2023年6月中国科学院侯兴亮教授团队在Plant Cell上发表了题为Gibberellin signaling modulates flowering via the DELLA-BRAHMA-NF-YC module in Arabidopsis的论文。在这项研究中，作者证明BRAHMA（BRM）通过与DELLA和NF-YCs形成GA响应模块来参与GA信号介导的开花。BRM与NF-YCs的相互作用，抑制其与主要开花基因SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）的结合，并且DELLA可以显著促进BRM与NF-YCs之间的相互作用以及促进BRM与SOC1的结合。这两种机制都会减少H3K4me3在SOC1染色质上的沉积，从而导致SOC1基因表达减少和开花延迟。GA促进DELLA的降解，释放BRM抑制NF-YC活性和SOC1转录，从而促进早期开花。这些发现为了解GA信号通过BRM加速植物开花的表观遗传调控机制提供了重要的见解。![]()
=== 研究背景 ===
从营养生长到生殖发育的过渡对于开花植物成功繁殖至关重要。这种转变的时间受到环境因素和内在信号的严格控制。通过各种遗传和分子生物学研究，拟南芥（Arabidopsis thaliana）已确定了六种开花途径：光周期、春化、热感、自主、赤霉素（GA）和年龄途径。赤霉素（GA）通过激活植物中开花基因的表达在花诱导中发挥关键作用，但该过程背后的表观遗传调控机制仍不清楚。生物活性GA可以与其受体GA-INSENSITIVE DWARF1(GID1)结合，进而结合DELLA蛋白(DELLA)进行泛素化和降解。一些NF-YA、NF-YB和NF-YC转录因子已被证明可以调节拟南芥开花。同时NF-Ys和DELLA之间的分子和遗传关系已得到证明，但DELLA如何抑制NF-Ys活性的详细分子机制开花期间仍不清楚。# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1.DELLA与BRM进行互作
DELLA是GA反应的重要抑制因子，与其他蛋白质发生相互作用可以控制开花，但在此过程中起作用的DELLA相关的表观遗传因素很少被确定。为了研究DELLA的潜在表观遗传基因，作者进行了一系列酵母双杂交测定。BRM是SWI/SNF复合体的核心亚基，能与酵母中的所有5种拟南芥DELLA强烈相互作用（图1、A和B）。分析表明，RGAN（氨基酸1至199）和BRMN（氨基酸1至952）对于RGA与BRM的相互作用是必要且充分的（图1、A、C和D）。Pull-down实验显示，His-DELLA被GST-BRMN成功下拉，但没有被GST对照下拉，这表明BRMN在体外与DELLA蛋白发生互作（图1E）。为了进一步测试DELLA和BRM之间的体内互作，作者先在本塞姆氏烟草叶子中进行了分裂荧光素酶（split-LUC）互补测定。当BRMN-nLUC和cLUC-RGA共表达时观察到强烈的互作信号，而阴性对照中没有信号（图1F）。作者对含有35S:RGA-FLAG pBRM:BRM-GFP (RGA-FLAG BRM-GFP)的双转基因拟南芥植物进行免疫共沉淀(co-IP)测定后发现RGA-FLAG与BRM-GFP进行免疫共沉淀（图1G），这证实了拟南芥中RGA和BRM之间的相互作用。这些发现表明BRM在体外和体内均与DELLA蛋白相互作用。![]()
