=== 研究背景 ===
# 思维导图： #根据原文整理，以原文为准，欢迎指正！ |
=== 研究结果 ===
1. PagJAZ5的组织特异性表达模式
作者首先研究杨树中JAZ基因家族的功能，鉴定出了12个JAZ基因。基于AspWood数据库中JAZ基因表达分析，作者发现PagJAZ5，PagJAZ6，PagJAZ7和PagJAZ10在韧皮部、形成层和发育中的木质部中表现出高水平的表达。其中PagJAZ5特异在形成层和发育中的木质部中高表达，而PagJAZ6，PagJAZ7和PagJAZ10在韧皮部和成熟木质部中高度表达。为探究JAZ基因在木材形成中的功能，本研究根据组织表达分析结果选择PagJAZ5为本研究主要目标基因，并对其功能展开分析。
首先，为精确定位PagJAZ5基因的组织表达特异性，作者克隆了PagJAZ5启动子片段，并创建了PPagJAZ5::GUS稳定转基因杨树，发现GUS信号主要集中在形成层、发育中的韧皮部和发育中的木质部区域(图1a,b)。这表明杨树PagJAZ5可能参与形成层活性与木质部分化过程的调控。为了进一步揭示PagJAZ5的生化特性，作者通过亚细胞定位构建了35S::GFP-PagJAZ5和35S::GFP，观察到PagJAZ5是一个细胞核定位的蛋白质。与此同时，瞬转35S::GFP-PagJAZ5的烟草叶片表皮细胞在受到JA处理时，GFP-JAZ5的荧光信号明显减弱(图1c,d)，而当Ja域的五个N端氨基酸被删除(标记为PagJAZ5m)时，JA诱导的JAZ降解被抑制(图1c,d)，这表明Jas域的五个N端氨基酸对JA介导的PagJAZ5降解至关重要。
图1. PagJAZ5组织表达特异性分析。(a，b)杨树茎中PagJAZ5启动子驱动的GUS报告基因的组织染色。(c，d)瞬时表达GFP融合的PagJAZ5和GFP融合的PagJAZ5m蛋白的烟草叶片在JA处理前后的荧光强度分析。
为了进一步确定PagJAZ5在木材形成中的功能，作者使用CaMV35S启动子过表达两种形式的PagJAZ5基因，即过表达编码正常PagJAZ5和过表达删除了五个N-末端氨基酸的PagJAZ5m。分别获得了15个PagJAZ5 OE和21个PagJAZ5m OE转基因系。基于RT-qPCR实验对PagJAZ5表达进行分析并分别选择PagJAZ5-4和PagJAZ5-13，PagJAZ5m-18和PagJAZ5m-22开展进一步研究。对生长的一个半月大杨树WT与转基因杨树进行表型分析，发现与WT相比，PagJAZ5m过表达株系的植物高度显著增加，而PagJAZ5过表达株系的植物则表现出与WT相似的株高(图2a)。为探究PagJAZ5对次生生长过程中的木质部发育的影响，作者对观察了一个半月大的过表达转基因和WT植株的基部茎的横截面开展解剖学分析，发现与WT相比，PagJAZ5和PagJAZ5m过表达植株的木质部宽度显著增加，其中PagJAZ5m过表达植株的增加最为明显。与此同时，PagJAZ5m OE株系的形成中的形成层和发育中的木质部层数增加，但PagJAZ5 OE株系没有显著变化与WT相比(图2d-g)。
图2. PagJAZ5过表达转基因杨树表型分析。(a) 1.5月龄野生型(WT)、过表达PagJAZ5(JAZ5-4与JAZ5-13)和PagJAZ5m(JAZ5m-18与JAZ5m-22)转基因杨树株系表型。(b,c)与(a)对应的WT、JAZ5 OE和JAZ5m OE株系株高(b)和基径(c)的测定。(d) 1.5月龄WT、JAZ5 OE和JAZ5m OE系基茎横切面观察。(e) WT、JAZ5 OE和JAZ5m OE植株形成层细胞层数。(f) WT、JAZ5和JAZ5m植株木质部发育细胞层数。(g) WT、JAZ5 OE和JAZ5m OE植株形成层细胞层数和发育中的木质部细胞层数。
考虑到JAZ基因的功能冗余性，作者选择了可共同编辑PagJAZ5及其同源基因PagJAZ2和PagJAZ3的三个靶点，并创制三个基因共同敲除的突变体。通过对杨树突变体的鉴定发现，所有获得的植株在PagJAZ3中没有突变，但在PagJAZ2与PagJAZ5中具有纯合或双等位基因突变。为此，作者选择了三个突变体(jaz5-14，jaz5-25和jaz5-26)进行后续的表型分析，发现仅在PagJAZ5的N-末端缺失了八个氨基酸的jaz5-25没有表型变化，而jaz5-14和jaz5-26与WT植株相比，植株高度和茎直径显著减少(图3a-c)。解剖分析显示，与WT植株相比，jaz5-14和jaz5-26植株的形成层分裂活性下降，木质部宽度减小(图3d-g)。以上研究结果均表明，PagJAZ5正调控形成层活性。
