2024年3月，北京大学和中国农业科学院的研究团队联合在期刊Plant Biotechnology Journal发表了一篇题为OsALKBH9-mediated m6A
demethylation regulates tapetal PCD and pollen exine accumulation in rice的研究论文。作者利用m6A-seq、RNA-seq和转基因材料创制的研究手段，发现OsALKBH9功能的丧失导致雄性不育、延迟的绒毡层降解和花粉外壁的过度积累，并寻找到OsALKBH9进行去甲基化的靶基因，这些发现提供了关于m6A修饰在控制水稻育性方面的重要作用的有价值的信息，并提供了有助于杂交育种的雄性不育材料。![]()
=== 研究背景 ===
甲基化修饰是RNA的主要修饰之一，在真核生物mRNA中，N6-甲基腺苷 (m6A) 是最丰富的甲基化修饰形式，参与mRNA稳定性、剪接、翻译效率、核质输出等各种mRNA代谢过程，并最终调控植物生长发育及胁迫响应。m6A是一种动态可逆的转录后修饰，其与m6A甲基转移酶 (Writer)、去甲基化酶 (Eraser)和m6A结合蛋白 (Reader) 协同作用。在水稻中，已有研究表明雄性育性显著地受到mRNA m6A
Writer的影响，敲除m6A甲基转移酶复合物的核心成分OsFIP37导致液泡化花粉阶段小孢子的异常减数分裂和早期退化，而m6A
Eraser作为m6A修饰的可逆部分，在水稻中的研究较少，很多分子机制尚不清楚。# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1. 敲除OsALKBH9基因导致水稻雄性不育
为了鉴定mRNA m6A去甲基化酶并探索其在水稻中的功能，作者对哺乳动物m6A去甲基化酶ALKBH5的同源物进行了搜索，并将预测为推定m6A去甲基酶的两种蛋白质分别命名为OsALKBH9和OsALKBH10。利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，获得了Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的两种突变体（图1a）。尽管两种突变体均表现出正常的营养生长，但它们不能产生种子（图1b、c、f）。作者在Osalkbh9-1和野生型（WT）植物之间进行相互异花授粉，结果显示，所有WT胚珠均不能被Osalkbh9-1花粉粒受精，而Osalkbh9-1的胚珠可被WT花粉粒受精（图1f），这表明Osalkbh9突变体中缺乏种子是由于有缺陷的花粉粒。与野生型相比，两个突变体的花药均未充满并变得苍白（图1d），花粉粒皱缩且缺乏淀粉内含物（图1e），表明Osalkbh9突变体雄性不育。为了测试Osalkbh9突变的遗传作用，作者计算了不育植株与可育植株的比率，并确定了杂合突变体（CRISPR/Cas9
T-DNA游离）的近交后代OsALKBH9/OsALKBH9（WT）：OsALKBH9/Osalkbh9-1（杂合子）和Osalkbh9-1/Osalkbh9-1（纯合子）的三种基因型，以1：2：1的比例分离，雄性育性与雄性不育性的表型比例为3：1，基因型和表型之间共分离。这些结果表明，Osalkbh9突变以隐性孢子体方式起作用。之后作者进行了基因互补实验，以进一步证实OsALKBH9在花粉发育中的功能。作者用OsALKBH9pro∷OsALKBH9CDS-FLAG的构建体转化Osalkbh9-1/Osalkbh9-1愈伤组织，在互补系的T0代中，结实率和花粉活性大部分恢复（图1g，h），证实Osalkbh9突变体的雄性不育表型是由OsALKBH9的功能丧失引起的。
