Sci Adv | RNA m6A去甲基化酶AtALKBH9B促进拟南芥中热激活的长末端重复逆转录转座子的移动

2023年，中国科学院分子卓越中心研究团队在期刊SCIENCE ADVANCES上发表了一篇题为m⁶A RNA demethylase AtALKBH9B promotes mobilization of a heat-activated long terminal repeat retrotransposon in Arabidopsis的研究论文。作者通过热处理前后的公共数据库发现AtALKBH9B与Onsen存在潜在的关系，通过创制转基因植株后进行m⁶A-PIR-qPCR、线性染色体外DNA（ALE）-qPCR以及液滴数字PCR等一系列实验手段，作者认为转座子RNA标记的m⁶A RNA甲基化，并可以定位在应激颗粒（SGs），并且SG定位的AtALKBH9B选择性地使热激活的逆转录因子Onsen去甲基化，从而将其从空间限制中释放出来，使其活动化。此外，作者还发现m⁶A RNA甲基化有助于通过抑制病毒样颗粒组装和染色体外DNA的产生来抑制转座。总之，这项研究揭示了一个以前未知的作用m⁶A在抑制转座子的流动性，并提供了深入了解转座子与m⁶A甲基化的关联有很大的作用价值。

转座子（TE）是可以从一个地方移动到另一个地方的DNA分子，广泛存在于大多数真核生物的基因组中。由于它们对宿主基因组的潜在不利影响，大多数转座子被表观遗传机制强烈抑制，尽管这样，但它们可以被环境挑战激活，从而带来遗传多样性和进化的适应性变化。之前有研究报道拟南芥中一种名为Onsen的Ty1/Copia样逆转录转座子可以通过热应激被转录激活，并赋予位于插入位置下游的基因热响应性。也有很多研究证明DNA甲基化在转录水平上对Onsen的抑制，但在转录后水平上对Onsen RNA的调节还没有被广泛研究。转录后RNA修饰已成为与多种RNA加工相关的关键调节标记，而甲基化修饰是RNA的主要修饰之一，在真核生物mRNA中，N⁶-甲基腺苷(m⁶A)是最丰富的甲基化修饰形式，参与mRNA稳定性、剪接、翻译效率、核质输出等各种mRNA代谢过程，并最终调控植物生长发育及胁迫响应。m⁶A是一种动态可逆的转录后修饰，其与m⁶A甲基转移酶(Writer)、去甲基化酶(Eraser)和m⁶A结合蛋白(Reader)协同作用。有研究表明AtALKBH9B调节苜蓿花叶病毒。AtALKBH9B与应激颗粒（SG）和细胞质siRNA体标记物共定位，可能意味着与RNA介导的表观遗传沉默或RNA降解途径的功能相关。鉴于逆转录病毒和逆转录转座子之间复制周期的相似性，TE也可能受到RNA甲基化介导的控制;然而，尚未在植物中探索通过m⁶A RNA修饰的转座子调节。在这项工作中，作者研究了m⁶ARNA修饰在拟南芥转座子抑制控制中的作用，这涉及TE RNA在SGs中的定位。并且也发现一种称为Onsen的特异性逆转录元件通过利用宿主编码的RNA去甲基化酶绕过了这种m⁶A介导的抑制。

1.Onsen RNA是m⁶A修饰的

为了测试m⁶A RNA修饰是否在转座子调节中起作用，作者分析了从热处理3小时之前和之后收获的拟南芥花芽中产生的m⁶A-RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）数据的公共数据集。图1A显示了在转录区域m⁶A主要富集在终止密码子附近，作者鉴定了近2000个在热应激条件下特异性地存在的甲基化RNA（图1B），并发现这些转录物在转座子中显著地过量表达（图1C）。此外，作者对图1A中使用的相同样本生成的公共RNA-seq数据集的分析也显示，转座子（TE）包含更多具有高m⁶A峰数的转录本，包括被称为Onsen的逆转录转座子家族（图1D）。这些数据共同表明TE RNA被m⁶A RNA甲基化修饰得更强，部分提示m⁶A RNA修饰可能参与了转座子的转录后抑制。Onsen是一种热激活的逆转录转座子，产生染色体外线性DNA（eclDNA）。Onsen沿着其RNA显示出高水平的m⁶A，最突出的峰靠近起始密码子（图1E）。为了验证Onsen RNA的m⁶A RNA修饰，作者还使用从热应激24小时的Col-0幼苗提取的RNA进行了纳米孔直接RNA测序（ONT-DRS）实验，结果表明Onsen RNA中存在m⁶A RNA修饰（图1E）。之后作者通过qPCR进一步证实了24小时热应激Col-0幼苗中Onsen的m⁶A水平，并且在区域B和C中检测到了强烈的m⁶A富集（图1G），这与图1E一致。总之，热激活的转座子Onsen被m⁶A RNA甲基化强烈地标记。

