PP | 转录因子VvMYB44-1在高温条件下降低葡萄花青素合成

=== 研究背景 ===

=== 研究结果 ===

1. 高温抑制葡萄花青素积累和花青素合成基因的表达

图1：（A-B）高温处理抑制花青素积累（C）高温处理抑制花青素合成基因表达

为了确定响应高温胁迫的候选转录因子，作者通过之前发表的转录组数据，在葡萄叶片中发现了VvMYB44-1的表达在高温时明显被诱导（图2A）。而几个已知的参与苯丙类生物合成的正调控因子，如VvMYBPAR、VvMYBPA1等在高温条件下表达都下调（图2A）。在葡萄果实中，VvMYB44-1在高温胁迫下表达也增加，而花青素合成的正调节因子VvMYBA2和VvMYBA3表达则减少（图2B），这表明VvMYB44-1在高温胁迫下可能是花青素合成的负调控因子。此外，VvMYB44-1的同源物VvMYB44-2在高温条件下的表达量没有明显差异。这些结果表明，VvMYB44-1可能参与调控高温诱导下葡萄花青素的减少。

接下来，作者通过RT-qPCR测定了不同温度条件下葡萄果实中VvMYB44-1和VvMYB44-2的表达量。VvMYB44-1的表达在高温胁迫初期（40℃）被强烈诱导，约6小时达到峰值（图3A）。相比之下，VvMYB44-2在果实高温胁迫中仅表现出轻微的表达增加（图3B）。接下来，作者分别将它们的启动子序列与GUS报告基因融合。组织化学染色和GUS活性分析表明，与正常温度条件相比，VvMYB44-1在高温胁迫下表现出更高的GUS活性（图3C-D），这与观察到的VvMYB44-1在高温胁迫下的表达模式一致。高温胁迫也会诱导VvMYB44-2的启动子活性，但程度低于VvMYB44-1（图3C-D）。因此，VvMYB44-1被选作进一步的研究对象。

组织进化树分析表明，VvMYB44-1和VvMYB44-2与AtMYB44、AtMYB70、AtMYB73和AtMYB77聚类在一起（图3E），成为R2R3-MYB家族的S22亚群。此外，VvMYB44-1与FaMYB44.2的序列相似度最高（图3E）。接下来，作者观察了VvMYB44-1的亚细胞定位。VvMYB44-1-GFP特异性定位于细胞核中（图3F），这与转录因子的典型特征一致。为了测定VvMYB44-1的转录活性，作者通过酵母系统测定发现，pBD-VvMYB44-1酵母细胞和阴性对照生长状况相同（图3G），这表明VvMYB44-1在酵母中缺乏转录激活活性，可能充当转录抑制因子。此外，作者还采用了双荧光素酶报告实验来评估VvMYB44-1在烟草叶片中的转录活性。结果发现VvMYB44-1强烈抑制了荧光强度和荧光素酶（LUC）/REN比率，（图3H-I）。而当删除VvMYB44-1中的EAR基序时，VvMYB44-1的抑制作用明显减轻（图3H-I），这表明VvMYB44-1的转录抑制作用部分依赖于EAR基序。综上，VvMYB44-1可能作为转录抑制因子在葡萄高温胁迫下发挥功能。

图2：（A-B）VvMYB44-1的表达在高温时明显被诱导。

图3：（A-B）VvMYB44-1的表达在高温胁迫时诱导更加显著（C-D）VvMYB44-1在高温胁迫下表现出更高的GUS活性（E）VvMYB44-1组织进化分析（F）VvMYB44-1定位于细胞核中（G）VvMYB44-1在酵母中缺乏转录激活活性（H-I）VvMYB44-1抑制了荧光强度，删除EAR继续会减弱抑制效果

