PJ | lncRNA LAIR的选择性剪接微调邻近产量相关基因LRK1在水稻中的表达调控

学术   2024-08-29 19:29   浙江  
20246月,复旦大学罗小金团队在植物学期刊“The Plant Journal”在线发表了一篇题为“Alternative splicing of lncRNA LAIR fine-tunes the regulation of neighboring yield-related gene LRK1 expression in rice”的研究论文。该团队克隆并预测了籼稻品种MH63LAIR的九个选择性剪接亚型,研究表明LAIR的选择性剪接导致功能转录本群体的形成,该转录本群体同时参与水稻生长的组成型调控和胁迫敏感性调控,有助于理解选择性剪接在水稻中的精确调控作用机制。



   









长非编码RNAlncRNA)的选择性剪接会产生大量用于基因进化的调节RNA和转录本,提供了一种在不增加基因数量的情况下使转录本多样化的机制。对lncRNA选择性剪接的研究有助于复杂基因调控机制的表征,并提高生物体对复杂环境刺激反应的理解。

多数lncRNA分子的结构多样性具有重要的功能作用,lncRNA通过选择性剪接可以改变其结构并影响蛋白质、RNADNA的组装作为分子支架通过结构模块实现特异性调节,因此结合可变剪接研究lncRNA的功能将有助于更好地理解lncRNA支架的特性以及微调基因表达调控的机制。

据报道,一些lncRNA参与了水稻产量相关性状的调控。并且作者此前鉴定了与水稻产量增加相关的数量性状位点(QTL),其中包括富含亮氨酸的重复受体激酶(LRK)基因簇位于LRK基因簇上游的lncRNA LRK反义基因间RNALAIR)可以通过反式作用机制促进多个LRK基因的表达,从而提高水稻产量。因此进一步解析选择性剪接的LAIR在水稻中的精确调控作用机制具有重要意义。

# 思维导图

#根据原文整理,以原文为准,欢迎指正!












1. lncRNA LAIR选择性剪接的表征

作者之前的文章中鉴定了lncRNA LAIR,它是由LRK基因簇5’末端区域编码的反义转录本。发现了选择性剪接的LAIR亚型克隆了籼稻品种MH63中的九个选择性剪接亚型(LAIR-aLAIR-i)。根据cDNA末端快速扩增RACE分析,最短的亚型LAIR-a1585 bp,而最长的亚型LAIR-i1912 bp。所有亚型都具有相同的转录基因组区域,但由于内含子剪接的多样性而有所不同LAIR外显子标记为E1-E6在不同发育阶段的水稻(籼稻品种 MH63)的所有分析器官中均检测到了这九种亚型,尤其是在幼穗中。九种异构体的相对RNA丰度不同,LAIR-a/-b/-c/-d/-e/-i检测到的水平相对较低,而LAIR-f/-g/-h的丰度相对较高(图1

1. lncRNA LAIR选择性剪接的表征。

(A) LRK1基因的基因组图谱和转录结构以及LAIR的九种选择性剪接亚型。(B) 选择性剪接的LAIR同种型空间和时间表达的分析。


2. 所有选择性剪接的LAIR亚型均具有生物学功能

先前的研究表明LAIR-h显著促进LRK1表达,但不影响LRK3转录。这一发现促使作者研究选择性剪接LAIR亚型的生物学功能。为阐明LAIR亚型LRK表达的调节作用,用LAIR-a–LAIR-i表达载体以及含有LRK启动子驱动的荧光素酶报告基因的载体转化水稻原生质体。LUC/REN信号比表明,所有九种LAIR亚型均显著激活LRK启动子存在差异,LRK3启动子的影响并不显著(图2A)。

接着进行了遗传转化实验,构建了9种亚型的过表达株系。与WT相比,所有过表达植物的初生圆锥花序较大,单株圆锥花序数较多,导致田间实验中单株籽粒总产量大幅增加(图2C-D)。结果表明,LAIR-h的功能效率相对较高,但最短的亚型LAIR-a和最长的亚型LAIR-i的功能效率较低。因此选择LAIR-aLAIR-iLAIR-h进行后续LAIR功能以及选择性剪接的差异分析
随后定量PCRqRT-PCR分析发现所有品系中相对LRK1转录水平显著增加,而LRK3表达水平不受影响。与LRK1启动子激活和表型分析一致,LAIR-h系中LRK1表达水平的增加显著高于LAIR-a/i系(图2B)。综合考虑,这些结果表明所有选择性剪接的LAIR亚型在水稻中都具有生物学功能,但亚型之间的功能略有差异。
2. 选择性剪接的LAIR亚型的生物学功能。