2. OsALKBH9在雄性育性中的调节依赖于其m6A去甲基化酶活性为了验证OsALKBH9是否具有mRNA m6A去甲基化酶的功能，作者在大肠杆菌中表达OsALKBH9-His的融合蛋白。通过高通量液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析，结果表明，OsALKBH9在体外去除了合成ssRNA或水稻mRNA中约50%的m6A（图1 i-k），证明了其在体外的RNA m6A去甲基化活性。作者还观察到Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的14天幼苗中m6A修饰mRNA水平比野生型增加（图1 l），证实了水稻中OsALKBH9的体内m6A去甲基化活性。为了确定OsALKBH9对雄性生育力的调节是否依赖于其推定的RNA去甲基化酶活性，作者使用OsALKBH9pro ∷ OsALKBH9CDSmut-FLAG（H324A/D326A）构建体进行了互补实验，该构建体由催化失活的OsALKBH9编码序列组成，作者获得了20个独立的转基因系，但它们中没有一个表现出结实率或花粉育性的任何恢复（图1g，h）。这些结果表明Osalkbh9突变体的雄性不育表型与OsALKBH9的RNA去甲基化酶活性受损直接相关。![]()
图1.OsALKBH9对雄性生育力的调节取决于其m6A去甲基化酶活性。(a)CRISPR/Cas9介导OsALKBH9的靶向突变。上图显示了OsALKBH9基因组区域和箭头所示的两个CRISPR/Cas9靶位点。(b)野生型、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2突变体植株抽穗后的表型。(c)成熟期WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2穗的比较。(d)野生型、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2植物的小穗。（e）用I2/KI溶液染色的WT、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2的花粉粒。(f)将突变体与野生型植株杂交（n = 10株），测定其结实率。(g-h)研究了基因互补植株和去甲基酶失活互补植株（n = 3）的结实率（g）和花粉粒I2/KI溶液（h）。分别给出了遗传互补植物和去甲基酶无活性互补植物的两个代表性品系的结果。(i-k)重组OsALKBH9蛋白在体外将从水稻中提取的含m6A的ssRNA9和polyA+RNA中的m6A修饰去甲基化。(i)体外脱甲基酶活性反应的消化底物的LC-MS/MS色谱图。在体外去甲基酶活性反应后，使用ssRNA（j）和polyA+RNA（k）作为底物的（j，k）m6A变化。(l)通过LC-MS/MS测定从野生型、Osalkbh9-1和Osalkbh9-2植株茎干中的mRNA中m6A相对于腺苷的百分比（m6A/A比率）。3. OsALKBH9是绒毡层PCD和花粉外壁积累所必需的为了研究Osalkbh9-1基因在雄性生殖发育过程中的细胞异常，作者对不同发育时期的花药横切面进行了观察。结果显示，在第9阶段，WT的绒毡层被浓缩，形成薄的细胞层，而Osalkbh9-1的绒毡层保持较大（图2a）。在第10阶段，WT中的绒毡层变得更加浓缩、降解和变薄，并且小孢子经历空泡化（图2a）。相反，在Osalkbh9-1中，绒毡层细胞的降解是异常的，一些细胞保持未降解，并且小孢子呈现不规则形状（图2a）。在第11阶段，WT花药的绒毡层中仅留下少量降解残留物，小孢子液泡扩大（图2a）。然而，仍有未降解的绒毡层细胞，并且在Osalkbh9-1中所有的小孢子都败育（图2a）。作者利用透射电子显微镜（TEM）研究了Osalkbh9-1绒毡层和小孢子的发育缺陷，发现在第11阶段，完整的绒毡层细胞在0salkbh9-1中仍然是明显的，这与横截面相证实（图2b）。从第10阶段到第11阶段，Osalkbh9-1和WT小孢子都被由顶盖和连接层组成的双层外壁包围（图2b）;然而，Osalkbh9-1的外壁比WT的外壁厚（图2b）。在第11阶段，0salkbh9-1的外壁图案由于异常顶盖积累而变得不规则（图2b）。这些结果表明OsALKBH9对于花粉外壁积累和适当的图案化都是必需的。