根生长和促进根毛的伸长率（图2a-d）。然后作者测量Pi含量，发现在HP和LP条件下，GLK1-O3和GLK1-O5中茎和根的Pi含量都显著高于Col-0，而glk1glk2双突变体的Pi含量较低（图2e，f）。综上所述，这些结果表明GLK1调节了对Pi饥饿的多种反应，包括Pi摄取、PSI基因的表达和RSA的重塑，并在这一过程中与GLK2存在功能冗余。![]()
图2 . GLK1过表达增强了对无机磷酸盐（Pi）饥饿敏感性。（a）Pi饥饿下不同株系表型比较。（b）图（a）中幼苗主根长度的定量。（c）图（a）中幼苗根毛的表型比较。（d）图（c）中幼苗根毛长度的定量。（e，f）定量测量图（a）中幼苗的茎在（e）和（f）中的Pi浓度。
为确定与GLK1潜在的相互作用蛋白，作者进行了Y2H测定，发现GLK1与PHR1的部分片段相互作用，PHR1是PSR的中心调节因子（图3a）。之后作者利用下拉试验验证互作（图3b）。随后在体内进一步进行了BiFC和Co-IP检测以检测物理相互作用（图3c，d）。基于这些结果，作者推测GLK1在体外和体内与PHR1相互作用。
图3. GLK1与PHR1相互作用。（a）酵母双杂交（Y2H）试验。（b）His pull-down实验。（c）双分子荧光互补法（BiFC）。（d）共免疫沉淀法。
4.GLK1增强PHR1的转录活性
已有研究称PHR1可以激活IPS1和RNS1的表达。为探究GLK1和PHR1的相互作用是否介导了PHR1的转录活性，作者采用瞬时表达法在原生质体中与报告子共表达（图4a）。结果显示PHR1有效激活了pIPS1-LUC和pRNS1-LUC的表达（图4b，c）。GLK1共表达后，表达量明显增加（图4b，c）。这些初步结果表明，GLK1增加了PHR1的转录活性。随后，为分析与GLK1相互作用对PHR1的DNA结合能力的影响。将GLK转基因株系与PHR1过表达系杂交，然后进行ChIP实验。用BS1、BS2和BS3标记PHR1在RNS1和IPS1启动子中的结合位点（图4d）。qPCR分析发现在HP和LP条件下，目标DNA片段中PHR1-OX/GLK1-O5的富集程度高于PHR1-OX，而PHR1-OX/glk1glk2的富集程度低于PHR1-OX（图4e）。另外作者进行了电泳迁移率转移实验，发现GLK1无法与IPS1启动子中的假定结合位点结合，但其存在增强了PHR1与探针之间的相互作用。这些结果表明，GLK1不能直接与IPSI基因结合，但PHR1与GLK1的相互作用增强了PHR1的DNA结合能力，从而提高了PHR1的转录活性。![]()
图4. GLK1通过增强PHR1 DNA结合能力提高其转录活性。（a）原生质体瞬时表达试验效应器和报告器示意图。（b，c）原生质体内萤火虫荧光素酶（REN/LUC）的相对活性。（d）RNS1和IPS1启动子与假定的P1BS（BS1、BS2和BS3）的示意图。（f-h）定量分析3种Pi饥饿诱导（PSI）基因（IPS1、SPX1、RNS1）的表达。（i，j）幼苗芽(e)和根(f)中无机磷酸盐（Pi）浓度的定量测定。
5.GLK1以PHR1依赖的方式作为PHR1介导PSR的关键
为进一步探究GLK1如何参与PHR1介导的PSR过程，作者根据瞬时检测发现PHR1促进了PHR1-OX植物中IPS1、RNS1和SPX1的表达（图4f-h）。PHR1的过表达增加了茎和根中Pi的积累（图4i，j）。只有在LP条件下，GLK1和GLK2的缺失会抑制PHR1介导的Pi浓度上调（图4i，j）。在HP条件下，GLK1的存在与否不影响PHR1对P浓度的影响（图4i，j）。这些结果说明，PHR1和GLK1之间的功能相互作用，并且PHR1激活PSR需要与GLK1相互作用。作者想验证PHR1是否对于GLK1在PSR中的功能是必需。通过将GLK1-O5与phr1-1杂交产生GLK1-O5 /phr1-1，对其进行Pi饥饿处理。定量分析显示，在GLK1-O5/phr1-1中PSI基因表达和Pi积累显著受损，且与phr1-1水平相似（图5a-e）。综上可知，GLK1通过PHR1依赖性途径调节PSR。图5. GLK1在PSR中的作用需要PHR1存在。（a-c）定量分析Pi饥饿诱导（PSI）基因（IPS1，SPX1，RNS1）的表达。（d，e）幼苗芽、根中无机磷酸盐（Pi）浓度的定量测定。
6.GLK1-PHR1模块的功能很大程度上依赖于N供应