图3. Pagjaz5突变体表型分析。(a) 2月龄野生型(WT)和突变型植株的表型。+/-，杂合突变体；-，突变;+，没有突变。(b,c) WT与jaz5-14、jaz5-25、jaz5-26植株株高(b)和茎粗(c)的测定。(d) 2月龄WT和jaz5-14、jaz5-25、jaz5-26基茎横切面。(e) WT和突变体植株形成层细胞层数。(f)WT和突变型植物木质部细胞发育层数。(g) WT和突变体植株形成层细胞层数和发育中的木质部细胞层数。
为了阐明PagJAZ5在木质部活性和木质部分化调控中的遗传基础，我们对PagJAZ5 OE、PagJAZ5m OE和WT植株进行了转录组分析。主成分分析(PCA)显示，同一基因型的样本聚集在一起，并且不同基因型之间的聚类明显分开，说明数据具有可靠性。根据选择标准(|log2 fold change (FC)| ≥1和false discovery rate<0.05)，在PagJAZ5m OE和WT植株之间获得了1669个差异表达基因(DEGs)，其中大部分基因表达下调，这与JAZ作为转录抑制子的功能相对应。对DEGs进行KEGG分析显示，显著差异表达基因主要集中在“次生代谢物的生物合成”、“代谢途径”、“类黄酮生物合成”和“玉米素的生物合成”等代谢途径。在“玉米素的生物合成”途径中，DEGs包括细胞分裂素代谢和信号传导基因，如拟南芥的CKX1、LOG3、Type-A RR和AHP的同源基因。结果表明，PagJAZ5与细胞分裂素信号传导途径中的基因之间存在强烈的相关性。
图4.野生型(WT)、PagJAZ5m OE和突变体茎中细胞分裂素含量分析。(a) WT、JAZ5m-18、JAZ5m-22和jaz5-26植物茎中细胞分裂素(iP和tZ)的免疫荧光分析。(b,c) WT、JAZ5m-18、JAZ5m-22和jaz5-26植株茎中iP(b)和tZ(c)相对平均绿色荧光指数。
随后，作者利用qRT-PCR技术对CKXs及其同源基因在WT及PagJAZ5异常表达的转基因杨树茎中的表达水平展开分析，发现拟南芥CKX6的同源基因PagCKX6.1和PagCKX6.2在PagJAZm OE植株中下调，而在jaz5-14和jaz5-26突变体中上调。CKX是细胞分裂素降解的限速酶，在细胞分裂素的稳态中起关键作用。为探究CKXs表达水平的改变是否影响细胞分裂素的浓度，我们在WT、PagJAZ5m OE和jaz5-26茎中使用反式玉米素(tZ)和异戊烯基腺嘌呤(iP)这两种主要的生物活性细胞分裂素进行免疫组化实验。与WT植株相比，PagJAZ5m OE植株靠近形成层的韧皮部中iP和tZ的荧光信号显著增加(图4a-c)。相反，在jaz5-26突变株中，iP和tZ的荧光信号均显著降低(图4a-c)。采用UPLC-ESIMS/MS系统定量测定细胞分裂素含量。结果表明，与WT相比，jaz5-26植株的iP和tZ浓度显著降低，而JAZ5m OE植株的iP和tZ浓度显著升高。以上结果表明，PagJAZ5可以下调CKX的表达，增加细胞分裂素的浓度，从而促进形成层的活性和木质部的发育。
与WT植物相比，PagJAZ5m OE植物中PagRR5(Type-A RR)下调表达。作者进一步确定了PagRR5在茎中不同节间及发育中的木质部和韧皮部中的表达模式，并发现其在成熟节间的表达较高，在发育中的木质部中达到峰值(图5a)。此外，作者创建了在PagRR5启动子(PpagRR5::GUS)启动GUS报告基因表达的转基因植株，并对第10个节间的横截面进行了GUS染色发现GUS信号主要集中于发育中的木质部和韧皮部中，在形成层区域较弱(图5b)，表明PagRR5的表达部分重叠于PagJAZ5。为了阐明PagRR5在木质部形成中的功能，我们设计了靶向PagRR5及其同源基因PagRR4的一个sgRNA靶位点，创制了双基因编辑的突变体。同时，鉴定出了PagRR5的单基因突变体，命名为rr5-4。在两个月大的rr5-4突变体中测量了植物的高度和基部茎直径。与WT相比，rr5-4突变体在植物高度上没有显著差异，但其基部茎直径显著增加(图5d-f)。此外，茎的解剖学分析显示，rr5-4突变体促进了木质部的发育，导致木质部宽度增加(图5g-j)。以上结果表明，PagRR5负调控杨树次生生长过程中木质部分化。
