PJ | 通过发育调控因子和可见报告基因探索经济高效的萝卜遗传转化和基因组编辑系统

1.基于甜菜碱的视觉报告仪用于监测萝卜转基因毛状根

为了探索转化传递的有效和可视化报告基因，作者将包含甜菜红素合成的所有关键基因（BvCYP76AD1、BvDODA1和MjcDOPA5GT，与“自裂解”P2A肽连接）的RUBY系统引入阳性毛状根中识别（图1a）。作者在初步实验中使用发根农杆菌菌株MSU440用DR5::RUBY转化无根幼苗外植体。但通过甜菜碱积累只能产生非常低的红紫色转基因毛状根（其中，从126个外植体中总共诱导出392个毛状根，只有两个毛状根呈现红紫色）。造成这种现象的原因可能是DR5启动子的表达受到生长素浓度的影响。于是作者从DR5::RUBY中克隆了RUBY序列，并将其与甘露碱合酶(MAS)启动子一起导入pCAMBIAsuper1300载体中，与常见的组成型花椰菜花叶病毒CaMV35S相比，它可以将β-葡萄糖醛酸酶活性的表达提高到2-20倍，并创建了超级MAS::RUBY-1300（图1b）。产生重组质粒MAS::RUBY-1300，并通过发根农杆菌菌株MSU440将其转化到以无根幼苗为外植体的萝卜中。约2周后，无根苗伤口处出现肉眼可见的红紫色毛状根，转化效率提高至21.15%~31.33%（图1c；表1）。这些结果表明RUBY的异位表达将成为监测萝卜转基因品系筛选的便捷有效的系统。

为了获得稳定的转基因植物，作者尝试诱导转基因毛状根再生芽。当毛状根长到3-4cm长度时，切下约0.5cm长的片段作为外植体，然后转移到愈伤组织诱导培养基中。一个月后，将诱导的愈伤组织转移到四种不同的芽分化培养基中（图1d）。在毛状根外植体中，愈伤组织诱导率可达77.42%至87.84%（图1d，e）。然而，在任何一种SIM激素浓度组合下都没有观察到再生芽（图1e）。因此，萝卜的根-茎转化系统仍然是获得完整转基因植物的障碍。

图1.RUBY在萝卜中充当有效且可见的报告基因。(a)RUBY报告载体示意图。(b)使用序列特异性引物RUBY-F和RUBY-R克隆RUBY基因。(c)在MS培养基上观察红紫色转基因毛状根30天。(d)将红紫色转基因毛状根在愈伤组织诱导培养基(CIM)上进行愈伤组织诱导30天。(e)愈伤组织诱导60天后，在芽分化培养基上进行芽诱导。

表1.RUBY报告基因在转基因萝卜根中的应用。

2.无需外部提供激素,发育调节剂可直接产生芽

将特定的DR或其组合传递到体细胞中，有可能产生从头修饰的分生组织，然后转分化为其他细胞类型。在此工作的基础上，作者采用两种有效的DR，包括玉米Wus2和ipt，以及它们的组合Wus2-ipt，用来测试它们是否可以诱导萝卜的芽器官发生并提高转化效率。在强组成型启动子35S的作用下表达特异性DR的重组质粒分别被发根农杆菌递送至萝卜无根幼苗（图2a）。结果表明，单次施用Wus2或ipt可以极大地促进萝卜伤口部位的细胞增殖和愈伤组织形成（图2b、c）。而DR组合Wus2-ipt的应用不仅促进了伤口处愈伤组织的发育，而且还直接诱导了感染组织的芽状生长（图2d；图S2）。作者还准确观察了愈伤组织和芽诱导效率。观察到最高愈伤组织诱导效率是ipt为78.89–86.62%，其次是Wus2，占66.00–76.76%，而Wus2-ipt仅占59.41–69.18%（表3）。更重要的是，Wus2-ipt的芽诱导效率为29.21-40.00%，而单独施用Wus2或ipt时没有观察到再生芽（表3），新芽萌生和新芽生长的整个过程不需要供给任何外部激素。

图2.通过在萝卜中过度表达发育调节因子(DR)来促进再生和转化。(a)DRs报告载体示意图。这些DR表达载体包括Wus2、ipt及其组合Wus2-ipt。(b)Wus2在毛状根诱导培养基(RIM)上过表达30天。(c)ipt在根诱导培养基(RIM)上过表达30天。(d)通过在RIM上过表达Wus2-ipt组合30天，从萝卜无根幼苗的伤口部位再生出芽。