为了确定VvMYB44-1在葡萄中的功能，作者在烟草中进行了异源瞬时和稳定表达试验。先前的研究表明，马铃薯花青素激活剂StAN1对烟草叶片的侵染会在转化后4天导致强烈的红色着色。然而，单独侵染VvMYB44-1时，没有观察到红色素沉着或花青素斑块（图4A、D）。而VvMYB44-1和StAN1共同侵染会导致轻微的红色着色，而且花青素含量明显低于单独浸润StAN1的烟草叶片（图4A、D），这表明VvMYB44-1是花青素生物合成的负调控因子。其他分析表明，VvMYB44-1和花青素生物合成相关基因的表达与花青素积累一致（图4F）。花青素生物合成途径的大多数结构基因在StAN1-OE叶片中强烈上调。而这些基因在StAN1和VvMYB44-1叶片共同浸润时明显下调（图4F）。这些发现表明，VvMYB44-1可以通过抑制花青素花青素生物合成相关基因的表达。

为了进一步评估VvMYB44-1在花青素生物合成中的功能，作者创制了过表达VvMYB44-1的稳定转基因烟草植株，并选择了三个具有代表性的VvMYB44-1-OE株系进行进一步研究。（图4B-C）。花青素分析表明，与野生型相比，所有三个转基因株系花朵中的花青素含量均大幅减少（图4E）。这进一步表明VvMYB44-1与花青素含量呈负相关。对转基因品系和对照品系花的表达分析表明，VvMYB44-1能抑制与花青素途径相关的几个结构基因和调控基因的表达。如NtAn1b、NtDFR和NtUFGT均有强烈的下调，它们与VvMYB44-1-OE花瓣花青素的减少有关（图4G）。这些结果表明，VvMYB44-1可能通过直接抑制结构基因的表达抑制烟草异源系统中的花青素积累。

为了进一步证实VvMYB44-1在调节花青素积累过程中响应高温胁迫，作者在不同温度条件下通过瞬时过表达VvMYB44-1和StAN1研究了烟草叶片颜色和花青素含量的变化。在常温条件下，过表达VvMYB44-1会使花青素含量降低约40%，而在高温胁迫下，花青素含量降低约60%（图4H-I）。这些发现表明，高温胁迫增强了VvMYB44-1对花青素积累的抑制作用。

图4：（A）StAN1和VvMYB44-1侵染烟草叶片（B）过表达VvMYB44-1-OE的三个株系（C）转基因株系的验证（D）VvMYB44-1降低了StAN1的激活作用（E）三个转基因株系花朵中的花青素含量均大幅减少（F）VvMYB44-1和花青素生物合成相关基因的表达与花青素积累一致（G）VvMYB44-1能抑制与花青素途径相关的几个结构基因和调控基因的表达（H-I）高温胁迫增强了VvMYB44-1对花青素积累的抑制作用

4.VvMYB44-1抑制葡萄果实中花青素的积累

根据之前在烟草中的发现，作者推测VvMYB44-1在葡萄花青素积累中发挥作用。考虑到葡萄的生长周期相对较长，转化效率较低，作者利用葡萄果实中的瞬时转化系统验证了VvMYB44-1的功能。与对照相比，VvMYB44-1葡萄中的瞬时过表达明显抑制了花青素的积累。相反，RNAi葡萄果实中的VvMYB44-1则明显加速了花青素的积累（图5A-B）。RT-qPCR显示，与对照相比，过表达和RNAi果实中VvMYB44-1的表达水平分别显著上调和下调（图5C）。为了研究VvMYB44-1对葡萄花青素生物合成的影响，作者还测定了花青素生物合成相关基因的表达水平。RT-qPCR分析表明，与对照相比，Vv4CH、Vv4CL、VvCHS、VvDFR和VvUFGT在过表达果实中的表达量增加，而在RNAi果实中的表达量减少（图5C）。

图5：（A-B）VvMYB44-1葡萄中的瞬时过表达抑制了花青素的积累，RNAi葡萄果实中的VvMYB44-1加速了花青素的积累（C）花青素生物合成相关基因的表达水平在过表达果实中增加，在RNAi果实中减少