图5. PagRR5在84K杨树中的表达谱及rr5-4突变体的表型分析。(a) PagRR5在不同组织中的表达水平。(b,c)杨树茎中由PagRR5启动子驱动的GUS报告基因的组织学染色。对1月龄杨树茎进行GUS染色。(d) 2月龄野生型(WT)和rr5-4突变株的表型。(e,f) WT和rr5-4突变株株高(e)和茎粗(f)的测定。(g) 2月龄WT和rr5-4突变株直径的横切面分析。(h-j) WT和rr5-4突变体茎维管组织中形成层细胞层数。
Type-A RRs是细胞分裂素信号传导的负调节因子，其下调可增强细胞分裂素信号传导，并进一步调控形成层活性和木质部分化。为了阐明JAZ5对A-RR的调控机制，作者借助酵母双杂交(Y2H)实验发现，PagMYC2a、PagMYC2b与PagJAZ5相互作用。有趣的是，PagWOX4b也被确定为可与PagJAZ5相互作用的蛋白质，并通过Y2H实验、荧光素酶互补实验和双荧光素互补实验进一步验证了PagJAZ5与PagWOX4b之间的直接相互作用(图6a-c)。为了评估这种相互作用对type-A RR调控的影响，我们在烟草叶片中进行了瞬时转录活性分析。结果显示，当分别转化PagJAZ5、PagJAZ5m和PagWOX4b效应器与PagRR5报告基因共转化时，LUC活性被抑制，而PagJAZ5可以增强PagWOX4b对PagRR5的抑制作用(图6d-g)。随后，作者创制了PagWOX4b过表达系，并选择了WOX4b-2和WOX4b-3两个株系进行进一步的表型分析(图6h)。茎的横截面显示，与WT相比，WOX4b OE植物的形成层和发育中的木质部层数增加。此外，作者通过qRT-PCR分析了PagWOX4b过表达转基因株系中PagRR5的表达水平，结果显示PagRR5的表达水平下调，表明PagWOX4b能够抑制PagRR5的表达(图6i)。类似的方法被用来评估PagJAZ5和PagMYC2a/b相互作用对Type-A RR调控的影响。LUC实验结果表明，PagMYC2a能够激活PagRR5的表达(图7a，b)。然而，当PagRR5报告基因与PagMYC2a和PagJAZ5或PagJAZ5m共转化时，活性被抑制(图7c-e)，表明PagJAZ5能够抑制PagMYC2a对PagRR5的诱导作用。
已有研究证明MYC2蛋白通常结合下游靶基因启动子中的保守G-box(CACGTG)元素或其变体，以调控下游基因的表达。通过分析启动子序列，发现在PagRR5基因起始密码子的上游-403bp到-408bp范围内存在一个CACGTG元件。为进一步分析PagMYC2a是否能直接结合到PagRR5启动子区域，我们使用带有上述元件的PagRR5启动子片段进行了电泳迁移实验(EMSA)，结果发现组的GST-PagMYC2a蛋白能够直接结合到探针上(图7f)。为了检测PagMYC2a对PagRR5的激活是否通过结合G-box元件实现，我们在烟草叶片中进行了瞬时表达实验。结果显示，PagMYC2a显著上调了PagRR5pro:LUC的表达，而当G-box突变时，驱动激活显著降低(图7g)。这些结果表明，PagMYC2a主要通过结合启动子中的G-box直接调控PagRR5的表达。以上研究结果表明，PagJAZ5分别与PagMYC2a、PagWOX4b相互作用来抑制PagRR5的表达进而调控形成层活性。
图6. PagJAZ5蛋白通过与WOX4b相互作用抑制PagRR5的表达。(a-c)酵母双杂交实验(a)、荧光素酶互补实验(b)、双分子荧光互补实验(c)表明PagJAZ5与WOX4b互作。(d) PagJAZ5、PagJAZ5m和PagWOX4b转录调控活性分析中使用的效应子和报告子示意图。(e) PagWOX4b可以抑制PagRR5的表达，并且PagJAZ5与PagWOX4b的相互作用增强了这种抑制作用。(f,g) PagJAZ5增强了PagWOX4b对烟草叶片中PagRR5启动子-LUC活性的抑制(f)荧光强度的定量分析(g)。(h) PagWOX4b过表达植株中PagWOX4b的表达水平。(i) PagWOX4b OE植物中PagRR5表达的逆转录定量聚合酶链反应分析。
这篇文章主要研究了杨树中PagJAZ5对形成层活性的调节作用。形成层是木本植物次生生长中的重要组织，PagJAZ5能够通过协调调节细胞分裂素的浓度和信号传导影响形成层的活性进而影响木质部发育。这项研究揭示了PagJAZ5在杨树中的新功能，为理解植物次生生长调控机制提供了重要见解。
期刊：New Phytologist
原文链接（点击“阅读原文”）
～ The End! ～
