2024年8月，德国法兰克福歌德大学Sotirios Fragkostefanakis团队在植物学期刊“Nucleic Acids Research”在线发表了一篇题为“A plant-specific clade of
serine/arginine-rich proteins regulates RNA splicing homeostasis and thermotolerance
in tomato”的研究论文。该团队发现发现富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子家族(SRSF)的几个成员抑制HSFA2内含子剪接，其中RS2Z35和RS2Z36在减轻HS对RNA剪接稳态的负面影响方面发挥着核心作用，它们的出现可能有助于提高植物适应高温的能力。![]()
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为了生存和从热应激中恢复，植物需要合成热休克蛋白（HSPs）和活性氧（ROS）清除剂等蛋白质，以保护细胞结构免受不可逆的损害。热休克转录因子（HSFs）控制许多HSPs和其他热应激响应基因的诱导，其中HSFA1亚家族成员对启动热应激反应至关重要，被认为是热耐受性的主要调节因子。选择性剪接有助于产生编码具有不同特性和功能的蛋白异构体的剪接变体。例如，番茄中的HSFA2和HSFA7基因的剪接导致快速降解的蛋白异构体，而完整或部分内含子保留产生稳定蛋白异构体，这些异构体在耐热细胞中长时间维持。因此，在番茄和其他茄科植物中，HSFA2和HSFA7 mRNA的选择性剪接对于获得热耐受性（ATT）至关重要。与调控热应激反应的核心转录因子的研究相比，调控热应激敏感选择性剪接的主要调节因子尚未确定。一些研究表明，特定的剪接因子如SF1/BBP、LSM5和STABILIZED1（STA1）参与了拟南芥HSFs的剪接，因此有助于热耐受性。剪接因子SRSFs参与了正常和选择性剪接，这个家族的成员参与了非生物胁迫耐受性，但它们在热应激介导的选择性剪接中的作用尚未探索。# 思维导图：
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#根据原文整理，以原文为准，欢迎指正！
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1.热应激影响番茄叶片中的选择性前体mRNA剪接
为了阐明HS对番茄选择性剪接的影响，对暴露于40°C或25°C1小时的叶子进行了RNA-seq分析。研究结果表明，热应激导致了4785个差异调节的选择性剪接事件（DAS），其中大多数是二元剪接事件（bDAS），包括内含子保留（IR）、替代3'剪接位点选择（A3ss）、盒式外显子（CE）和替代5'剪接位点选择（A5ss）。研究共鉴定出2801个具有bDAS事件的基因。热应激对选择性剪接既有抑制作用也有促进作用，表明所选处理方式并不是简单地抑制剪接，而是扰乱了RNA剪接的稳态平衡。基于此，研究假设存在能够积极介导热应激敏感选择性剪接的剪接因子。在上调的bDAS/DEG基因中，研究者鉴定了HSFA2这一获得热耐受性（ATT）的中心因子，以及参与蛋白质折叠和命运以及前mRNA剪接调控的基因。基因本体（GO）富集分析显示，bDAS基因涉及33个生物过程，而DEGs仅涉及11个，两者之间没有重叠。DEGs主要涉及应激响应，而bDAS基因则涵盖了更广泛的生物过程，包括mRNA剪接（图1）。
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图1.通过差异表达和RNA剪接响应热应激（40°C，1小时）的转录组调控。(A)差异选择性剪接事件的数量。(B)IR、CE、A3ss和A5ss类型的DAS二进(bDAS)事件的分布。(C)DAS和差异表达基因的重叠。(D)被识别为DAS或DEG的基因的生物过程的基因本体(GO)注释。
2.RS2Z介导的HSFA2剪接调节
在番茄中，HSFA2基因的选择性剪接对其热应激反应至关重要。HSFA2基因产生三种剪接变体，这些变体都编码参与获得热耐受性（ATT）的蛋白质亚型HsfA2-I。另外，内含子剪接产生异构体HsfA2-II，其编码的蛋白质异构体可快速降解，因此在栽培番茄的耐热性中不起重要作用（图2A-B）。研究者利用HSFA2作为报告基因，通过SRSF家族成员作为猎物，研究了HS敏感的选择性剪接事件的潜在调节因子。研究发现，SRSF家族中的RS30、SCL29、SC30b、RS2Z35和RS2Z36能够减少HSFA2中的内含子剪接，而其他SRSF成员则没有影响。特别是RS2Z35和RS2Z36，它们属于SRSF家族的RS2Z植物特异性亚族，其在热应激反应中的作用尚未被描述（图2C）。
