2024年6月，中科院遗传发育所张劲松和周奕华团队在著名期刊The Plant Cell上发表一篇题为CELLULOSE SYNTHASE-LIKE C proteins modulate cell wall establishment during ethylene-mediated root growth inhibition in rice的文章。作者通过分析水稻根细胞壁样式、细胞壁组成和基因表达，发现乙烯诱导细胞壁增厚和细胞壁合成相关基因的表达。创制相关基因的过表达和突变体株系分析表明，OsCSLC2及其同源基因在乙烯诱导的木葡聚糖生物合成中的功能主要在根表皮细胞的细胞壁中。OsCSLC介导的木葡聚糖生物合成可能在水稻根系乙烯响应过程中限制细胞壁延伸和细胞伸长方面发挥重要作用。该研究进一步阐述了植物激素信号与细胞壁的调控关系，增加了人们对水稻和其他作物根系生长可塑性的理解。
![]()
![]()
乙烯作为一种特殊的气态植物激素，在植物生长发育以及适应环境的过程中，都发挥着重要的作用。乙烯可以抑制拟南芥下胚轴和根的生长，加剧顶端弯钩，产生"三重反应"。在拟南芥中，乙烯共有5个受体（ETR1、ETR2、ERS1、ERS2、EIN4），定位于内质网膜上。在细胞核中，转录因子EIN3/EIL1由EBF1/2介导，被泛素化蛋白酶体降解，乙烯信号通路处于沉默或失活状态。植物细胞壁可以提供机械支持，保护植物抵御各种生物和非生物胁迫，决定细胞形态建成，是自然界最丰富的可再生资源。细胞壁通常由大分子多糖、高度糖基化的蛋白质和木质素组成，是一个复杂的、动态的多糖网络。初级细胞壁被认为是一种可塑性结构，其特性与软化、松散、延伸、弯曲和强化有关，从而调节植物细胞的生长可塑性。与动物不同，植物表现出固着生长，在环境变化过程中表现出很强的生长可塑性。外界信号通过乙烯等植物激素的信号影响根系生长。尽管乙烯信号途径已被广泛研究，但细胞生长的下游事件并不十分清楚，特别是在水稻等作物中。本文作者通过组织染色、细胞壁成分分析、RNA-seq、CRISPR-Cas9基因编辑技术、UPLC-MS、LUC等研究，发现乙烯介导的细胞壁变化抑制水稻根细胞的扩展和伸长，从而影响其根系生长的可塑性。作者发现，乙烯处理能够抑制野生型水稻幼苗根伸长，而Oseil1突变体的根长不受影响(图1A)。作者对根进行了石蜡包埋切片和染色分析，确定了乙烯影响根的生长与细胞大小和细胞分裂(图1,B~G)。在WT中，乙烯显著抑制表皮细胞和皮层细胞(图1,B和C)的细胞长度，而在Oseil1突变体中，细胞长度没有受到显著影响。表明乙烯通过限制细胞伸长来抑制根系生长。通过横切面分析根系的径向生长状况(图1D)，作者发现乙烯处理显著增加了WT根的直径，但不影响Oseil1根的直径(图1E)。对皮层中的细胞层数和细胞数进行统计(图1,F和G)发现，在WT和Oseil1中都没有显著变化。通过EdU染色发现乙烯促进了WT和Oseil1根近端分生组织中荧光的强度和面积的增加(图1,H到K)。为了探究乙烯如何抑制根细胞纵向伸长和增加横向扩展，作者通过透射电镜观察乙烯处理后WT根表皮、厚壁组织层和皮层细胞的细胞壁增厚，而Oseil1根(图1L)相同细胞类型的细胞壁没有明显变化。图1.乙烯调控水稻根细胞伸长。(A)Oseil1幼苗对乙烯的反应根长。(B)根的石蜡包埋纵向切片。(C)表皮和皮层细胞对乙烯的反应长度。(D)根的石蜡包埋横截面。(E)根对乙烯的横向扩张反应。(F,G)皮层中细胞层数F)和细胞数G)。(H)通过EdU染色分析根分生组织。(I)活性分生细胞的分布由Azide488荧光的总面积指示。(J)通过总Azide488荧光强度估计的分生细胞数。(K)通过平均Azide488荧光强度估计的分生细胞分裂活性。(L)乙烯对根细胞壁厚度的影响。2、OsCCSLC2及其同源基因参与水稻根系的乙烯响应结果表明，在根系乙烯响应过程中细胞壁的增厚意味着细胞壁组成的动态变化，作者测定了乙烯处理的根系样品的单糖组成。发现乙烯极大地增加了WT中木糖残基的数量，但Oseil1中不受影响。