2024年6月四川大学张胜教授团队在植物学高水平期刊Plant Physiology上发表了题为Dissociation of transcription factor MYB94 and histone deacetylases HDA907/908 alleviates oxidative damage in poplar的论文。作者选取了先前报导过的与植株抗旱相关的转录因子PtrMYB94，在干旱胁迫时，PtrMYB94与组蛋白脱乙酰酶PtrHDA907/908的相互作用减弱，从而松弛染色质结构并促进RNA聚合酶II与PtrECPP44启动子的结合，使得PtrECPP44表达增强，减轻植株细胞氧化损伤，呈现抗旱表型。本研究为杨树抗逆性分子育种提供了新的参考。
=== 研究背景 ===
随着全球气候变化日益加剧，干旱成为了木材作物生长中面对的最主要问题之一。干旱会扰乱光合电子传递，导致活性氧（ROS）过度积累，引起细胞膜损伤，产生大量丙二醛（MDA），抑制细胞正常生命活动，甚至导致植株死亡。杨树是对干旱胁迫响应最敏感的木本植物之一，因此，发掘杨树抗旱的相关分子机制十分重要。PtrMYB94转录因子先前被报道参与了毛果杨的干旱胁迫。但是对于其具体作用的分子机制目前仍不清楚。
# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1. PtrMYB94通过减少ROS调节耐旱性
在先前的研究中，PtrMYB94已经被证明了和植株抗旱相关。为了进一步探究PtrMYB94调控毛果杨耐旱的机制，作者创制了两个PtrMYB94-OE过表达株系。经过干旱处理，作者发现PtrMYB94-OE呈现了明显的抗旱表型（图1A-B）。过表达植株叶片的氧化程度、H2O2、O2、丙二醛（MDA）含量和相对漏电率（REL）均显著低于野生型，同时超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性显著增加，谷胱甘肽（GSH）含量降低（图1C），作者推测这可能导致了H2O2和O2的降低。接着，为了明确PtrMYB94参与抗旱的分子机制，作者选取了PtrMYB94-OE过表达株系、野生型株系、野生型干旱胁迫株系进行了转录组测序。结果表明，大量基因受到了PtrMYB94和干旱胁迫的同时调控（图1D）。对这些基因Go分析显示，下调的基因主要涉及光合作用，而上调的基因主要涉及水响应（图1E-F）。在这些候选基因中，作者选取了PtrECPP4，该基因在拟南芥中已经被报道通过参与ABA通路调节植株耐旱性。RT-qPCR结果显示，PtrECPP44在受到10% PEG和50 μM外源ABA的诱导时波动趋势与PtrMYB94相似（图1G）。因此，作者推测PtrMYB94可能通过转录调控PtrECPP44等下游基因来促进毛果杨的耐旱性。
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图1：（A-B）PtrMYB94-OE耐旱性较野生型显著提升。（C）过表达植株H2O2、O2、MDA、REL含量降低，SOD、POD含量增加。（D）在PtrMYB94-OE和干旱野生型中共同上调2352个DEG。（E-F）Go分析显示下调的基因主要涉及光合作用，上调的基因主要涉及水响应。（G）PEG和ABA处理下PtrECPP44表达趋势和PtrMYB94相似。
2. PtrMYB94直接激活PtrECPP44增强毛果杨耐旱性为了验证PtrMYB94是否可以调节PtrECPP44的转录，作者使用PtrECPP44启动子构建了双荧光素酶表达载体。作者发现，PtrMYB94会激活PtrECPP44的启动子（图2A-B），这表明了PtrMYB94会调控PtrECPP44的转录。先前的研究中已经报道了MYB类转录因子的结合位点包含MYBR类顺式作用元件，而作者在PtrECPP44的启动子上发现了MYBR1和MYBR2两个结合元件，同时酵母单杂也证实PtrMYB94与PtrECPP44启动子的两个元件结合，并且与MYBR2的结合能力较强（图2C）。
