2024年1月，浙江大学周杰教授团队在著名期刊Plant Physiology and Biochemistry上发表一篇题为BAG8 positively regulates cold stress
tolerance by modulating photosystem, antioxidant system and protein protection
in Solanum lycopersicum的文章。作者通过转录组表达鉴定出番茄中响应冷胁迫的BAG基因，创制相关基因的过表达和突变体株系，分析表明，BAG8能够缓解低温诱导的光系统损伤，提高低温胁迫下植物体内抗氧化酶的活性来减少过量的ROS和MDA的积累，BAG8与参与保护PSII的热激蛋白Hsp70和参与气孔发育的蛋白磷酸酶PP2A相互作用。本结果表明，BAG8可能通过改善光系统和抗氧化系统以及与Hsp70互作在番茄耐寒性中发挥积极作用。![]()
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冷胁迫是影响植物生长发育的主要环境胁迫因子之一。它不仅影响植物的生长发育，还会降低其产量和品质，严重限制了农业生产力和许多作物的生长，其主要体现在改变酶活性、膜系统、细胞失水等，导致细胞代谢紊乱，甚至细胞死亡。因此，植物体内逐渐形成了复杂的抗逆机制，如合成应激蛋白、增加渗透调节物质、提高保护酶活性等，以增强其耐冷性。BAG家族是动植物中相对保守且多功能的辅助分子伴侣，可调控从生长发育到温度胁迫、盐碱、干旱、紫外线等多种胁迫响应过程。在番茄基因组中有10个BAG基因家族的同源基因。现有研究报道植物BAG蛋白参与调控衰老、自噬等生物学过程，在植物响应各种逆境胁迫中发挥重要作用。作为分子伴侣，BAG家族提高植物抗性的机制主要可分为3个方面。首先，BAG家族可以优化植物的光合性能。其次，BAG蛋白能够缓解逆境胁迫下的氧化损伤。如AtBAG4在水稻中的异源表达可能通过稳定ROS和光合效率来提高水稻对盐胁迫的耐受性。最后，BAG蛋白在胁迫条件下与其他蛋白结合，或者增强蛋白活性，或者使蛋白失活，从而调节细胞内环境以适应外界胁迫。
本文作者通过气体交换参数分析、CRISPR -Cas9基因编辑技术、ROS测定与组织染色、亚细胞定位、Y2H、BiFC、pull down等研究方法，揭示了BAG8在冷胁迫中的功能和调控途径，为植物耐寒性提供了新的见解。# 思维导图：
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1、BAG8在番茄耐寒性中的作用
为了鉴定出番茄中响应冷胁迫的BAG基因，作者对SlBAGs进行了冷胁迫下的转录组分析，发现6个BAG基因( BAG1 / 4 / 6 / 7 / 8 / 9 )在低温处理的WT植株中的表达水平出现上调（图1）。BAG8和BAG9基因在冷胁迫下上调表达最多，而BAG8在番茄植株中对冷胁迫的响应最为显著。图 1. BAG基因响应冷胁迫的转录本热图。对冷胁迫0 h、6 h、9 h、12 h和24 h的BAGs表达模式进行聚类分析。使用log2对数转换的表达值制备热图。从红色到绿色的颜色变化代表表达量由高到低。为了研究BAG8是否参与植物耐冷性的调控，我们构建了bag8突变体和BAG8过表达植株，并对5周龄bag8突变体、野生型( WT )植株和BAG8过表达植株进行5天的低温处理。在正常生长条件下，bag8突变体、WT植株和BAG8过表达植株表现出相似的表型(图2A )。与WT相比，bag8突变体表现出较差的耐冷性，叶片萎蔫症状严重，而BAG8过表达植株表现出显著提高的耐冷性，萎蔫症状轻微。冷胁迫导致相对电导率REL水平显著升高。WT的REL水平从常温的21.3 %上升到冷处理后的55.9 %。与表型一致，bag8突变体的REL水平分别比WT高25.4 %和22 %；然而，BAG8过表达植株的REL水平比WT低31.7