为了研究Osalkbh9-1花药中受干扰的PCD，进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）测定，结果显示，阶段8a在WT的绒毡层中观察到强的TUNEL信号并持续到阶段9，而在阶段8a和阶段8b检测到Osalkbh9-1中的TUNEL信号都比WT的那些弱（图2c），表明Osalkbh9-1中绒毡层细胞的降解不充分（图2c）。另外，在Osalkbh9-1突变体中从第9阶段至第11阶段的小孢子显示TUNEL信号（图2c）。这些结果表明Osalkbh9-1中存在绒毡层PCD和小孢子发育异常，进一步证实了OsALKBH9在绒毡层PCD、小孢子发育以及小孢子/花粉外壁积累和图案形成中的关键作用。![]()
图2.OsALKBH9基因敲除导致绒毡层细胞延迟降解和花粉壁图案异常。(a)野生型和Osalkbh9-1突变体中第7阶段至第11阶段花药的半薄切片。(b)野生型和Osalkbh9-1花药从第8阶段至第11阶段的透射电子显微照片。(c)WT和Osalkbh9-1花药在第7阶段至第11阶段的TUNEL分析。碘化丙啶染色用红色荧光表示，TUNEL阳性染色用黄色至绿色荧光表示。E为表皮; En，药室内壁; T为绒毡层; PMC，花粉母细胞; MC，减数分裂细胞; Msp，小孢子; dMsp，败育小孢子; Tds为四分体; Dy，二分体细胞; FL，足层; Te顶盖。4. OsALKBH9在花药中高表达，主要定位于细胞质中
为了研究OsALKBH9的表达模式，作者通过qRT-PCR检测了其在不同组织中的转录水平。结果显示，OsALKBH9在9 - 10期和11 - 12期的花药中高度表达（图3a）。并且进一步通过OsALKBH9pro::GUS（β-葡萄糖醛酸糖苷酶）转基因植物和RNA原位杂交检测OsALKBH9的表达模式。GUS染色显示OsALKBH9在第8期至第10期的花药中高度表达（图3b）。原位杂交结果表明，OsALKBH9转录物在绒毡层细胞（S8a、S8b和S9）、减数分裂细胞（S8a和S8b）和小孢子（S9）中高度表达（图3d）。为了确定OsALKBH9的亚细胞定位，作者通过农杆菌浸润法在N.
benthamiana叶子上，观察显微镜OsALKBH9-GFP表现出点状细胞质分布模式（图S4），之后作者又分离Osalkbh9-1OsALKBH9pro∷OsALKBH9CDS-FLAG的细胞质和细胞核组分并通过蛋白印迹法确定其位置，进一步证实了OsALKBH9的细胞质定位。结果表明，几乎所有OsALKBH9蛋白均定位于细胞质中（图3c）。因为有研究发现AtALKBH9B与DCP1和SGS3共定位，它们是P-小体和siRNA-小体的标记蛋白。因此，作者检查了OsALKBH9是否与DCP1和SGS3共定位，结果显示OsALKBH9与SGS3共定位，但不与DCP1共定位（图3e）。由于siRNA体通常与应激颗粒（SG）共定位，提示OsALKBH9的功能可能与siRNA体和/或应激颗粒有关。![]()
图3. .OsALKBH
9在花药中高表达，OsALKBH 9主要定位于细胞质中。 (a)通过RT-qPCR分析OsALKBH9在不同组织中的表达。 (b)含有0sALKBH9pro::GUS的转基因花药的GUS染色。箭头指向具有强GUS信号的花药。 (c)亚细胞级分和免疫印迹测定。对来自Osalkbh9-1
OsALKBH9pro::OsALKBH9CDS-FLAG转化体的总蛋白、细胞质和核富集级分进行SDS-PAGE。UGPase和组蛋白H3分别用作细胞质和细胞核标记物。(d)野生型花药中OsALKBH9转录物的原位杂交。 T，绒毡层; PMC，花粉母细胞; MC，减数分裂细胞; Msp，小孢子。(e)OsALKBH9在N.benthamiana叶表皮细胞。箭头指向OsALKBH9-mCherry和SGS3-eGFP的共定位灶（上图）以及OsALKBH9-eGFP和DCP1-mCherry的非共定位灶（下图）。![]()
S4. OsALKBH9-eGFP在N.