图1 RGA在体外和体内与BRM发生相互作用。A：酵母双杂交检测中使用的全长RGA、BRM及其截短衍生物的示意图。B–D：酵母双杂交检测显示RGA和BRM之间的相互作用。E：Pull-down测定显示His-RGA和GST-BRMN融合蛋白在体外的直接相互作用。F：Split-LUC互补成像测定显示本塞姆氏烟草细胞中RGA和BRMN的相互作用。G：Co-IP测定显示拟南芥中RGA和BRM的相互作用。BRM在开花控制中的作用先前已有报道。根据本研究中发现的DELLA-BRM相互作用，作者推测这两种蛋白质可能共同发挥作用来控制开花。为了验证这一猜测，作者发现brm-3突变体分别完全或部分恢复了35S:RGA-FLAG或pRGA:RGAΔ17（GA不敏感形式）植物的晚花表型（图2、A和B)。RGA、GAI、RGL1和RGL2的四重突变体(dellaq)表现出早期开花表型，并且brm-3 dellaq突变体表现出与brm-3或dellaq突变体相似的开花表型（图2、C和D）。但brm-3突变体显著挽救了ga1的晚花表型（图2，E和F），ga1是一种GA缺陷突变体，其中DELLA蛋白高度积累。这些观察结果表明，BRM可能在开花期间位于DELLA基因的上游。开花基因SOC1和FT参与GA介导的开花调节。作者通过RT-qPCR研究了DELLA和BRM是否共同调节这2个开花基因的表达。与Col-0相比，brm-3、35S:RGA-FLAG、pRGA:RGAΔ17和ga1植物中SOC1和FT的转录水平变化显著，并且BRM的缺失导致35S:RGA-FLAG、pRGA:RGAΔ17和ga1植物中SOC1和FT表达受到显著抑制（图2G）。由于brm-3 dellaq突变体育性异常，无法从纯合brm-3 dellaq突变体植物中获得种子，所以未检测其中SOC1的表达。为此作者用RT-qPCR检测之前用GA处理brm-3突变体。GA处理没有进一步促进brm-3中SOC1和FT的表达，这也与brm-3和brm-3 dellaq突变体的表型一致（图2，C和D）。染色质免疫沉淀(ChIP)分析显示，BRM在SOC1的染色质处富集，但在FT处不富集。为了验证DELLA-BRM模块是否通过改变SOC1的表达来共同调节开花，作者进行本塞姆氏烟草叶子中的瞬时表达。测定结果表明，BRM或RGA降低了SOC1启动子驱动的LUC活性，并且BRM和RGA的共表达显著增加了SOC1启动子驱动的LUC的抑制（图2H）。表明DELLA-BRM模块负向调节SOC1的表达。为了探索DELLA-BRM模块如何调节SOC1表达，作者进行了ChIP测定，以确定DELLA是否影响BRM与SOC1启动子。在dellaq突变体中，SOC1染色质处的BRM富集急剧减少，但在ga1突变体中增加（图2I）。与Col-0植物相比，dellaq/ga1或brm-3突变体中的BRM或RGA蛋白水平没有改变，表明DELLA增强了BRM与SOC1的结合。同时GA显著降低了BRM-GFP与SOC1的结合，而GA生物合成抑制剂多效唑(PAC)则增加了BRM-GFP与SOC1的结合。这些结果表明DELLA通过BRM调节SOC1的表达来控制开花。![]()
图2. BRM在调节开花时间方面比DELLA具有上位性。A和B：Col-0、brm-3、35S:RGA-FLAG(RGA-FLAG)和brm-3 RGA-FLAG的开花表型。C和D：Col-0、brm-3、dellaq和brm-3 dellaq的开花表型。E和F：Col-0、brm-3、ga1和brm-3 ga1的开花表型。G：RT-qPCR分析9日龄Col-0、brm-3、RGA-FLAG、brm-3 RGA-FLAG、ga1、brm-3 ga1、GA处理的Col-0(Col-0-GA)和GA处理的brm-3(brm-3-GA)幼苗。H：瞬时表达测定表明SOC1的表达受到BRM和RGA的共同调节。I：BRM-GFP与Col-0、dellaq和ga1突变体中SOC1位点结合的ChIP分析。作者之前表明DELLA与NF-Y亚基一起发挥作用，在GA途径中控制开花。为了研究了这些蛋白质之间的潜在生物学关系，作者进行了酵母双杂交实验。