RS2Z35和RS2Z36蛋白具有N端RNA识别基序（RRM），后跟两个锌指结构域ZnK）、富含精氨酸丝氨酸（RS）二肽的C端区域和富含丝氨酸脯氨酸（SP）的区域。研究表明RS2Z蛋白对HSFA2内含子2的影响独立于转录和内含子1的剪接。ZnK的删除消除了这两种蛋白质对HSFA2小基因剪接的负面影响，暗示这些结构域对于它们作为HSFA2剪接沉默子的功能至关重要（图2D）。
在番茄转基因植物中表达GFP标记的RS2Z蛋白，在叶表皮细胞中显示出核定位。与野生型相比，转基因系中内源RS2Z35的转录水平降低，而RS2Z36则不受影响，表明RS2Z35可能存在自动和交叉调节。剪接分析还显示，在热应激1小时后，与野生型相比，两个转基因系中HSFA2的内含子保留增强。通过RNA免疫沉淀（RIP-qPCR）证实了HSFA2 mRNA与两种RS2Z蛋白在转基因系中的关联。（图2E-F）转基因株系中HSFA2 mRNA与两种RS2Z蛋白的关联通过RIP-qPCR得到证实。相反，RS2Z蛋白没有表现出来自用作阴性对照的管家基因EF1a的mRNA富集（图2G）。
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图2.RS2Z蛋白对HSFA2剪接的调节。(A)HSFA2的剪接概况。上图：HSFA2外显子/内含子基因结构。(B)基于番茄叶肉原生质体中HA标记蛋白的瞬时表达来识别HSFA2剪接调节因子的示意图。(C)SR表达和模拟原生质体之间内源HSFA2剪接指数(PSI)的差异。(D)RS2Z35和RS2Z36蛋白和结构域缺失突变体对HS诱导型HSP21.5启动子驱动的HSFA2小基因剪接的影响。(E)基于qRT-PCR分析，WT和PCaMV35S::GFP-RS2Z转基因系中内源和蛋白质编码RS2Z35和RS2Z36的相对转录水平。(F)WT和GFP-RS2Z转基因系中HSFA2的剪接概况。(G) RIP-qPCR验证RS2Z蛋白与内源HSFA2或EF1a mRNA的关联。
3.RS2Z蛋白对于基础耐热性和获得性耐热性很重要
为了深入研究RS2Z蛋白在剪接调节中的作用及其与耐热性的相关性，研究者通过CRISPR-Cas9基因编辑技术成功创建了单个纯合的rs2z35和rs2z36突变体番茄。这些突变体是移码突变并引入过早终止密码子（PTC），从而通过无义介导的mRNA衰减（NMD）机制降低两个RS2Z基因的转录水平（图3A）。在单个rs2z35或rs2z36突变体中，HSFA2的剪接没有受到影响，但在双纯合突变体（rs2z35 rs2z36）中HSFA2的内含子剪接得到了增强，表明这两种蛋白在HSFA2内含子剪接中具有冗余作用。此外，双突变体在40℃热应激1和2小时后，HSFA2-I依赖性的Hsp17.7A-CI基因表达水平降低，进一步将RS2Z蛋白与HSF依赖基因表达的调节联系起来（图3B-D）。在标准栽培条件下，单突变体与野生型（WT）植物在表型上没有差异，但双突变体的下胚轴伸长率略有降低。在耐热性测试中，单rs2z突变体和双rs2z突变体的获得性耐热性（ATT）低于WT，类似于hsfa2-1突变体。这表明RS2Z蛋白在HSFA2剪接不影响的情况下，也以不依赖于HSFA2的方式调节耐热性（图3E-G）。与WT相比，暴露于1和2小时HS的幼苗中rs2z35突变体的下胚轴伸长略有减少，而rs2z36和rs2z35 rs2z36突变体响应2和4小时HS处理表现出下胚轴伸长减少（图3H）。相比之下，HSFA1a共抑制系(A1CS)的幼苗并未受到短1小时HS的影响。这些结果表明，组成型表达的RS2Z35以不依赖于HSF的方式对HS早期阶段的耐热性很重要，而HS诱导的RS2Z36对于响应长期HS处理的耐热性很重要（图3E-I）。图3.RS2Z蛋白参与番茄幼苗的耐热性。(A) RS2Z35和RS2Z36突变体的序列。(B) WT以及单和双rs2z CRISPR突变体中HSFA2的剪接概况。(C)箱线图描绘了来自8个生物重复的HSFA2剪接指数(PSI)的中值、25%和75%四分位数。(D)基于qRT-PCR分析的Hsp17.7A-CI转录水平。(E)耐热性测定中使用的热应激方案。(F)基于顶部所示的耐热性测定的WT和突变番茄幼苗的代表性图像。(G) AT和(H) BTT。(I)与对照相比，每个基因型的相对下胚轴伸长情况。
4.RS2Z蛋白是HS敏感选择性剪接的核心调节因子
为了确定两种RS2Z蛋白调节的可变剪辑事件，对暴露于40°C 1小时或保持在25°C作为对照的单突变体和双突变体的叶子进行RNA测序后的全长剪接分析，发现RS2Z蛋白在正常和热应激条件下特异性和冗余地调节许多基因的剪接。在对照条件下，RS2Z蛋白总共产生663个bDAS事件，在热应激条件下产生1307个bDAS事件。此外，RS2Z蛋白调节了2801个HS敏感bDAS基因中的720个，表明它们在热应激条件下是RNA剪接的核心调节因子（图4A-C）。基于bDAS事件的剪接定量，观察到突变体在两个方向上引起相当的剪接变化（图4D、E）。此外，突变体没有表现出特定类型选择性剪接的任何富集。这些结果表明，这两种蛋白质参与促进和沉默剪接，并且不优先参与特定类型的剪接，而是有助于剪接稳态。与大量bDAS基因相比，每种条件下突变体和WT之间的差异表达分析产生的DEG数量相对较少（图4F）。在对照条件下，大多数已鉴定的DEG在突变体中上调，而在HS下，诱导和减少的基因数量相似。272个DEG中只有23个是bDAS基因，表明基因表达的改变在很大程度上与剪接无关。