Benthamiana叶子表皮的亚细胞定位图。
5.OsALKBH9缺失会影响雄性生殖发育和外壁积累相关基因的表达
作者通过RNA-seq比较了Osalkbh9-1和WT之间第7阶段至第8阶段和第9阶段至第10阶段花药的基因表达谱去评估该基因对雄性生殖发育的影响。分析表明，在第7-8期花药中有2606个基因表达差异（1195个上调，1411个下调），在第9-10期花药中有6316个基因表达差异（3860个上调，2456个下调），接着作者比较了第7阶段至第8阶段和第9阶段至第10阶段中共上调和共下调的基因，揭示了985个共差异表达的基因（655个上调和330个下调）（图4a）。GO分析显示，上调的基因主要与孢粉素生物合成、花粉发育和花粉外壁形成相关，而下调的基因与碳水化合物代谢和生长素反应相关（图4b）。作者又进一步利用qRT-PCR检测与绒毡层发育和孢粉素合成/转运途径相关的基因表达（图4c;表S2）。结果表明，在Osalkbh9-1中，TFs TDF1、TDR、EAT1、MS188和PTC1在第7期至第8期和第9期至第10期均上调，并且在第9期至第10期上调了GAMYB（图4c）。此外，孢粉素合成和转运基因CYP703A3、CYP704A4、PKS2和ABCG15也在两个阶段上调（图4c）。这些结果表明，Osalkbh9-1中与小孢子孢粉素积累相关的基因表达增加可能是该突变体花粉外壁过度积累的原因。图4. . OsALKBH9影响雄性生殖发育和外壁积累相关基因的表达。 (a)描绘在阶段7至阶段8和阶段9至阶段10的差异表达基因（DEGs，Osalkbh9-1/WT）的维恩图。(b)在第7至第8阶段和第9至第10阶段共上调和共下调基因的基因本体分析。左侧部分表示共上调的基因，而右侧部分表示共下调的基因。CC，细胞成分; BP，生物过程; MF，分子功能。 (c)qRT-PCR检测绒毡层发育和花粉壁积累所需的基因。使用UBQ作为内部对照。6.OsALKBH9缺失导致转录组范围内的m6A高甲基化
作者通过Osalkbh9-1和WT的第9阶段至第10阶段的花药进行m6A-seq分析揭示了对应于Osalkbh9-1突变体中5968个基因的6551个高甲基化m6A峰和对应于548个基因的563个低甲基化峰（图5a）。比较WT和Osalkbh9-1之间的m6A富集,发现Osalkbh9-1中的m6A富集显著高于WT（图5b），表明OsALKBH9缺失导致m6A的超甲基化。对多基因谱的分析揭示了转录物3’-UTR）中高度富集的超甲基化m6A峰（图5c）。在超甲基化m6A峰中观察到的富集m6A基序（UGHAC和GWAACU）与先前报道的RRACH基序一致（图5f）。作者接下来研究了由OsALKBH9缺失引起的m6A水平改变是否影响基因表达。对具有非甲基化、未改变的甲基化和高甲基化峰的基因中的转录物积累的分析表明，具有高甲基化峰的基因比没有高甲基化峰的基因更可能被上调（图5d）。GO分析显示，超甲基化基因主要与激素反应、光形态发生的调节、脂质生物合成和mRNA聚腺苷酸化相关（图5e）。m6A-seq和RNA-seq数据的联合分析鉴定了865个上调和499个下调的含有高甲基化峰的基因，以及35个上调和131个下调的具有低m6A甲基化的基因（图S8a）。GO分析表明，高甲基化和上调的基因在诸如转录的正调控、信号转导和转录共激活因子活性的途径中富集，而高甲基化和下调的基因在碳水化合物代谢过程和碳水化合物磷酸化中富集（图S8b）。总的来说，OsALKBH9缺失导致转录组范围内的m6A超甲基化。![]()