(A) LAIR亚型对LRK基因启动子的调节。(B) 转基因水稻品系中LRK基因表达的qRT-PCR分析。(C) LAIR亚型转基因系的生长性状。(D) WTLAIR-a/i/h过表达转基因水稻植物的表型。


3. 选择性剪接影响LAIROsMOFOsWDR5结合的能力

在之前报道的模型中,LAIR与表观遗传修饰相关蛋白OsMOFOsWDR5相互作用,这与组蛋白标记的变化和LRK1基因组区域的激活转录相关。用编码FLAG标记染色质修饰蛋白(OsMOF-FLAGOsWDR5-FLAG)的序列转化的水稻原生质体的转基因水稻品系,侵染LAIR-aLAIR-iLAIR-hRIP-qRT-PCR结果显示OsMOFOsWDR5LAIR-a/ i/ h显著结合LAIR-h的结合效率最高LAIR-a/iOsMOF之间的结合效率明显较低(图3A)。这些结果通过纯化蛋白质的体外实验得到验证(图3B)。LAIR-a/i/h结合能力的变异性与LAIR亚型的功能效率一致(图2)。

由于LAIR-a/ i/ h能够结合OsMOFOsWDR5,因此验证了它们是否与邻近LRK1基因座的表观遗传变化相关。ChIP-qRT-PCR结果表明,H3K4me3H4K16acLRK3基因座上未受影响,但在启动子、3非翻译区以及LAIR-a-/i-/h-中的LRK1编码序列中显著富集(图3C)。并且LAIR-h过表达系的LRK1基因座处H3K4me3H4K16ac的富集度略高于过表达LAIR-aLAIR-i系。因此推测LAIR亚型与OsMOFOsWDR5的差异结合可能会影响LRK1基因座表观遗传修饰的效率。

3. 选择性剪接的LAIR亚型与表观遗传修饰相关蛋白的结合及其对组蛋白修饰的影响。

(A) LAIR-a/i/h表观遗传修饰相关蛋白(OsMOFOsWDR5)进行RIP测定。(B) GST pull-down测定,纯化的OsMOFOsWDR5在体外与LAIR-a/i/hLAIR-h突变体(LAIR-m1LAIR-m2)结合。(C) LRK基因座的ChIP测定。


4. RNA二级结构是LAIR亚型功能分化的重要基础
二级结构对lncRNA功能具有关键影响。正确的折叠结构对于RNA分子的生物学功能是必要的使用RNAfold WebServer进行预测。除LAIR-e/-i外,其他亚型(LAIR-a/-b/-c/-d/-f/-g/-h)具有高度相似的结构(图4A)。具体来说,选择性剪接区域(E2-E3)形成具有多态性基序的独立结构,其余保守序列(E1E4-E6)形成保守基序。
为研究二级结构对选择性剪接的LAIR亚型功能的影响进行RIP分析以研究这些RNA片段与水稻原生质体中OsMOFOsWDR5的结合。结果表明,全长LAIR-h的结合效率最高,LAIR-a-5’/LAIR-h-5’/LAIR-3’的结合效率稍低,LAIR-i-5’的结合效率较低(图4C)。通过水稻原生质体的启动子激活实验来测试这些片段的功能(图4D)。LUC/REN信号比表明LRK1启动子被LAIR-a-5’LAIR-h-5’激活,但不被LAIR-i-5’LAIR-3’激活。表观遗传修饰相关蛋白靶向的LAIR二级结构的结合区域得到进一步证实。LAIR-hRNA结构分为三个主要区域(R1R2R3)。在RIP分析中,OsMOFOsWDR5表现出不同的组合偏好。OsMOF更倾向于与R1结合,而OsWDR5主要与R3结合(图4E)。这些结果进一步证明lncRNA LAIRRNA二级结构比其一级序列更重要。总之,LAIR的选择性剪接改变了预测的lncRNA二级结构,从而影响了LAIR与表观遗传修饰相关蛋白(OsMOFOsWDR5)的结合以及LAIR激活LRK1转录的能力。此外,OsMOFOsWDR5结合到LAIR二级结构的不同区域。
4. 预测的LAIR亚型二级结构和功能区分析。
(A) RNAfold WebServer预测的9LAIR亚型的RNA二级折叠结构。(B) LAIR-a/i/h的序列分割方法示意图(C) 具有LAIR-a/i/h序列片段的蛋白质OsMOFOsWDR5RIP测定。(D) LAIR-a/i/h序列片段对LRK启动子的激活。(E) LAIR-hRNA的结构分为R1R2R3(F) 使用LAIR-hOsMOFOsWDR5蛋白进行DO-RIP测定。