接着，为了进一步确定PtrMYB94与PtrECPP44启动子的结合情况，作者在使用野生型和PtrMYB94-OE材料进行了ChIP-qPCR。作者在PtrECPP44启动子上设置了P1（MYBR2）、P2（无MYB结合位点）、P3（MYBR1）三个位点进行实验。结果显示，在PtrMYB94-OE中，PtrMYB94在PtrECPP44启动子的P1区富集度高于野生型，而在P2区和P3区富集度与野生型无显著差异（图2D）。同时，作者还创制了PtrECPP44-OE的过表达植株，转基因植株在干旱胁迫下呈现了和PtrMYB94-OE材料相似的抗旱表型。综上，作者推测PtrMYB94可能通过激活PtrECPP44的转录增强毛果杨的抗旱性。
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图2：（A-B）双荧光素酶报告显示PtrMYB94的表达激活PtrECPP44的启动子。（C）酵母单杂显示PtrMYB94与PtrECPP44启动子的两个MYBR类元件结合。（D）ChIP-qPCR显示PtrMYB94在PtrECPP44启动子的P1区（MYBR2）富集度较高。（E-F）PtrECPP44-OE的过表达植株呈现和PtrMYB94-OE材料类似的抗旱表型。3. PtrMYB94与PtrHDA907和PtrHDA908互作先前的研究提到，PtrMYB94可能会通过募集一些蛋白质来改变PtrECPP44启动子区域的染色质结构，从而激活其转录。PtrHDA907是HDAC亚家族RPD3/HDA1的成员，是PtrMYB94的潜在互作蛋白之一（图3A-B）。为了验证PtrMYB94是否与HDAC家族中的其他成员互作，作者进行了酵母双杂实验。结果显示PtrMYB94可以与PtrHDA907和PtrHDA908特异性互作（图3C）。蛋白质共定位结果表明，PtrHDA907的信号募集在细胞核中，而PtrMYB94加强了PtrHDA907的核定位信号；PtrMYB94和PtrHDA908的信号则位于细胞核和细胞质中（图4A）。BiFC的结果也显示PtrMYB94和PtrHDA907的信号在细胞核中，PtrMYB94和PtrHDA908则在细胞核与细胞质中（图4B），这与上述结果一致。Spilt-Luc测定进一步表明，PtrMYB94和PtrHDA907/908在植物体内互作（图4C）。接着，为了探究具体互作的结构域，作者分别对PtrHDA907/908和PtrMYB94的结构域进行了拆分并进行了酵母双杂测定。结果显示，PtrHDA907/908的HDAC基序主要与PtrMYB94 C端的非DNA结合结构域互作（图4D）。经由上述结果，作者推测，PtrMYB94可能在非DNA结合区将PtrHDA907/908募集到PtrECPP44的启动子上激活其转录。![]()
图3：（A-B）PtrHDA907是PtrMYB94的潜在互作蛋白。（C）酵母双杂显示PtrMYB94与PtrHDA907和PtrHDA908互作。
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图4：（A-B）蛋白质共定位和BiFC显示PtrMYB94和PtrHDA907的信号在细胞核中，PtrMYB94和PtrHDA908则在细胞核与细胞质中 （C）Split-Luc显示PtrMYB94和PtrHDA907/908体内互作 （D）PtrHDA907/908的HDAC基序主要与PtrMYB94 C端的非DNA结合结构域互作。
4.PtrHDA907和PtrHDA908在干旱胁迫中发挥负调控作用