实验结果表明NF-YC3,NF-YC4和NF-YC9都与酵母中的BRM相互作用（图3A）。区域作图分析显示，BRMN介导与NF-YCs的相互作用（图3B）。Pull-down结果显示His-NF-YC3、His-NF-YC4和His-NF-YC9可以被GST-BRMN下拉，表明BRMN与NF-YCs能够体外互作（图3C）。作者选择NF-YC9作为NF-YCs的代表来研究植物中BRM和NF-YCs之间的相互作用。Split-LUC互补测定显示，当BRMN-nLUC和cLUC-NF-YC9共表达时，本塞姆氏烟草叶片中存在强烈信号(图3D)。使用nf-yc9-1 pNF-YC9:NF-YC9-FLAG pBRM:BRM-GFP (NF-YC9-FLAG BRM-GFP)拟南芥植物的co-IP测定也表明NF-YC9-FLAG蛋白可以与BRM-GFP进行免疫共沉淀（图3E）。这些结果表明BRM在体外和体内均能与NF-YCs相互作用。![]()
图3 BRM在体外和体内与NF-YC9发生互作。A：酵母双杂交测定显示BRM和NF-YC9之间的相互作用。B：酵母双杂交测定显示BRMN直接与NF-YC9相互作用。C：Pull-down测定显示体外GST-BRMN和His-NF-YC9融合蛋白之间的直接相互作用。D：Split-LUC互补成像测定显示本塞姆氏烟草细胞中BRMN与NF-YC9的相互作用。E：Co-IP测定显示拟南芥中NF-YC9和BRM的相互作用。
4.BRM在SOC1介导的开花过程中与NF-YCs发生互作
为了阐明BRM-NF-YCs相互作用的生物学功能，作者评估了开花期间BRM和NF-YCs之间的遗传关系。Brm-3和nf-ycT（nf-yc3/4/9三重突变体）植物分别表现出早花和晚花。四重brm-3 nf-ycT突变体开花明显早于nf-ycT突变体，晚于brm-3突变体（图4，A和B），表明BRM和NF-YCs可能在调节开花时间上是拮抗关系。Brm-3 nf-ycT中SOC1和FT的表达显著高于nf-ycT，但低于brm-3（图4C）。作者还使用双荧光素酶报告基因测定在本塞姆氏烟草叶子中检查了BRM和NF-YC9调节的SOC1启动子活性（图4D）。瞬时测定显示NF-YC9增强了LUC活性；BRM则相反（图 4D）。这些结果表明BRM和NF-YC在调节SOC1表达方面呈现相反功能。为了进一步验证BRM和NF-YC在调节SOC1表达方面的相反功能，作者使用brm-3 nf-yc9-1 pNF-YC9:NF-YC9-FLAG(brm-3 NF-YC9-FLAG)进行ChIP检测。与对照相比，brm-3中SOC1上的NF-YC9富集度高于FT染色质（图4E）。鉴于NF-YC9蛋白的水平不受BRM功能丧失的影响，推测SOC1染色质上NF-YC9的更大富集源于BRM抑制的缺乏。由于BRM和NF-YCs都被证明可以通过组蛋白修饰调节基因的表达，作者观察了H3K4me3和H3K27me3的沉积，这是参与SOC1染色质转录调节的关键标记。BRM和NF-YCs对SOC1位点的H3K4me3水平具有相反的影响，并且在brm-3 nf-ycT突变体中被消除。相比之下，H3K27me3沉积仅由NF-YCs介导，而不是由BRM介导。综上所述，这些结果表明BRM通过H3K4me3在SOC1染色质上的沉积来拮抗NF-YCs活性以调节开花时间。![]()
图4 NF-YCs和BRM通过直接调节SOC1表达来拮抗地调节开花。A和B：Col-0、brm-3、nf-ycT和brm-3 nf-ycT的开花表型。C：对发育中的Col-0、brm-3、nf-ycT和brm-3 nf-ycT幼苗中SOC1表达进行RT-qPCR分析。D：瞬时表达测定表明SOC1的表达受NF-YC9和BRM调节。E：NF-YC9-FLAG与SOC1位点结合的ChIP分析。