%和22.2 % (图2B )。图 2.BAG8对番茄植株耐寒性的影响。 ( A ) bag8突变体、野生型和BAG8过表达植株在无冷胁迫和冷胁迫条件下的拍照图像。( B )冷处理5 d后测定番茄幼苗相对电解质渗漏率( REL )。
2、低温胁迫下BAG8对气体交换参数和光系统变化的影响
光合作用是植物生长发育的主要决定因素，并且受到低温的抑制。在对照条件下，bag8突变体、WT和BAG8过表达植株的Pn、Gs、Tr和Ci等光合参数均无显著差异。冷胁迫显著降低了野生型植株的Pn、Gs和Tr，降幅分别为58.3 %、54.9 %和36.7 % (图3A -
C)。同时，低温胁迫使WT植株的Ci显著增加了24.1 %，bag8突变体的Ci与WT相比显著增加了约6.7 %，而BAG8过表达植株的Ci与WT植株相比降低了7 % (图3D )。图 3. BAG基因响应冷胁迫的转录本热图。(A)净二氧化碳(CO2)同化率(Pn)。(B)气孔导度(Gs)。(C)蒸腾率(Tr)。(D)细胞间CO2同化率浓度(Ci)。
为了验证BAG8是否影响着PSI和PSII的光抑制和光氧化损伤，作者检测了WT、bag8突变体和BAG8过表达株系在低温胁迫下PSI和PSII的变化。如图4所示，低温胁迫显著降低了野生型植株PSI Y ( I )的量子效率和P700最大光氧化水平Pm，而低温胁迫显著提高了野生型植株PSI Y供体侧限制( ND )和PSI Y受体侧限制( NA )的量子产量。在bag8突变体中，Y ( I )和Pm的减少分别加剧了17.6 %和14.2 %，BAG8过表达株系分别约为15.7 %和14.2 % (图4A - B)。此外，与WT植株相比，bag8突变体中Y ( ND )降低了23.8 %，而BAG8过表达植株中Y ( ND )增加了23.8 % (图4C )。相反，与野生型相比，bag8突变体中Y ( NA )增加了10.5 %，而BAG8过表达植株中Y ( NA )降低了10.5 % (图4D )。这些结果表明BAG8减轻了冷胁迫诱导的PSI损伤。
图 4. 冷胁迫下番茄植物光系统I（PSI）的变化。（A）光系统I能量转换的量子效率Y(I)。（B）最大P700光氧化水平Pm。（C）PSI供体侧限制的量子产量Y(ND)。（D）受体侧限制的PSI量子产量Y(NA)。冷胁迫还会抑制光合电子传递，降低光化学效率，导致PSII最大光化学效率( Fv / Fm )显著降低。相关结果表明，低温胁迫下bag8突变体的Fv / Fm比WT低26.9 %， BAG8过表达植株的Fv / Fm比WT植株高23.1 % (图5A - B)。低温胁迫下野生型植株PSII的有效量子产量Y ( II )和光化学淬灭( qP )显著降低，而过表达BAG8则分别降低了31.7 %和25.8 % (图5C - D)，bag8突变体中PSII的损伤更为严重，与野生型相比，分别增加了24.4 %和24.2 %。在低温胁迫下，WT植株的非光化学淬灭NPQ增加以保护光系统，并且这种增加在BAG8过表达植株中更加明显，增加了23.1 %。同时，这种NPQ的增加在bag8突变体中被削弱了23.1 % (图5E )。低温胁迫下WT中非调节性能量耗散Y ( NO )的量子产率显著增加，表现出显著的光抑制。然而，这种增加在BAG8过表达植株中大大减弱了17.1 %，但在bag8突变体中却加剧了20 % (图5F )。这些结果表明，BAG8保护PSII免受冷胁迫的损伤，并激活NPQ系统保护植物免受冷诱导的光抑制。图 5. 冷胁迫下番茄植物光系统II（PSII）的变化。（A）在番茄幼苗经过5天冷处理后的假彩色编码图像，（B）光系统II的最大光化学效率（Fv/Fm）。（C）PSII能量转换的有效量子产量Y(II)。（D）光化学淬灭（qP）。（E）非光化学淬灭（NPQ）。（F）非调控能量耗散的量子产量Y(NO)。
3、BAG8增强了低温胁迫下的抗氧化酶活性