图1. Onsen RNA是m⁶A修饰的。(A)m⁶A RNA修饰在5’-UTR、CDS和3’-UTR中的分布。HS，热强制降解样品（3小时）; CS，对照样品。(B)CS和HS中含有m⁶A的转录物重叠。(C)（B）中列出了每种类别中的转座子的分数。(D)具有m⁶A RNA修饰的基因（n = 15413）和转座子（n = 57）的分数。(E)显示Onsen基因座的m⁶A-RIP-seq和通过ONT-DRS检测到的m⁶A位点。(F)m⁶A富集的火山图。(G)qPCR验证m⁶A富集。

2.AtALKBH9B是一种调节Onsen的m⁶A RNA去甲基化酶

作者使用从用3或24小时热应激处理的野生型拟南芥植物RNA-seq数据集，分析所有已知的m⁶A调节剂在热处理下的表达模式，发现大多数编码m⁶A writers、erasers和readers的基因在热应激时上调，在这些基因中，作者专注于与调节病毒RNA有关的AtALKBH9B。由于TE RNA与病毒RNA有几个共同的细胞特征，作者假设AtALKBH9B也可能调节Onsen RNA。通过对AtALKBH9B进行热处理，作者发现AtALKBH9B和Onsen的表达模式相似，显示出相当缓慢的增加，并在热应激后24小时达到峰值（图S3）。为了测试AtALKBH9B是否参与Onsen RNA调节，作者获得了T-DNA插入突变体atalkbh9b-1，并使用CRISPR-Cas9系统产生了缺失突变体atalkbh9b-2（图2A）。在热应激下，Onsen的RNA水平在两种突变体中均强烈上调（图2B），并且在热应激的atalkbh9b-1突变体产生的RNA-seq数据中也观察到类似的模式（图2C）。之后作者在atalkbh9b-1突变体中表达了绿色荧光蛋白（GFP）标记的AtALKBH9B，并且能够检测到Onsen RNA对WT水平的抑制（图2D）。作者接下来使用热应激WT和atalkbh9b-1突变体幼苗进行m⁶A-RIP-qPCR实验。发现atalkbh9b-1突变体中Onsen RNA的m⁶A水平显著升高（图2E），这表明AtALKBH9B可能导致Onsen RNA的去甲基化。为了确定AtALKBH9B是否是Onsen RNA的直接调节因子，作者使用pAtALKBH9B：：AtALKBH9B-GFP转基因系进行RIP-qPCR实验。图2F显示了大量AtALKBH9B-GFP富集到Onsen RNA，但不能观察到非甲基化RNA中的任何结合富集。总之，这些表明AtALKBH9B是一种直接靶向Onsen RNA的RNA去甲基化酶。

图2. AtALKBH9B通过直接与Onsen的转录物结合来调节Onsen。(A)AtALKBH9B的转基因结构。(B)通过RT-qPCR测定atalkbh9b突变体中的Onsen RNA水平。(C)显示Onsen基因座的atalkbh9b-1的RNA序列。(D)用于atalkbh9b-1突变体与pAtALKBH9B：：AtALKBH9B-GFP构建体的互补试验的RT-qPCR。 (E)在热胁迫WT、atalkbh9b-1突变体和突变体互补系中进行的m⁶A-RIP-qPCR。(F)使用（D）中所用的pAtALKBH9B：：AtALKBH9B-GFP转基因植物的RIP-qPCR实验。

图S3. 热应激下Onsen和AtALKBH9B基因表达动力学。（A和B） Onsen (A)和AtALKBH9B (B)的RT-qPCR表达谱不同时间的热应激处理。

