2019年10月中国科学院青岛生物能源与过程研究所周功克团队（现青岛农业大学）在高水平期刊New Phytologist上发表了题为Dual regulation of xylem formation by an
auxin-mediated PaC3H17-PaMYB199 module in Populus的论文。作者发现PaC3H17-PaMYB199模块通过重叠通路在控制杨树形成层细胞增殖和次生细胞壁增厚中发挥相反的作用；PaC3H17与PaMYB199相互作用形成复合物，减弱PaMYB199驱动的木质部靶点的抑制；此外，外源生长素增强了形成层分裂过程中对该模块的双重调控，促进了次生细胞壁沉积，为未来木材形成的调控网络相关研究提供新见解。
=== 研究背景 ===
木本物种的次生木质部形成始于形成层细胞的分裂和分化，随后经历一系列细胞成熟事件，包括次生细胞壁(SCW)增厚和细胞程序性死亡。例如PtrMYB2、3、20和21被确定为PtrWND2B和PtrWND6B的直接靶点，并促进杨树SCW增厚。CCCH型锌指蛋白含有3个半胱氨酸残基和1个组氨酸残基，能够结合RNA或DNA靶点，并与其他蛋白相互作用。CCCH蛋白在植物的发育和适应过程中发挥着多种作用，目前已有发现表明MYBs-CCCHs在木本植物和草本植物中控制SCW增厚可能具有进化保守性。同时一系列动物CCCH蛋白已被证明在控制细胞增殖中发挥关键作用，然而，CCCHs在植物的生长发育过程中是否参与细胞分裂尚不清楚。# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1. PaMYB199与PaC3H17相互作用
先前已经证明杨树PaC3H17在控制木质部宽度和茎中SCW增厚方面发挥积极作用。为鉴定PaC3H17相互作用蛋白，对杨树木质部文库进行了Y2H筛选。在已鉴定的阳性克隆中，PaMYB199在茎中高表达，并被选中验证PaMYB199 - PaC3H17的互作。通过基于Y2H的检测，在共表达PaMYB199-BD和PaC3H17-AD的酵母中检测到强烈的报告基因激活(图1a)；Pull-down实验结果显示大量MBP-PaMYB199蛋白结合GST-PaC3H17(图1b)；进一步进行BiFC和Co-IP分析，结果同样证实了PaMYB199和PaC3H17蛋白的特异性相互作用(图1c-d)。![]()
图1 . PaMYB199与PaC3H17相互作用。(a)酵母杂交实验。 (b)Pull-down。 (c)双分子荧光互补实验。(d)共免疫沉淀实验。
2. PaMYB199与PaC3H17主要在木材形成相关组织中表达通过分析qRT-PCR对PaMYB199和PaC3H17在杨树不同组织中的基因表达，显示这两个基因主要在茎中表达(附图a)。RNA-Seq分析显示在杨树茎中这两个基因都表现出双相表达峰，一个表达峰在形成层区，另一个表达峰在发育中的木质部(附图b)；原位杂交实验结果也显示PaMYB199和PaC3H17主要表达于木质部细胞，包括形成层、初生木质部薄壁和发育中的次生木质部细胞(附图c)；作者的定量分析(附图d-e)进一步验证了上述结果。证明PaMYB199和 PaC3H17，可能在木材形成中发挥作用。![]()
附图1. 杨树PaMYB199和PaC3H17的组织表达谱。(a) PaMYB199和PaC3H17在各组织中的qRT-PCR表达分析。 (b) PaMYB199和PaC3H17在次生茎组织中的表达模式。 (c)原位杂交。 (d-e) 激光显微切割及qRT-PCR。
3. PaMYB199与PaC3H17调控木材形成层细胞分裂和次生细胞壁增厚的作用相反作者创制并选择了其中6个PaMYB199表达水平改变最显著的株系进行研究 (图2a)。PaMYB199过表达抑制了植物生长，敲低PaMYB199表达株系则促进植物生长(图2b)。PaMYB199OE的茎长和茎粗被抑制；在PaMYB199CO中则相反 (图2c,d)。同时作者利用RNAi技术创制了抑制PaMYB199表达的株系，结果证实其中PaMYB199的表达水平大幅降低，而PaMYB75(其在杨树中的同源物)的表达水平没有降低。PaMYB199-RNAi表现出与PaMYB199CO相似的茎伸长和基部直径增加的表型。