5.VvMYB44-1直接与花青素生物合成相关基因的启动子结合抑制其表达

在表达VvMYB44-1的烟草和葡萄果实中，花青素生物合成相关基因的转录水平明显下降。基于这一观察结果，作者假设VvMYB44-1直接调控这些花青素生物合成相关基因的转录。为了验证这一假设，作者进行了酵母单杂交来确定VvMYB44-1是否与这些基因的启动子结合。试验证实VvMYB44-1与VvDFR和VvUFG的启动子结合（图6B、H）。先前的研究表明，MYB44能与MBS元件特异性结合。因此作者利用VvDFR和VvUFGT启动子中含有MBS基序的30 bp片段作为探针进行了EMSA（图6A、G）。结果显示，重组VvMYB44-1 蛋白与VvDFR/VvUFGT-DNA复合物之间出现了强结合带，表明形成了DNA蛋白复合物。加入过量序列相同的未标记竞争探针可抑制这些复合物的形成。而在VvMYB44-1蛋白和突变体标记探针之间没有观察到DNA蛋白复合物（图6C、I），这证实了VvMYB44-1在体外与VvDFR和VvUFGT启动子的MBS基序特异性结合。此外，ChIP-qPCR试验体内证实了VvMYB44-1与VvDFR和VvUFGT启动子的直接结合（图6D、J）。为了进一步验证VvMYB44-1对其靶基因的影响，作者使用荧光素酶系统在烟草叶片中进行了瞬时表达检测。结果表明，VvMYB44-1抑制了VvDFR和VvUFGT的启动子活性（图6E、F、K、L）。这些发现表明了VvMYB44-1通过抑制VvDFR和VvUFGT的启动子活性负调控花青素的生物合成。

图6：（A、G）VvDFR和VvUFGT启动子基序（B、H）酵母单杂证实VvMYB44-1与VvDFR和VvUFG的启动子（C、I）EMSA证实VvMYB44-1在体外与VvDFR和VvUFGT启动子的MBS基序特异性结合（D、J）ChIP-qPCR试验体内证实了VvMYB44-1与VvDFR和VvUFGT启动子的直接结合（E-F、K-L）荧光素酶报告系统证实VvMYB44-1抑制了VvDFR和VvUFGT的启动子活性

6.VvMYB44-1通过竞争性抑制MBW复合物的形成来抑制花青素的积累

上述实验中，作者发现了VvMYB44-1对花青素合成的抑制作用。为了寻找与VvMYB44-1互作的蛋白模块，作者利用酵母双杂交、spilt-Luc研究其与MBW复合物成分的相互作用。酵母的结果表明，VvMYB44-1不能独立促进酵母中下游基因的表达。然而，与VvMYB44-1和VvWDR2共同转化的酵母菌株在三缺培养基中表现出正常生长。同时，VvMYB44-1与VvMYBA1、VvMYBA2、VvMYC1、VvMYCA1和VvWDR1之间没有相互作用（图7A）。这些结果表明，VvMYB44-1在酵母中与VvWDR2相互作用。

为了进一步验证在酵母中获得的结果，作者在烟草中进行了荧光素酶互补实验。VvMYB44-1-nLUC和VvWDR2-cLUC的共表达显示了荧光素酶活性的明显重组，证实了VvMYB44-1和VvWDR2在烟草叶中的相互作用（图7B）。此外，Pull-down实验也证实了相互作用的结果（图7C）。这些发现共同表明，VvMYB44-1与MBW复合物的重要组成部分VvWDR2发生了互作。