图4.RS2Z编码基因的突变扰乱RNA剪接稳态。(A)DAS事件的数量，根据拼接类型进行分类。(B)与WT相比，rs2z单突变体和双突变体受热应激叶片影响的重叠和独特DAS事件。(C) WT叶中HS敏感的DAS基因与HS下RS2Z调节的bDAS基因的重叠。(D)所有bDAS事件的PSI值的热图。(E)所有突变体的HS叶中四个二元DAS事件的正负PSI值的分布。(F)与对照或HS条件下的WT相比，单突变体系或双突变体系中上调或下调的DEG数量。
5.热胁迫番茄叶片中RS2Z蛋白的RNA相互作用组
研究者通过采用个体核苷酸分辨率UV交联和免疫沉淀（iCLIP2）技术，成功生成了两种RS2Z蛋白的转录组范围结合图谱。这项技术允许在转录组水平上映射RNA结合蛋白（RBP）与RNA的相互作用位点。通过使用iCLIP2技术，研究者能够鉴定出RS2Z35和RS2Z36蛋白的79257个结合位点，其中49856个对应于RS2Z35，53293个对应于RS2Z36，这两个蛋白质共享大约50%的结合位点。为了进一步了解RS2Z35和RS2Z36的结合偏好，检查其顶部25%和底部强度25%结合位点的序列组成。对于这两种蛋白质，基序UGGAG在前25%的结合位点中表现出较高的频率（图5I）。UGGAG基序在7-nt结合位点内特异发现（图5I），但在结合位点上游或下游的17-nt区域中并不明显。根据de novo基序的发现，GGAG很普遍，而相邻的上游核苷酸是可变的。GGAG基序存在于大约15%的RS2Z35和RS2Z36结合位点中，这些结合位点的结合明显强于与用作对照的CUCC（反义）、UUUU或AAAA序列的结合位点（图5J）。对以内含子5和3端为中心的51 nt窗口内的GGAG基序进行位置分析表明，主要发现了GGAG基序在外显子区域，特别集中在内含子5和3之前（图5K）。总而言之，数据表明，这两种蛋白质都与外显子中富含嘌呤的基序结合，并以正向或负向方式调节邻近内含子的剪接。
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图5.RS2Z35和RS2Z36的RNA相互作用组。(A)通过iCLIP在暴露于40°C 1小时的转基因株系的叶子中鉴定出常见和特异的RS2Z35和RS2Z36结合位点。(B) PureCLIP评分显示两种蛋白质在HSFA2 mRNA上的结合位点和强度。(C)内含子、CDS或UTR中RS2Z35和RS2Z36结合位点的分数。(D)各个基因上RS2Z结合位点(BS)的频率。(E)具有iCLIP结合位点(BS)的基因数量。(F)由iCLIP2识别的假定RS2Z35和RS2Z36依赖性DAS基因的分数。(G)在RS2Z35和/或RS2Z36 iCLIP2分析中鉴定的WT DAS基因的分数。(H)所有HS敏感WT DAS基因中选择性剪接事件的分布。(I)顶部和底部25%结合位点内五聚体的频率比较。(J)在距结合位点中心15-nt附近包含GGAG基序的结合位点的PureCLIP评分分布。(K)内含子5 ́和3 ́末端周围51-nt窗口中GGAG（红色）和CUCC（灰色）基序密度的位置图。
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对RS2Z35和RS2Z36蛋白功能相关性的研究结果揭示了这些蛋白在维持HS下RNA剪接稳态中发挥的关键作用。这些蛋白质对HS具有明显的时间敏感性，其中RS2Z35参与早期反应，RS2Z36参与后期，强调了它们在应激反应不同阶段的重要性。这些蛋白质的双向作用，既充当剪接的沉默子又充当增强子，进一步证明了它们在RNA剪接调节中的关键功能。这种多功能性允许对HS做出更精细的反应，确保植物既能快速应对即时胁迫，又能适应长期胁迫条件。不同植物物种中富含嘌呤的RNA结合基序的保守性强调了这些蛋白质在高温条件下植物生存中的推定进化重要性，强调了RNA剪接调节与植物适应和适应环境的能力之间的直接联系。抵御环境压力。我们得出的结论是，如HSF和RS2Z蛋白的活性所示，HS反应和RNA剪接重叠，但也独立地协调转录组水平以建立耐热性。
期刊：Nucleic Acids Research------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
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