但PaMYB199转基因植株和对照植株之间的节间数量没有显著差异，证明PaMYB199可能在茎部细胞伸长中发挥作用。为了确定PaMYB199表达的改变是否会影响次生生长过程中的木质部发育，作者观察4月龄对照和PaMYB199转基因株系的基茎截面。结果显示PaMYB199OE茎部木质部径向宽度和形成层细胞层数分别减少7%和30%，而PaMYB199CO和PaMYB199-RNAi分别增加了至少15%和27%。此外，PaMYB199OE木质部纤维细胞壁厚度明显变薄而PaMYB199CO增厚(图3e)。TEM定量分析显示PaMYB199OE植物木质部纤维和导管的细胞壁厚度分别减少了21%和18%，PaMYB199CO和PaMYB199-RNAi分别增加了至少15%和14%(图3f,g)。上述结果表明PaMYB199抑制形成层分裂和SCW沉积，这与PaC3H17在这两个过程中的作用相反(已有研究表明PaC3H17正调控木质部宽度和SCW厚度)。
图2. PaMYB199在' 84K '中的过表达和共抑制表型相反。(a)实时荧光定量PCR分析。 (b)三月龄各株系对比。 (c-d) 4月龄茎长和基部直径。
图3 . PaMYB199过表达和共抑制抑制' 84K '木质部发育。(a) 4月龄代表性对照。(b)茎中木质部径向宽度统计分析。 (c-e)茎部木质部纤维、导管形成层和细胞壁厚度。 (f-g) 2月龄茎部木质素纤维(红线)和导管(蓝线)细胞壁厚度透射电镜分析。
4. PaC3H17靶向PaMYB199调控木材形成过程
作者创制了18个基于PaC3H17DR(指含有EAR-motif抑制域(SRDX)的PaC3H17编码区的转基因杨树)的PaMYB199-RNAi株系。通过抑制PaMYB199的表达恢复了PaC3H17DR的生长缺陷。另外PaMYB199-RNAi/PaC3H17DR的生长得到促进，表型与PaMYB199CO或PaMYB199-RNAi相似。二月龄PaMYB199-RNAi/PaC3H17DR植株的茎长和茎粗增加了18%和16%；茎部木质部径向宽度和形成层细胞层数增加了14%和29%(图4a-d)。此外，木质素纤维和导管的细胞壁厚度分别增加了21%和17%(图4e,f)。qRT-PCR结果显示PaMYB199在PaC3H17OE植株中表达被抑制，而在PaC3H17DR植株中表达升高(图4)。ChIP-qPCR结果显示PaC3H17可能与PaMYB199启动子P4片段中的某些元件结合。EMSA结果证明PaC3H17蛋白在体外与PaMYB199启动子的P4片段结合(图4h)。作者通过拟南芥原生质体瞬时表达系统研究了PaC3H17与SRDX序列融合对PaMYB199转录的影响。PaC3H17抑制了叶片原生质体中proPaMYB199:GUS报告基因的活性(图4i)，这与PaC3H17OE植物中PaMYB199的表达一致(图4g)。然而，当将两个效应物(p35S:PaC3H17和p35S:PaC3H17DR)和一个报告基因(proPaMYB199)共转染到原生质体中时，PaC3H17对PaMYB199转录的抑制作用大大减弱(图4i)。作者创制了18个基于PaC3H17DR(指含有EAR-motif抑制域(SRDX)的PaC3H17编码区的转基因杨树)的PaMYB199-RNAi株系。通过抑制PaMYB199的表达恢复了PaC3H17DR的生长缺陷。另外PaMYB199-RNAi/PaC3H17DR的生长得到促进，表型与PaMYB199CO或PaMYB199-RNAi相似。二月龄PaMYB199-RNAi/PaC3H17DR植株的茎长和茎粗增加了18%和16%；茎部木质部径向宽度和形成层细胞层数增加了14%和29%(图4a-d)。此外，木质素纤维和导管的细胞壁厚度分别增加了21%和17%(图4e,f)。qRT-PCR结果显示PaMYB199在PaC3H17OE植株中表达被抑制，而在PaC3H17DR植株中表达升高(图4)。ChIP-qPCR结果显示PaC3H17可能与PaMYB199启动子P4片段中的某些元件结合。EMSA结果证明PaC3H17蛋白在体外与PaMYB199启动子的P4片段结合(图4h)。作者通过拟南芥原生质体瞬时表达系统研究了PaC3H17与SRDX序列融合对PaMYB199转录的影响。PaC3H17抑制了叶片原生质体中proPaMYB199:GUS报告基因的活性(图4i)，这与PaC3H17OE植物中PaMYB199的表达一致(图4g)。然而，当将两个效应物(p35S:PaC3H17和p35S:PaC3H17DR)和一个报告基因(proPaMYB199)共转染到原生质体中时，PaC3H17对PaMYB199转录的抑制作用大大减弱(图4i)。图4 . PaC3H17靶向PaMYB199调控‘nanlin895’木质部发育。(a-b)