3.AtALKBH9B的缺失导致Onsen转座子减少

因为Onsen的RNA水平在atALKBH9B突变体中增加，作者猜测转座活性在atALKBH9B突变体中也会增加。为了直接确定Onsen迁移率，作者首先进行了线性染色体外DNA（ALE）-qPCR实验的扩增，发现Onsen的eclDNA水平在atalkbh9b-1突变体中显著降低（图3A）。在检测热应激atalkbh9b-1突变体中Onsen的总DNA水平的实验中也观察到类似的结果（图3B）。之后作者进行了液滴数字PCR（ddPCR）实验以定量测定Onsen逆转录元件的拷贝数以确定Onsen在atalkbh9b-1突变体中的插入活性。由于在WT背景下几乎检测不到Onsen的动员，因此将植物生长在能增强Onsen逆转录转座活性的含有α-鹅膏蕈碱的培养基上。然后作者使热胁迫后存活的植物生长至成熟，并从个体植物收集种子。在没有热胁迫处理的情况下对下一代植物进行ddPCR以评估Onsen的基因组拷贝。如图3C所示，atalkbh9b-1突变体比WT产生更少的新Onsen拷贝。然后，作者测试了在nrpd1a-3突变体背景中引入的atalkbh9b-1突变体，也产生上述类似结果，则ddPCR数据揭示AtALKBH9B缺失导致逆转录转座活性降低（图3D）。这些数据表明，AtALKBH9B是Onsen动员所必需的。

图3. Onsen的逆转录转座活性在atALKBH9B-1中降低。（A和B）atALKBH9B-1突变体中Onsen的eclDNA（A）和总DNA（B）水平。（C和D）在经受热应激处理的WT（n = 20）和atALKBH9B-1（n = 19）（C）以及nrpd 1a-3（n = 10）和nrpd 1a-3 atALKBH9B-1双突变体（n = 10）（D）的后代中Onsen的拷贝数。

4.AtALKBH9B和m⁶A甲基化RNA在热激下定位于SG

上述结果表明atalkbh9b突变体表现出与不同Onsen中间体相反的模式，即，增加RNA和减少DNA水平。作者推测这种差异可能是由RNA螯合抑制RNA转化为DNA中间体引起的。先前在人类中的研究证明甲基化RNA与SG的强关联，所以作者假设atalkbh9b中的高甲基化Onsen RNA可能位于SG中，并且被排除在eclDNA产生的地方。为了验证这一假设，作者在烟草叶片中表达AtALKBH9B-GFP，其中SGS 3-TdTomato作为SG标记。如图4A所示，在热应激下形成SG的细胞质病灶，并且AtALKBH9B GFP与SGS 3-TdTomato共定位。在表达AtALKBH9B-GFP和SGS 3-TdTomato的双转基因拟南芥植物中进一步检查AtALKBH9B与SGs的关联。结果与图4A一致（图4，B和C）。作者通过使用表达AtALKBH9B-GFP的拟南芥转基因植物进行免疫沉淀（IP）/质谱（MS）实验进一步研究了AtALKBH9B的相互作用组，鉴定出许多以前称为SG组分的蛋白质（图4D）。在这些蛋白中选择ECT 2用于进一步测试其与AtALKBH9B的相互作用以及SG标志物蛋白UBP 1b和PAB 2与9 B的相互作用，作者通过在烟草叶片中进行了裂解荧光素酶测定实验观察到AtALKBH9B和ECT 2之间显著的蛋白质-蛋白质相互作用和AtALKBH9B和SG标志物蛋白之间的相互作用（图4 E、图S8）。总体而言，AtALKBH9B定位于SG，并与多个SG组件相互作用。

作者接下来研究了m⁶A-甲基化的RNA是否优选地定位于拟南芥中的SG。使用从热应激atalkbh9b-1突变体的SG级分提取的RNA，用m⁶A抗体进行RNA斑点印迹实验（图S9），结果发现与总RNA相比，SG RNA显示出更高水平的m⁶A RNA修饰（图5，A和B）。作者还使用来源于热应激WT和atalkbh9b-1突变体的总RNA和SG RNA进行RNA-seq，发现SG富集的RNA含有比总RNA更高数量的m⁶A峰（图5C）。为了直接检测富含SG的转录物中的m⁶A RNA修饰，作者进行了ONT-DRS实验。图5D显示与SG强相关的转录物在SG级分中表现出更高水平的m⁶A RNA甲基化。然后作者从图5C所示的RNA-seq数据中鉴定了atalkbh9b-1中上调的转录物，并比较了它们的SG富集。当与随机选择的RNA相比时，AtALKBH9B调节的转录物显示更强的SG富集（图5E）。对于atalkbh9b-1中高甲基化的转录物也观察到更强SG富集的类似结果（图5 F）。作者还比较了WT和atalkbh9b中高甲基化转录物的SG富集，观察到atalkbh9b-1突变体中SG富集的显著增加（图5G）。图5H显示atalkbh9b-1突变体中Onsen RNA的SG富集增加，这部分表明AtALKBH9B蛋白和m⁶A-甲基化的转录本在热应激下定位于细胞质SG中。