冷胁迫还通过产生ROS，如单线态氧、超氧阴离子( O2- )和过氧化氢( H2O2 )、·OH自由基，引起氧化应激。为了探究BAG8对冷胁迫诱导的氧化应激的影响，作者测定了冷胁迫下番茄叶片中MDA的含量。低温胁迫导致番茄叶片和bag8突变体中MDA含量显著增加，与WT植株相比，分别增加了27.8 %和24.8 %，而BAG8过表达植株分别降低了27.1 %和36.8 %(图6A)。通过DAB和NBT对番茄叶片进行了组织化学染色，在对照条件下，DAB和NBT染色显示bag8突变体、WT和BAG8过表达植株叶片中无显著差异。在冷胁迫下，bag8突变体中DAB和NBT染色显著增加，BAG8过表达植株中降低(图6B)。以上结果表明，BAG8通过降低冷胁迫诱导的ROS产生来提高番茄植株的耐冷性。图 6. BAG8在冷胁迫下丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）积累的影响。（A）丙二醛含量。（B）DAB和NBT染色。
植物受到冷胁迫后，植株中超氧化物歧化酶( SOD )、过氧化物酶( POD )、谷胱甘肽还原酶( GR )、抗坏血酸过氧化物酶( APX )、脱氢抗坏血酸还原酶( DHAR )和过氧化氢酶( CAT )6种抗氧化酶活性均升高。实验表明，低温诱导的抗氧化酶活性的增加在bag8突变体中受到抑制，并且在BAG8过表达植株中显著升高(图7)。综上所述，BAG8能够促进低温胁迫下抗氧化酶的活性，从而缓解番茄植株体内过量ROS积累造成的伤害。![]()
图 7. 冷胁迫处理番茄叶片中的几种关键抗氧化酶的活性。（A）超氧化物歧化酶( SOD )。（B）过氧化物酶( POD )。（C）谷胱甘肽还原酶( GR )。（D）抗坏血酸过氧化物酶( APX )。（E）脱氢抗坏血酸还原酶( DHAR )。（F）和过氧化氢酶( CAT )。
4、BAG8与Hsp70和PP2A相互作用
为了进一步了解BAG8的分子功能，作者通过酵母双杂交( Y2H )筛选寻找与BAG8互作的蛋白。确定了参与保护PSII免受光抑制的Hsp70蛋白和正调控气孔发育的蛋白磷酸酶PP2A。通过Y2H，确定BAG8与Hsp70和PP2A蛋白在酵母中存在相互作用(图8A )。此外，亚细胞定位显示BAG8定位于细胞核和细胞质中(图S2 )。在BiFC实验中，全长BAG8与Hsp70在细胞核和细胞质中均存在相互作用，全长BAG8与PP2A仅在细胞质中存在相互作用(图8B )。在pull-down实验中，GST - Hsp70和GST - PP2A均被MBP - BAG8拉下(图8C )。这些结果表明Hsp70和PP2A在体外和体内均能与BAG8相互作用。图 8. BAG8与Hsp70和PP2A相互作用。（A）Y2H。（B）BiFC。（C）pull-down。
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附图 S2. SlBAG8的亚细胞定位。
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在本研究中，作者探究了SlBAG8在番茄响应冷胁迫中的作用，构建BAG8过表达和bag8突变体株系，测定气体交换参数、光合活性、氧化酶活性等关键参数，发现BAG8的表达在低温胁迫下被显著诱导，BAG8缓解了低温诱导的光合系统损伤，冷胁迫下活性氧水平更低，氧化酶活性更高，并证明BAG8与Hsp70和PP2A在体内体外的相互作用，二者分别与植物响应胁迫和蛋白质磷酸化作用相关，可能激活BAG8在冷胁迫下的磷酸化并共同调控番茄的耐寒性。
期刊：Plant Physiology and Biochemistry------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
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