此外，之前有报道称两个WDR（VvWDR1和VvWDR2）和两个bHLH（VvMYC1和VvMYCA1）与多个葡萄MYB TFs发生相互作用并调控花青素的生物合成。酵母双杂进一步的检测发现，VvWDR2可与VvMYBA1和VvMYBA2发生互作（图8A-B），表明VvMYB44-1可能通过竞争性抑制MYB-bHLH-WDR三元复合物的形成来抑制花青素的积累。此外，VvMYBA1和VvWDR2的共同侵染激活了VvDFR和VvUFGT的启动子活性，而VvMYB44-1明显抑制了VvMYBA1和VvWDR2诱导的荧光素酶活性（图8C-D），表明VvMYB44-1还通过竞争性抑制MYB-bHLH-WDR三元复合物的形成抑制了靶基因的启动子活性和MBW复合物的形成。

图7：（A）VvMYB44-1在酵母中与VvWDR2相互作用（B）split-Luc证实VvMYB44-1与VvWDR2互作（C）Pull-down证实VvMYB44-1VvWDR2互作

图8：（A-B）酵母系统证实VvWDR2可与VvMYBA1和VvMYBA2互作（C-D）VvMYB44-1明显抑制了VvMYBA1和VvWDR2诱导的荧光素酶活性

7.过表达VvMYB44-1通过增加内源性细胞分裂素导致花青素缺乏

作者在VvMYB44-1过表达株系中还观察到两种典型的细胞分裂素过量产生表型，即抑制主根生长和促进腋芽发育。与对照植株相比，VvMYB44-1转基因株系的主根长度较短（图9A-B），表明VvMYB44-1的过表达抑制了主根的生长。其次，VvMYB44-1的过表达还促进了腋芽的分枝（图9C）。接下来，作者在叶腋中施加了6-BA、GA3和ABA，7天后观察到，6-BA能促进腋芽生长，而GA3、ABA和H₂O则不能（图9D）。这些表型促使作者对VvMYB44-1株系的内源细胞分裂素浓度进行研究。几种主要的细胞分裂素的含量在VvMYB44-1过表达株系中明显增加（图9E），这表明转基因烟草的主根生长受抑制和腋芽生长增加可能是由于内源细胞分裂素含量的增加。随后，作者研究了细胞分裂素生物合成和降解途径相关基因的表达水平。与野生型叶片相比，VvMYB44-1过表达株系叶片中细胞分裂素生物合成基因的转录水平有所提高。然而，三个细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CKX）基因在VvMYB44-1转基因株中的表达明显下调（图9F），这三个基因在植物体内不可逆地降解细胞分裂素。这些结果表明，VvMYB44-1通过增强细胞分裂素的合成和抑制其降解来促进细胞分裂素的积累。

图9：（A-C）VvMYB44-1转基因株系的主根长度较短，腋芽分支较多（D）6-BA促进腋芽生长（E）几种主要的细胞分裂素的含量在VvMYB44-1过表达株系中显著增加（F）VvMYB44-1过表达株系叶片中细胞分裂素生物合成基因的转录水平提高。三个CKX基因在VvMYB44-1转基因株中的表达显著下调

8.VvMYB44-1通过与VvLOG8和VvCKX4的启动子结合来促进细胞分裂素积累

上述研究结果表明，VvMYB44-1提高了细胞分裂素的水平，并上调了四个NtLOGs的表达（图9），为了研究VvMYB44-1是否直接调控细胞分裂素相关基因的表达，作者使用酵母单杂。结果显示VvMYB44-1直接与VvLOG8的启动子结合（图10A-B）.VvLOG8是细胞分裂素生物合成过程中的一个关键酶。为了进一步验证VvMYB44-1是否能与VvLOG8启动子中的MBS-box motifs结合，作者进行了EMSA实验验证。结果显示，VvMYB44-1可以与含有MBS-box motif的VvLOG8启动子片段结合（图10A、C）。而当MBS-box元件突变时，这种结合就消失了（图10A、C）。此外，ChIP-qPCR证实VvMYB44-1蛋白可免疫沉淀含有完整MBS-box的VvLOG8启动子区域（图10D），这表明VvMYB44-1与VvLOG8启动子在体内结合。随后，作者采用LUC报告检测VvMYB44-1是否能激活VvLOG8启动子的表达。结果发现共同表达62SK-VvMYB44-1和proVvLOG8：LUC的发光强度和LUC/REN比率更强（图8E-F）。这些发现共同表明，VvMYB44-1通过与VvLOG8启动子中的MBS-box结合，激活了VvLOG8的转录，从而导致细胞分裂素水平升高。