通过RNA-seq分析，作者鉴定了在野生型中对乙烯有响应但在Oseil1突变体中无响应的基因(图2A)。乙烯处理上调了根尖中OsCESA3、4、7、9和4个CESA-LIKE(CSL)基因(OsCSLC2、OsCSLD1、OsCSLF8和OsCSLH1)的转录水平(图2B)。为了研究上述CESAs和CSLs的功能，作者构建了过表达的转基因植株。与WT幼苗相比，OsCSLC2-OE幼苗是唯一对乙烯响应的根系生长显著变化的成员(图2C)。Oscslc2-1和Oscslc2-2两个突变体在环境空气中的根都较短，但乙烯处理组的根相对于WT组更长(图2D)。纯合四突变体Oscslc1239根变得更短，但对乙烯的作用更不敏感(图2E)，表明这些OsCCSLCs在水稻根系乙烯响应中存在功能冗余。此外，在无乙烯和有乙烯存在的情况下，根均比WT细(图2F)。在其他突变体中，也观察到根长对乙烯的作用更不敏感(图2G)。为了研究CSLCs在拟南芥中是否具有保守的功能，作者探究了突变体的乙烯响应，结果表明多突变体的下胚轴根据其长度和相对生长量表现出对乙烯的不敏感(图2H和I)。这些结果表明OsCSLC2及其同源基因在根系乙烯响应中发挥积极作用，也是根系正常生长所必需的。图 2. CSLC家族成员在水稻和拟南芥中对乙烯反应的参与。(A)RNA-seq。(B)RT-qPCR。(C)乙烯处理下OsCSLC2-OE的根长。(D)乙烯处理下Oscslc2突变体的根长。(E)Oscslc1239多突变体的根长。(F)乙烯处理下Oscslc1239根的直径。(G)Oscslc多突变体的根长。(H)乙烯处理下Atcslc突变体在拟南芥中的顶端弯曲响应。(I)乙烯处理下Atcslc突变体的下胚轴长度。3、乙烯诱导的木葡聚糖在根细胞壁中的积累依赖于OsCSLCs和OsEIL1通过水稻亚细胞定位实验，作者证明OsCSLC2是一个定位于高尔基体的蛋白(图3A)。为了探究OsCSLC2在水稻根系乙烯响应中的功能，作者通过超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)，发现在乙烯的作用下OsCSLC2-OE植株根细胞壁中XyG-oligo水平升高(图3B和C)，而Oscslc2-2突变体显著低于野生型(图3D和E)。在四突变体Oscslc1239的根细胞壁中，XyG水平均低于WT(图3F和G)。为了研究XyG在根细胞壁中的积累，作者通过免疫检测发现在WT中，乙烯诱导的XyG主要积累在伸长区和分化区的细胞壁中(图3H)，Oseil1突变体中乙烯诱导的XyG水平低于野生型(图3I和J)，免疫检测发现Oseil1表皮细胞壁中不存在乙烯诱导的XyG合成(图3K)。以上表明乙烯诱导的XyG积累主要发生在表皮细胞壁，当木葡聚糖酶XEGP被施加到OsEIL1-OE植株的根部时，短根表型得到缓解(图3L )，表明XyG对于这种根系生长的抑制是至关重要的。图 3. OsCSLCs合成细胞壁中的XyG在根系乙烯响应中抑制细胞伸长。(A)OsCSLC2的亚细胞定位。(B, D, F, 和 I)通过色谱-质谱联用仪分析了（OsCSLC2-OE,B）、Oscslc2（D）、Oscslc1239（F）和Oseil1（I）幼苗根部细胞壁对乙烯反应的木葡聚糖衍生寡糖（XyG-oligo）。(C, E, G, 和 J)UPLC-MS测定幼苗根部细胞壁中XyG-oligo的水平。(H, K)免疫检测Oscslc1239和Oseil1乙烯诱导的根部的细胞壁XyG检测。(L)木葡聚糖酶对OsEIL1过表达幼苗根生长的影响。4、OsEIL1在根系乙烯响应中直接上调OsCSLC2作者统计发现，OsCSLC2过表达部分抑制了Oseil1植株的根系生长(图4A )。OsCSLC2的突变显著抑制了OsEIL1-OE幼苗的根的表型(图4B)。这些结果表明OsCSLC2可能作用于乙烯信号途径中的主转录因子OsEIL1的下游，从而抑制水稻幼苗的根系生长。通过RT-qPCR，证明OsCSLC2在Oseil1中没有被转录诱导(图4C)。通过LUC证明OsEIL1对OsCSLC2启动子活性的促进作用(图4D)。