在拟南芥中，转录组学分析表明绝大多数PSI基因的表达依赖于硝酸盐供应，作者目前的研究结果与该结论相符合。因此PSR的激活强烈很可能依赖于氮供应，特别是硝酸盐。为研究GLK1-PHR1模块的功能是否需要N，作者观察不同NH4NO3浓度下的HP和LP条件拟南芥幼苗。发现在缺氮条件下，Pi饥饿诱导的根毛长度增加消失（图6a，b）。并且根毛发育受到严重损害，且看起来更短更细（图6a）。另外GLK1和PHR1对PSI基因和Pi在HP和LP两种条件下，随着NH4NO3浓度的减少，积累均显著受损（图6c-g）。综上说明N的存在对于GLK1和PHR1的作用是必要的。图6. 拟南芥中GLK1-PHR1模块在磷酸盐饥饿反应（PSR）中的功能依赖于氮(N)供应。（a）Col-0、GLK1-O5、PHR1-OX和PHR1-OX/GLK1-O5幼苗的根毛表型比较。（b）（a）中幼苗根毛长度的定量。（c-e）饥饿诱导（PSI）基因（IPS1,SPX1,RNS1）在这些幼苗中表达的定量分析。（f，g）幼苗茎、根中Pi浓度的定量测定。
7.GLK1和PHR1的积累受N状态的控制
为研究GLK1和PHR1如何受N状态调节，作者检测了GLK1对N饥饿的反应模式。缺氮处理下，N饥饿的标记基因NRT2.4表达被显著诱导。qPCR分析显示N饥饿降低了GLK1的转录水平（图7a）。蛋白水平上，作者发现N饥饿诱导GLK1蛋白的降解，添加MG132（26S蛋白酶体途径的抑制剂）抑制了降解（图7b）。添加蛋白合成抑制剂环己亚胺（cycloheximide，CHX）。免疫印迹分析显示，N饥饿加速了GLK1的蛋白质降解，并被MG132阻断（图7b）。据此，作者认为N饥饿不仅抑制了GLK1的基因表达，还加速其蛋白降解。MG132对这一降解的抑制作用表明，蛋白泛素化/26S蛋白酶体途径可能参与了这一过程。另外作者还发现N饥饿诱导PHR1在蛋白质水平而不是转录水平降解，添加的MG132抑制了蛋白质降解（图7a，b）。作者进一步检测GLK1和PHR1对N供应的响应模式。对Col-0幼苗进行4氮饥饿预处理，然后幼苗转移到以NH4NO3为唯一氮源的培养基中。提供NH4NO3可快速触发NRT1.1（一种硝酸盐前哨基因）的表达。qPCR分析显示GLK1与NRT1.1的响应模式相似，在模拟处理中都保持极低的表达水平（图7c）。并且NH4NO3能快速诱导GLK1蛋白丰度（图7d）。此外，PHR1对N供应的转录响应较弱，但NH4NO3可高度诱导PHR1蛋白的积累（图7c-f）。综上，作者认为GLK1和PHR1的积累受N状态控制。图7. 拟南芥中GLK1和PHR1的积累受氮(N)状态的控制。（a）定量PCR检测N饥饿条件下GLK1、PHR1和NRT2.4的表达谱。（b）GLK1或PHR1蛋白在缺氮条件下的响应模式。（c）NH4NO3供给后时间依赖性表达谱。（d）NH4NO3供给后蛋白时间依赖性响应模式。（e）NH4NO3诱导的浓度依赖性表达谱。（f）N诱导的浓度依赖性响应模式。
8.GLK1介导N对PHR1蛋白积累的影响
作者预测GLK1是氮同化的重要调节因子。检测了不同遗传背景下PHR1对N供应的浓度和时间依赖性反应模式。结果显示GLK1提高了NH4NO3诱导的PHR1蛋白积累（图8a，b）。定量分析表明，GLK1的加速作用主要发生在低浓度时（图8b），时间过程分析结果也验证了这一点（图8c，d）。此外，免疫印迹分析显示，随着NH4NO3的减少，所有植物的PHR1蛋白都被降解（图8e，f）。这些结果表明，在限氮条件下，GLK1介导N对PHR1蛋白积累的影响的途径。在进一步的研究中，为揭示GLK1如何在不同的N供应条件下影响PHR1蛋白的稳定性。作者通过无细胞降解实验和检测不同N浓度下PHR1蛋白的泛素化水平发现：在N限制条件下，与GLK1的相互作用并不直接影响PHR1蛋白的稳定，而是影响PHR1蛋白的泛素化水平。氮(N)浓度较低时，GLK1的存在促进了PHR1蛋白的积累。（a）N诱导PHR1蛋白的浓度依赖性响应模式。（b, d, f）、（a）、（c）和（e）中PHR1蛋白丰度的定量。（c）用NH4NO3诱导PHR1蛋白的时间依赖性响应模式。（e）P/N组合下PHR1蛋白丰度的Western blotting分析。图8. 氮(N)浓度较低时，GLK1的存在促进了PHR1蛋白的积累。（a）N诱导PHR1蛋白的浓度依赖性响应模式。（b, d, f）、（a）、（c）和（e）中PHR1蛋白丰度的定量。（c）用NH4NO3诱导PHR1蛋白的时间依赖性响应模式。（e）P/N组合下PHR1蛋白丰度的Western blotting分析。
=== 总结 ===
综上，作者提出GLK1在PSR中的调控机制并建立了一种GLK1介导N-P相互作用的工作模型：在N限制条件下,GLK1主要通过影响PHR1蛋白泛素化介导N对PHR1蛋白稳定性的影响。虽然N的限制会显著诱导GLK1和PHR1的降解，但GLK1的低丰度有助于降低PHR1的泛素化，维持PHR1的积累，从而有效激活PSR。这一结果为后续更好理解N-P相互作用提供了一条新的途径。
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