2月龄茎切片。(c-d)茎部形成层数。 (e-f)茎中木质素纤维(红线)和导管(蓝线)细胞壁厚度透射电镜分析。(g)实时荧光定量PCR分析茎中表达情况。(h)染色质免疫沉淀-定量PCR分析。(i)转录激活实验。5. PaMYB199和PaC3H17 通过调控木质部相关基因控制木材形成
作者对PaC3H17DR和PaMYB199OE进行转录组学分析。因为两者在杨树茎中表达位置有差异，所以选择中间茎进行取样。分析结果显示，在PaC3H17DR和PaMYB199OE植物中，共有108个共同的DEGs（差异表达基因）与木质部形成有关，包括66个激活基因和42个抑制基因。表明PaC3H17和PaMYB199可能通过相同的途径调节共同的基因来控制木质部的发育。选择PaC3H17DR和PaMYB199OE中10个常见木质部相关的DEGs进行qRT-PCR分析来验证RNA-Seq数据(图5a)。结果显示，3个形成层分裂相关基因(PaCYCD3、PaERF109-1和PaERF109-2)和5个SCW相关基因(PaIRX10、PaIRX15L-1、PaIRX15L-2、PaIRX12L-1和PaIRX12L-2)被PaC3H17激活，而被PaMYB199抑制。这些结果表明PaC3H17-PaMYB199级联可能通过介导这些木质部相关基因来控制木质部的形成。另外，PaXTH3.1和PaXTH23的表达也被PaC3H17和PaMYB199抑制。这两个基因编码可能参与木质部形成过程中初生细胞壁的组装和松弛，这与PaC3H17和PaMYB199的茎长变化一致(图2)。作者为研究PaC3H17-PaMYB199复合体的形成是否影响PaMYB199对驱动靶基因的表达抑制，利用拟南芥叶片原生质体进行了转录激活实验。结果显示共表达p35: PaMYB199-HA和proPaCYCD3、proPaERF109-1、proPaIRX10和proPaIRX15L-1的原生质体GUS活性显著降低(图5f-i)，表明PaMYB199抑制了这四个基因的表达，与图5(a)所示的qRT-PCR结果一致。而当两个效应因子(p35S:FLAG-PaC3H17和p35S:PaMYB199-HA)和一个报告因子(proPaCYCD3、proPacerf109 -1、proPaIRX10和proPaIRX15L-1)共转染到原生质体中时，GUS活性几乎与对照相同。综上结果说明，PaC3H17和PaMYB199之间的相互作用(图1d)减弱了PaMYB199对PaCYCD3、PaERF109-1、PaIRX10和PaIRX15L-1的表达抑制(图5f-i)。说明PaC3H17和PaMYB199可能作为木质部相关的调控模块。![]()
图5 . PaC3H17和PaMYB199调控杨树茎中常见木质部相关基因的表达。(a)实时荧光定量PCR分析差异表达基因。 (b-e)染色质免疫沉淀-定量PCR分析。 (f-i)转录激活实验。
6. PaC3H17-PaMYB199模块响应生长素处理
RNA-Seq数据显示PaC3H17DR和PaMYB199OE植物中多个与生长素相关基因的表达改变，说明PaMYB199和PaC3H17可能与生长素有关。IAA处理显著抑制了PaMYB199的表达，但激活了PaC3H17的表达(图6a)。此外，IAA处理增强了PaC3H17对PaMYB199表达的抑制作用(图6a)。在IAA处理的PaC3H17- FLAG和PaC3H17过表达株系中，PaC3H17与PaMYB199启动子片段P4的结合强度增大(图6b)。说明生长素增强了PaC3H17对PaMYB199的表达抑制。为判断生长素是否影响PaC3H17-PaMYB199的相互作用，作者对FLAG-PaC3H17过表达植株进行Co-IP实验，FLAG-PaC3H17OE中共免疫沉淀的PaMYB199蛋白数量随IAA浓度的增大而增加，但在极性生长素运输抑制剂TIBA处理下，PaMYB199蛋白的数量逐渐减少(图6c)。