EMSA和ChIP-qPCR结果表明OsEIL1与OsCSLC2直接结合(图4E和F)。通过RT-qPCR，作者测定了5个CSLC同源基因、6个木葡聚糖木糖基转移酶基因XXTs、8个木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶蛋白基因XTHs在根尖响应乙烯的表达情况(图4G到I)。图4 . OsEIL1在根的乙烯响应中调控OsCSLCs等XyG代谢相关基因的表达。(A)Oseil1背景下OsCSLC2过表达植株(OsCSLC2-OE)的根长对乙烯的响应。(B)OsEIL1-OE植株在Oscslc2背景下的根长。(C)OsCSLC2在Oseil1中响应乙烯的表达。(D)水稻原生质体中OsEIL1对OsCSLC2启动子活性的调控作用。(E)EMSA。(F)ChIP-qPCR。(G)OsXXT1、OsGT3-OsGT7(H)和OsXTHs(I)在根中响应乙烯时的相对表达量。作者前期鉴定了一个乙烯不敏感突变体Ostar2，可以被OsEIL1直接上调，介导对根系生长的抑制。UPLC-MS分析表明，Ostar2根细胞壁在空气和乙烯诱导的XyG水平均低于WT(图5,A和B)。为了研究生长素对XyG合成的影响，作者对野生型进行了NAA处理，发现NAA处理显著抑制了根的生长(图5C)，总XyG和XyG-oligo的水平均升高(图5D和E)，NAA作用于OsCSLC2-OE和Oscslc2植株，发现它们的根对NAA的敏感性分别增加和降低(图5F)。这些结果表明OsCSLC2及其介导的XyG在根细胞壁中的积累也有助于生长素诱导的水稻根系生长抑制。图5.生长素抑制根系生长还依赖于细胞壁中XyG的合成。(A,B)Ostar2根部细胞壁中的木葡聚糖衍生寡糖测定。(C)生长素处理下的根长。(D,E)生长素处理后根部细胞壁中的XyG-oligo测定。(F)生长素处理下OsCSLC2-OE和Oscslc2幼苗的根长。6、在水稻根系乙烯响应中，乙烯和生长素共同调控OsCSLC2的表达为了研究OsCSLC2与OsTAR2的遗传互作关系，作者创制了Ostar2背景下OsCSLC2-OE株系，与WT植株相比，Ostar2植株的根在空气中更长，乙烯处理后没有变化。过表达OsCSLC2显著降低了Ostar2植株的根长(图6A)，表明OsCSLC2在根系乙烯响应中位于OsTAR2的下游，OsCSLC2在Ostar2根尖中不受乙烯诱导(图6B)。通过NAA处理发现根系OsCSLC2表达上调(图6C)。为了探究了生长素途径的其他组分是否参与了OsCSLC2的乙烯调控，作者测定OsmiR393a -OE、OsmiR393b-OE和Ospin2根中OsCSLC2的表达受低于WT根(图6D)，表明乙烯诱导的OsCSLC2表达上调需要生长素途径的协助。为了检测了OsIAA1，9，21，31对OsCSLC2启动子活性的影响，作者进行蛋白质免疫印迹，结果表明OsIAA1和OsIAA9对OsCSLC2的调控起促进作用，OsIAA21和OsIAA31对OsEIL1的调控起抑制作用(图6E)。通过NAA处理，作者发现OsCSLC2在NAA处理的Oseil1根尖中表达被上调(图6F)。通过EMSA，作者发现OsARF4，7，8，23促进了OsCSLC2启动子的活性(图6G)。图 6. 乙烯途径和生长素途径协同调节OsCSLC2的表达。(A)在Ostar2背景下OsCSLC2过表达幼苗对乙烯的根长变化。(B)Ostar2根尖对乙烯的反应中OsCSLC2的表达。(C)对生长素的反应中OsCSLC2的表达。(D)扰乱生长素途径对乙烯诱导OsCSLC2表达的影响。(F)在Oseil1中生长素诱导的OsCSLC2表达。(G)OsARFs对OsCSLC2启动子活性的调节作用。在本研究中，作者发现乙烯途径和乙烯促进的生长素途径共同调节代表性的OsCSLC2以及其他与XyG代谢相关的基因的表达，促进细胞壁中XyG的积累和后合成修饰，从而抑制水稻幼苗根伸长，而生长素也通过其信号传导途径调节XyG代谢。模式图 OsCSLC在乙烯介导的根生长抑制途径中调节细胞壁的形成