图4.热激下的AtALKBH9B定位于SG。(A)烟草中AtALKBH9B-GFP和SGS 3-TdTomato共定位。（B和C）AtALKBH9B-GFP和SGS 3-TdTomato在经受热胁迫12小时的拟南芥双转基因植物中的共定位。(D)IP/MS显示AtALKBH9B的相互作用组。(E) 裂解荧光素酶确定AtALKBH9B和ECT 2的相互作用。

图5. m⁶A修饰的RNA的SG富集。(A)总RNA和富含SG的RNA中m⁶A RNA修饰的RNA斑点印迹分析。 (B)定量（A）所示印迹的信号强度。(C)总转录物和富含SG的转录物中m⁶A峰的数量。(D)通过ONT-DRS检测到的富含SG的转录物的m⁶A水平。（E到G）在（E）中，与随机选择的转录物（n = 217）相比，atalkbh9b-1中上调的转录物的SG富集的累积分布。在（F）中，SG富集atalkbh9b-1中高度甲基化的转录物。在（G）中，比较了WT和atalkbh9b-1之间的SG富集评分。 (H)通过qPCR测定atalkbh9b-1突变体中Onsen RNA的SG富集。

图S9. 斑点印记检测SG富集蛋白

5.m⁶A抑制VLP组装和eclDNA产生

前面作者已经证明m⁶A-甲基化的Onsen RNA定位于SGs中，AtALKBH9B使其去甲基化，从而使其动员。然而，重要的是要注意Onsen的新插入在WT背景中几乎不可检测。因此，作者假设RNA m⁶A修饰对Onsen逆转录转座的额外抑制作用，而不是RNA螯合到SG。由于整合前DNA中间体的产生发生在病毒样颗粒（VLP）中，并且模板RNA和逆转录元件编码的Gag蛋白之间的物理相互作用是其第一步，所以作者测试了RNA的甲基化状态是否影响Gag与RNA的亲和力。作者使用序列相同但m⁶A甲基化状态不同的RNA寡核苷酸进行荧光偏振测定以确定Gag的体外结合活性。与未甲基化的RNA相比，m⁶A修饰的RNA表现出增加的解离常数（Kd）值（图6A），表明m⁶A抑制与Gag的结合。作者又通过使用表达Gag-GFP的转基因拟南芥植物进行RIP-qPCR实验进一步检查了Gag和Onsen RNA的相互作用（图S12）。Gag-GFP显示出对Onsen RNA的强结合富集;然而，当Gag-GFP在atalkbh9b-1突变体背景中表达时，结合富集显著降低（图6B）。此外，作者还推测m⁶A RNA甲基化可能会干扰逆转录过程。为了测试这种可能性，作者在存在或不存在m⁶A底物的情况下体外转录部分Onsen RNA，并进行RT反应，发现m⁶A修饰的RNA显示出更高的定量循环（Cq）值（图S13），这表明RNA甲基化抑制cDNA产生。总之，这些数据表明m⁶A RNA甲基化通过抑制VLP组装和eclDNA产生而有助于逆转录转座抑制。

图6. m⁶A RNA甲基化抑制Gag在体外和体内的结合。(A)Onsen编码的纯化Gag蛋白的荧光偏振分析。(B)Gag-GFP结合Onsen转录物的RIP-qPCR。

图S12. Gag-GFP转基因植物的共聚焦显微镜图像。

图S13. m⁶A修饰RNA的逆转录效率。

综上所述，m⁶A修饰的Onsen RNA定位于SG。AtALKBH9B去甲基化并将Onsen RNA释放出SG。去甲基化的Onsen RNA通过与Gag相互作用组装成VLP，并被逆转录形成eclDNA。在AtALKBH9B突变体中，Onsen RNA被高度甲基化并定位于SG中。此外，RNA甲基化抑制Gag和RT的结合。

图7:AtALKBH9B促进拟南芥中热激活的长末端重复逆转录转座子移动的模式图

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