5. lncRNA LAIR选择性剪接参与水稻逆境响应和适应性分化
为了进一步研究lncRNA选择性剪接在水稻适应和进化中的作用,我们进行了基因组群体进化分析。首先亚种群内的平均近交系数Fst显示籼稻(XI)和粳稻(GJ)基因组序列在LAIR启动子区域存在显著的遗传变异(图5A)。LAIR启动子区域在GJ种质中可能受到定向选择或群体扩张,推测其在GJ驯化过程中可能发挥作用(图5B)。GJ水稻中LAIR基因表达水平普遍高于XI,且不同品种间存在差异。XIGJ群体中LAIR的选择性剪接区域存在遗传变异,特别是外显子LAIR-exon3中的一个可变位点,可能与环境适应性有关(图5C-D)。选择性剪接的快速调节有助于响应环境胁迫并有助于植物的环境适应性。因此,在非生物胁迫处理(冷、热、淹、旱和盐)下,检测了籼稻品种MH63中总LAIR9种亚型的表达水平。LAIR总表达水平对所有应激处理均有反应。LAIR表达在冷处理下显著激活,在热应激下显著降低(图5E)。仅在冷和热应激处理下观察到亚型(图5F)。冷处理后,LAIR-a/-b/-c/-d/-e的比例显著下降,LAIR-f/-g/-h/-i的比例增加。在热应激下,观察到相反的趋势。
5. 水稻籼 (XI) 和粳 (GJ) 群体的基因组进化分析,以及LAIR亚型的非生物胁迫反应。
(A, B) LAIR启动子2-kb基因组区域的FstTajimas D分析。(C) 水稻品种中LAIR表达分析。(D) LAIR主要转录区基因组序列的Fst分析。(EF) 非生物胁迫(冷和热)处理下总LAIR和九种亚型的表达水平。














在这项研究中,水稻中lncRNA LAIR的选择性剪接可以产生九种不同亚型。LAIR亚型是通过选择性5’/3’剪接位点和特定内含子的不同组合生成的。所有LAIR亚型都会激活邻近LRK1基因的表达并增强与产量相关的水稻性状。此外,LAIR亚型与表观遗传修饰相关蛋白OsMOFOsWDR5的结合能力存在细微差异,影响LRK1位点H4K16acH3K4me3的富集,从而微调LRK1表达和产量相关性状的调控。这些结合差异可能是由选择性剪接导致的RNA二级结构的多态性变化引起的。另外LAIR亚型的组成对非生物胁迫敏感。这些发现表明,LAIR的选择性剪接导致形成功能性转录物群体,精确调节产量相关基因的表达,这可能与环境条件变化下基于表型多态性的作物育种相关。

6. LAIR功能转录物群体的拟议模型。

LAIR功能单元不是单个转录本,而是包含多个选择性剪接同种型的功能转录本群体,所有这些同种型都具有基础活性。LAIR异构体之间在微调活性方面存在细微差异,例如LAIR-h的功能效率高于LAIRaLAIR-i

7. 选择性剪接LAIR亚型功能背后机制的拟议模型。

(A) LAIR微调监管的拟议机制。LAIR的选择性剪接引起RNA二级结构的多态性变化(以LAIRaLAIR-h为例),影响其与表观遗传修饰相关RNA结合蛋白(RBP)的结合能力以及LRK1上组蛋白激活标记的富集水平基因组位点,导致LRK1基因表达和产量相关性状的微调。(B) LAIR可能的lncRNA支架模块。LAIR-h RNA的结构包括三个区域(R1R2R3)。负责H4K16乙酰化的表观遗传修饰蛋白OsMOF主要与包含选择性剪接的R1区域结合。OsWDR5的结合位点集中在保守的R3中,可能通过H3K4三甲基化H3K4me3调节转录。(C) LAIR功能群体的应激敏感反应。研究发现LAIR亚型的组成在非生物胁迫(热和冷)下很敏感。lncRNA LAIR动态支架群体的这种变化可能会产生应激敏感调节。













期刊:The Plant Journal
投稿日期:2023.10.1

接收日期:2024.5.10

发表日期:2024.6.3
评述袁雪宁
校对:高贺升
编辑李敏慧

原文链接(点击“阅读原文”)






END








脑图读文献
一张脑图🧠带你解析实验设计及文章写作思路。 加入我们,锻炼科学思维。 欢迎投稿/转载:mindpapers@163.com
 最新文章