5.DELLA蛋白增强BRM与NF-YCs的相互作用
鉴于DELLA与BRM和NF-YC相互作用的发现，为了确定这些蛋白质是否共同发挥作用来调节GA介导的开花，作者选择了RGA和GAI（DELLA蛋白）进行进一步分析。酵母三杂交检测表明，BRM和NF-YC9之间的相互作用在RGA或GAI存在的情况下得到加强（图5，A和B）。Split-LUC互补测定还表明，RGA或GAI与BRM和NF-YC9共表达增强了LUC活性（图 5、C 和 D），即使BFP的蛋白质水平明显高于RGA或GAI（图5E）。这些结果表明DELLA增加了体内BRM和NF-YC9之间相互作用的强度。为了证实这些发现，作者通过co-IP验证了RGA对BRM和NF-YC9之间相互作用的影响并发现NF-YC9-FLAG在RGA-HA中与BRM-GFP共免疫沉淀（图5，F和G）。DELLA蛋白是GA信号转导中的关键阻遏蛋白，通过抑制NF-Y与SOC1的结合来调节SOC1的表达。这一观察结果与当前研究的结果相吻合，表明DELLA可能通过增强BRM与NF-YCs的相互作用来募集BRM以抑制NF-Y与SOC1的结合。为了检验这一假设，作者用GA或PAC处理NF-YC9-FLAG和brm-3 NF-YC9-FLAG幼苗，并进行ChIP检测以评估NF-YC9与SOC1染色质的结合能力。结果显示GA或PAC处理对NF-YC9与SOC1启动子的结合具有显著影响但是BRM的功能丧失突变消除了这种效应（图5H），表明BRM对于GA信号传导对NF-YC9与SOC1结合的影响至关重要。Brm-3植物的开花对GA处理没有反应，尽管GA处理显著加速了Col-0植物的开花（图5、I和J），这进一步证明前文假设。研究结果表明DELLA蛋白促进DELLA-BRM-NF-YC模块的形成，这对于GA介导的开花至关重要。![]()
图5 RGA增强NF-YC9与BRM的相互作用。A：酵母三杂交测定显示在RGA存在下NF-YC9和BRM之间的相互作用增强。B：定量酵母三杂交测定确定（A)中相互作用的强度。C和D：Split-LUC互补成像测定显示本塞姆氏烟草细胞中RGA增强了NF-YC9和BRMN的相互作用。E：通过用抗GFP抗体探测来确定本塞姆氏烟草细胞中BFP-GFP和RGA-GFP的蛋白质水平。F：Co-IP测定显示RGA促进拟南芥中NF-YC9和BRM的相互作用。G：NF-YC9-FLAG BRM-GFP和NF-YC9-FLAG BRM-GFP RGA-HA中RGA-HA的蛋白质表达分析。H：在模拟处理或用100μM GA3或10μM PAC处理24小时的Col-0和brm-3中，NF-YC9-FLAG与SOC1位点结合的ChIP分析。I和J：Col-0和brm-3的开花表型
=== 总结 ===在缺乏GA的情况下，DELLA蛋白会积累并促进DELLA-BRM-NF-YC模块的形成，从而通过BRM抑制NF-YCs与SOC1位点的结合。同时，DELLA蛋白促进BRM与SOC1结合，从而通过减少H3K4me3在SOC1染色质上的沉积来抑制SOC1的表达，导致晚开花。在GA存在的情况下，DELLA蛋白被泛素化并被26S蛋白酶体降解。这通过扰乱DELLA-BRM-NF-YC模块来释放NF-YC的抑制，并减少BRM与SOC1的结合，从而通过增加H3K4me3在SOC1染色质上的沉积来增强SOC1的表达，从而导致提前开花。![]()
图6 提出的模型说明了DELLA–BRM–NF-YC模块如何调节GA信号介导的开花。
接收日期：2023年5月25日
发表日期：2023年6月9日
------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
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