另外PaC3H17DR相比PaC3H17OE免疫沉淀的PaMYB199蛋白量明显减少(图6d)。此外，IAA处理对PaC3H17DR-PaMYB199的互作没有显著影响(图6d)。综上，生长素促进PaC3H17-PaMYB199复合物在PaC3H17OE中积累。为探究生长素是否通过PaC3H17-PaMYB199模块调控下游基因的表达，作者选择了四个PaMYB199靶基因（PaCYCD3和PaERF109-1，木质部分化相关基因；PaIRX10和PaIRX15L-1，次生细胞壁沉积相关基因），并评估它们在施加外源IAA时的表达情况。结果表明，生长素增强了PaC3H17驱动的这四个基因的表达，同时也促进了PaMYB199驱动的表达抑制(图6e,f)。ChIP分析显示IAA处理促进PaMYB199与四个基因的启动子区域结合(图6g-h)。因此，外源生长素可以促进PaC3H17-PaMYB199模块精细激活PaCYCD3和PaERF109-1的表达，进而促进形成层分裂和SCW增厚。![]()
图6.PaC3H17-PaMYB199模块在杨树茎中调控木质部相关基因表达响应生长素。(a)实时荧光定量PCR (qRT-PCR)。(b)染色质免疫沉淀定量(ChIP-qPCR)。(c)共免疫沉淀(Co-IP)分析显示基于IAA诱导PaC3H17-PaMYB199相互作用。(d) Co-IP结果。 (e-f)
qRT-PCR结果。 (g- h) ChIP-qPCR结果。
7.生长素促进PaC3H17-PaMYB199模块控制木质部发育
为确定生长素是否影响木质部发育，作者分别用IBA处理PaMYB199和PaC3H17转基因植株0、7、15、30和60天。在IBA处理之前，PaMYB199和PaC3H17转基因植株的维管解剖结构与对照几乎相同；生长30天时，只有PaMYB199CO和PaC3H17OE植株的维管束(木质部)明显变宽；60天时，植株茎维管束径向宽度增加了至少21%，而PaMYB199OE和PaC3H17DR植株茎维管束径向宽度减少了至少12.4%(图7a-b)。PaMYB199CO和PaC3H17OE植株的形成层数和木质素纤维、导管的细胞壁厚度增加，而PaMYB199OE和PaC3H17DR植株则对应减少(图7c-f)。IBA处理15天后，转基因植株在茎横向生长中表现不同的生长素敏感性。60天后，PaMYB199CO和PaC3H17OE植株对IBA的响应强于未处理植株，表现为木质部增宽、形成层呈现差异。而PaMYB199OE和PaC3H17DR植株在木质部形成过程中对IBA的敏感性降低(图7)。此外，与用2mg l-1 IBA处理60天的PaMYB199CO植株相比，用5mg l-1IBA处理60 天的植株维管束宽度净增加了至少18%(图7a-b)。表明生长素增强PaC3H17-PaMYB199模块以剂量依赖的方式控制木质部横向生长。![]()
图7. 生长素影响PaC3H17和PaMYB199介导的杨树木质部形成调控。(a-b) PaC3H17和PaMYB199转基因植株及其对照在含有指定浓度的IBA培养基中生长60 d后茎维管束径向宽度。(c-d)植株茎部形成层数。(e-f)茎组织中木质素纤维和血管的细胞壁厚度。
=== 总结 ===
综上作者认为，PaC3H17及其靶标PaMYB199主要在杨树茎的维管形成层和发育中的次生木质部中表达，并通过重叠通路在控制维管形成层细胞分裂和次生细胞壁加厚方面发挥相反的作用。此外，PaC3H17与PaMYB199相互作用形成复合物，减弱了PaMYB199对木质部靶标的抑制作用。外源性生长素的处理增强了PaC3H17-PaMYB199模块在维管形成层分裂过程中的双重调控，从而促进次生细胞壁的沉积。生长素介导的PaC3H17-PaMYB199模块对杨树木质部形成的双重调控代表了一种新的调控机制，增加了未来对木材形成的调控网络的理解。![]()
图8. 生长素介导的双调控杨树木质部形成的PaC3H17-PaMYB199模块模型.
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