表2.RUBY报告基因对萝卜愈伤组织和芽的诱导

3.Wus2-ipt-RUBY系统大大提高了萝卜的转化效率

接下来，作者将Wus2-ipt与RUBY视觉报告基因盒结合，建立了萝卜的高效遗传转化系统（图3a）。将切下的无根5-6天幼苗作为外植体，并与含有Wus2-ipt-RUBY重组载体的发根农杆菌菌株MSU440共培养36-48小时（图3b-g)。然后，将外植体转移至MS培养基培养（图3h）。15-20天伤口部位形成红紫色愈伤组织（图3i），10天后逐渐观察到新生芽和增殖的愈伤组织（图3j）。将长出的芽和愈伤组织剪掉并转移到培养基中进行2周的芽生长（图3k-n）。随后，将所有获得的植物在生根培养基（RFM）上生根培养30-40天，然后在适应4天后将它们移植到带有基质（泥炭：蛭石=2：1）的盆中。最后，将这些转化的小植株转移到温室以获得转基因T0植物（图3o，p）。PCR结果进一步表明Wus2-ipt-RUBY系统成功转化，红紫色芽中存在RUBY和Wus2转基因（图3q，r）。在温室中生长约40天后，连续的红紫色花朵突然绽放，并在立体显微镜下观察非转基因和转基因Wus2-ipt-RUBY花的解剖结构（图4a-d）。与非转基因花相比，Wus2-ipt-RUBY的花萼、花瓣、雄蕊和柱头表现出甜菜碱的过量积累（图4b，c）。自花授粉15-20天后，形成了饱满的红紫色豆荚，种子也结实饱满（图4e-g）。结果表明，通过Wus2-ipt-RUBY系统可以成功获得可育的重组萝卜植株。

图3.通过在萝卜中过表达Wus2-ipt-RUBY系统来促进芽再生和转化效率。(a)Wus2-ipt-RUBY载体示意图。（b）将萝卜种子“NAU-LHZ”播种在MS培养基上。(c,d)幼苗生长6天，除去原来的根，留下下胚轴伸长0.5-1厘米的无根幼苗。(e-g)接种发根农杆菌MSU440后，将外植体感染并共培养36-48小时。(h)将外植体培养到MS上。(i)感染15-20天后伤口部位形成红紫色愈伤组织。(j)感染25-35天后伤口部位形成红紫色愈伤组织。(k-n)将出现的芽和从感染的幼苗上切下的愈伤组织转移到毛状根诱导培养基中进行2周的芽生长。(o)芽在生根形成培养基(RFM)中生长30天。(p)适应4天后将植物移植到盆中。(q)通过序列特异性引物RUBY-F1和RUBY-R1对RUBY基因进行PCR检测。(r)通过序列特异性引物Wus2-F和Wus2-R对Wus2基因进行PCR检测。

图4.Wus2-ipt-RUBY转基因植物中花形成、可育萝卜后代和种子生产的形态学观察。(a)开花前15天的营养发育情况。(b)转基因植物的开花。（c，d）分别在立体显微镜下解剖非转基因和转基因Wus2-ipt-RUBY花。花被解剖成四个部分：花萼、花瓣、雄蕊和柱头。(e)转基因植物的种子生产。(f，g)从非转基因和转基因Wus2-ipt-RUBY植物获得的种子。

4.Wus2-ipt-RUBY 促进萝卜的CRISPR/Cas9靶向高效基因组编辑

基于Wus2-ipt-RUBY遗传转化系统，作者打算确定该系统是否可以用于产生基因编辑的萝卜植物。T-DNA携带一个表达盒，表达两个sgRNA位点RsPDS-sgRNA1（目标位点1）和RsPDS-sgRNA2（目标位点2），靶向胡萝卜素途径基因八氢番茄红素去饱和酶(PDS)中的关键酶。这两个sgRNA位点被转移到由发根农杆菌菌株MSU440介导的萝卜中（图5a），并且RsPDS表达破坏造成叶绿素光漂白导致植株白化。大约有200个外植体被转化，其中6株植物成功表现出完整的白化表型，基因组编辑效率为3.00%（图5b）。RsPDS基因的靶序列包含两个sgRNA位点，通过PCR产物的TA克隆筛选和Sanger测序检测到六株白化植物，以研究突变类型并鉴定靶位点的突变（图5c，d）。随机选取70个克隆进行测序，其中所有克隆在靶位点2处出现突变，但在位点1处未检测到突变（图5e，f）。1 bp T插入频率为48.57%，2 bp AC缺失（38.57%）为普遍突变类型，突变频率均为87.14%（图5e、f）。总的来说，这些结果表明，基于Wus2-ipt-RUBY系统的高效CRISPR/Cas9介导的编辑工具已经在萝卜中建立，用于改变特定的基因组DNA序列。

图5.Wus2-ipt-RUBY促进了CRISPR/Cas9介导的RsPDS基因组编辑。(a)RsPDS基因编辑构建体的结构。(b)RsPDS基因编辑的白化萝卜突变体芽的照片。(c)使用引物Cas9-F和Cas9-R通过PCR证实Cas9基因的存在。(d)使用序列特异性引物RsPDS-sgRNA-F和RsPDS-sgRNA-R对RsPDS基因进行PCR扩增和测序。（e，f）白化芽中RsPDS两个靶位点突变类型的基因组DNA测序分析。

作者成功地探索了一种经济、高效的萝卜遗传转化方法，通过发根农杆菌介导的转化，借助Wus2-ipt组合和可视化的RUBY报告基因，不需要任何外部激素补充来进行芽再生，并且可以提高萝卜的遗传转化效率。在不到4个月的时间里实现了29.21-40.00%的转化效率。此外，该策略还可以通过CRISPR/Cas9基因组编辑轻松用于在T0代中生成目标基因的敲除突变体。这些发现有可能广泛应用于其他蔬菜物种的遗传转化和基因组编辑遗传改良。