研究结果还表明，在烟草中过表达VvMYB44-1能明显抑制三个NtCKX的表达（图9F）。为了探索VvMYB44-1与细胞分裂素降解基因VvCKXs启动子的特异性结合，作者进行了酵母单杂实验。结果表明，在酵母系统中，VvMYB44-1直接与VvCKX4的启动子结合（图10H）。EMSA结果显示，VvMYB44-1蛋白和来自VvCKX4启动子的MBS-box元件特异性结合。当加入未标记的竞争探针和突变体标记探针时，信号完全消失（图10G、I），这表明 VvMYB44-1能在体外特异性地与VvCKX4启动子的MBS基序结合。在ChIP-qPCR试验中，VvMYB44-1蛋白可以免疫沉淀含有MBS-box的VvCKX4启动子区域，这意味着VvMYB44-1在体内与VvCKX4启动子结合（图10J）。LUC实验也表明VvMYB44-1直接抑制了VvCKX4的启动子活性（图10K、L）。这些结果表明，VvMYB44-1通过增加细胞分裂素合成基因 VvLOG8的表达和抑制细胞分裂素降解基因VvCKX4的转录来促进细胞分裂素的积累。

图10：（A-B）Y1H证实VvMYB44-1直接与VvLOG8的启动子结合（C）EMSA证实VvMYB44-1可以与含有MBS-box motif的VvLOG8启动子片段结合（D）ChIP-qPCR证实VvMYB44-1蛋白与MBS-box的VvLOG8启动子区域结合（E-F）VvMYB44-1激活VvLOG8启动子的表达（G-H）VvMYB44-1直接与VvCKX4的启动子结合（H-L）VvMYB44-1直接抑制了VvCKX4的启动子活性

9.EAR基序在VvMYB44-1抑制花青素生物合成中发挥重要作用

EAR基序是植物中最重要的转录抑制基序，而含有EAR基序的VvMYB44-1能抑制葡萄中花青素的生物合成。因此作者假设，VvMYB44-1是否通过其EAR基序影响花青素的积累。为了验证这一假设，作者对VvMYB44-1的功能进行了研究。与VvMYB44-1共同转化相比，VvMYB44-1ΔE与StAN1共同转化会导致色素沉着增加（图11A）。注射部位的花青素含量与观察到的表型变化一致（图11B）。为了进一步研究VvMYB44-1的EAR基序对其靶基因的影响，作者根据在烟草花叶中瞬时表达系统的结果进行了双LUC检测。共表达VvMYB44-1ΔE和proVvDFR：LUC/proVvUFGT:LUC与VvMYB44-1共转化相比，表现出更强的发光强度和LUC/REN比率（图11C-D）。这表明EAR基序的缺失通过调节花青素生物合成相关基因的表达，减弱了VvMYB44-1对花青素积累的抑制作用。此外，VvMYB44-1ΔE还降低了对VvCKX4的抑制作用（图11E），这表明VvMYB44-1的EAR基序可能通过抑制细胞分裂素降解基因VvCKX4的表达来促进细胞分裂素的积累、从而限制葡萄中花青素的积累。

图11：（A-B）EAR基序会减弱VvMYB44-1对花青素的抑制作用（C-D）EAR基序的缺失减弱了VvMYB44-1对花青素生物合成相关基因的抑制（E）EAR基序降低了对VvCKX4的抑制作用

=== 总结 ===

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～ The End! ～