图5. . OsALKBH9功能丧失导致转录组范围的m6A超甲基化。 (a)火山图的结果显示了Osalkbh9-1和WT之间m6A修饰的变化。(b)累积分数和箱形图的结果显示了Osalkbh9-1和WT中m6A峰的log 2（富集倍数）。.(c)元图和雷达图的结果表示Osalkbh9-1中鉴定的m6A超甲基化峰在指定mRNA区段中的分布。(d)累积分数和箱形图说明了Osalkbh9-1/WT中高甲基化、无变化甲基化和低甲基化峰的基因表达模式。.(e)对出现高甲基化峰的基因进行GO分析。(f)通过使用HOMER基于前1000个峰鉴定OsALKBH9依赖性基序。7.OsALKBH9缺失导致TDR和GAMYB转录物中的m6A高甲基化
作者在Osalkbh9-1中的TDR的外显子和GAMYB的3’-UTR中观察到更高的m6A峰，这两者都参与绒毡层和花粉外壁发育（图6a）。之后作者使用第9阶段至第10阶段的花药进行m6A-IP-qPCR，证实了WT相比，TDR和GAMYB mRNA在Osalkbh9-1中确实是m6A高甲基化的（图6b）。为了验证TDR和GAMYB mRNA作为OsALKBH9的直接靶标，作者在来自Osalkbh9-1
OsALKBH9pro::OsALKBH 9-FLAG的花药中进行RNA免疫沉淀，然后用抗FLAG抗体进行RT-qPCR（RIP-RT-qPCR）。结果证实了OsALKBH9与TDR和GAMYB mRNA的直接结合（图6c）。由于mRNA m6A修饰已显示在拟南芥和人类中促进mRNA稳定化，因此作者在花药中使用放线菌素D评估了TDR和GAMYB转录物的mRNA稳定性。结果显示，TDR和GAMYB转录物在Osalkbh9-1中比在WT中更稳定（图6d），证实了m6A修饰介导水稻中的mRNA稳定。总的来说，这些结果表明，OsALKBH9的缺失增加了TDR和GAMYB转录物中的m6A水平，这促进了mRNA稳定化并激活了绒毡层发育、孢粉素合成和运输的下游基因表达，从而导致花粉外壁的过度积累。![]()
图6. . OsALKBH9依赖性m6A去甲基化调控花粉外壁积累。(a)TDR和GAMYB的相对m6A值。 (b)m6A-IP-qPCR结果显示了WT和Osalkbh9-1的9-10期花药中的相对m6A水平。(c)在Osalkbh9-1 OsALKBH pro ∷ OsALKBH9CDS-FLAG小穗（第7至第12阶段的花药）中的RIP-qPCR分析显示OsALKBH9直接结合TDR和GAMYB转录物。(d)TDR和GAMYB在WT和Osalkbh9-1小穗（7 - 12期花药）中的mRNA寿命=== 总结 ===
综上所述，作者提出了一种OsALKBH9调节花粉外壁积累的新途径。在野生型中，OsALKBH9去除了TDR和GAMYB转录物上的m6A，降低了它们的mRNA稳定性，并确保了花粉外壁的适当积累。在Osalkbh9-1中，TDR和GAMYB转录本的m6A高度甲基化，促进了其mRNA的稳定性，激活了参与花粉外壁积累的基因的表达，导致花粉外壁的过度积累和异常外壁模式。![]()
图7: 水稻OsALKBH9调节花粉外壁积累的模式图
期刊：Plant Biotechnology Journal------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
～ The End! ～
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