接下来，为了进一步明确PtrHDA907和PtrHDA908的生物学功能，作者创制了PtrHDA907-OE和PtrHDA908-OE的过表达植株以及ptrhda907-ko和ptrhda908-ko的突变体植株。作者发现，PtrHDA907-OE和PtrHDA908-OE过表达植株的干旱耐受性显著降低，而ptrhda907-ko和ptrhda908-ko的干旱耐受性则显著提升（图5A、图6A）。同时，PtrHDA907-OE和PtrHDA908-OE中的H2O2含量和O2产率显著增加，而ptrhda907-ko和ptrhda908-ko叶片中的H2O2含量和O2产率显著减少（图5B、图6B）；相应地，PtrHDA907/908-OE中MDA含量、REL水平、SOD和POD活性等生理生化指标均与ptrhda907-ko和ptrhda908-ko呈现出相反的趋势（图5C-D、图6C-D）。上述结果表明，PtrHDA907和PtrHDA908在干旱胁迫中发挥负调控作用。![]()
图5：（A）干旱胁迫下PtrHDA907-OE不耐旱，和ptrhda907-ko表型相反.（B）干旱后PtrHDA907-OE植株H2O2和O2的积累多于ptrhda907-ko（C-D）PtrHDA907-OE的MDA含量、REL水平、SOD和POD活性等生理生化指标均与ptrhda907-ko趋势相反。![]()
图6：（A）干旱胁迫下PtrHDA908-OE不耐旱，和ptrhda908-ko表型相反。（B）干旱后PtrHDA908-OE植株H2O2和O2的积累多于ptrhda908-ko（C-D）PtrHDA908-OE的MDA含量、REL水平、SOD和POD活性等生理生化指标均与ptrhda908-ko趋势相反。5.干旱胁迫降低PtrHDA907/908对PtrECPP44转录的抑制作用
为了验证PtrHDA907/908和PtrECPP44转录调控的关系，作者进行了RT-qPCR。结果显示PtrECPP44的表达在PtrHDA907/908-OE中显著下调，而在ptrhda907/908-ko中显著上调，并且PtrECPP44在干旱胁迫下的表达显著上调（图7A-B）。为了进一步明确PtrHDA907/908在不同水分条件下对PtrECPP44调节的差异，作者先进行了Split-Luc实验，并发现PEG处理显著降低了PtrHDA907/908与PtrECPP44的结合（图7C）。同时体外的Pull-down也表明，添加PEG缓冲液会减少下拉的PtrMYB94蛋白量（图7D），这表明PtrHDA907/908和PtrMYB94的互作因干旱胁迫而减弱；此外，免疫印迹分析表明，PEG处理后毛果杨叶片中PtrHDA907/908的蛋白水平显著降低，而PtrMYB94的蛋白水平显著增加（图7E）。综上，作者推测，在水分充足的条件下，PtrMYB94募集PtrHDA907/908来抑制PtrECPP44表达。相反，在干旱胁迫条件下，PtrHDA907/908-PtrMYB94复合物的解离则导致PtrECPP44表达上调。![]()
图7：（A-B）PtrECPP44的表达在PtrHDA907/908-OE中显著下调，而在ptrhda907/908-ko中显著上调，干旱胁迫会造成PtrECPP44表达上调。（C）Split-Luc显示PEG处理显著降低了PtrHDA907/908与PtrECPP44的结合。（D）Pull-down表明添加PEG缓冲液会减少下拉的PtrMYB94蛋白量。（E）PEG处理后PtrHDA907/908的蛋白水平显著降低，PtrMYB94的蛋白水平显著增加。6.干旱胁迫下PtrHDA907/908降低PtrECPP44启动子组蛋白H3的脱乙酰作用
为了探究PtrHDA907/908调节PtrECPP44表达的分子机制，作者还测定了PtrHDA907/908的组蛋白脱乙酰化活性。与对照相比，PtrHDA907/908-OE中的H3K9/K14/K27Ac水平显著降低，而ptrhda907/908-ko中水平升高（图8A-B、图9A-B）。为了验证PtrHDA907/908是否通过调节启动子处的H3乙酰化水平来抑制PtrECPP44转录，作者使用了H3K9Ac、H3K14Ac、H3K27Ac和RNA聚合酶2（RNAPII）的特异性抗体进行了ChIP-qPCR测定。结果表明PtrHDA907/908-OE中PtrECPP44启动子的H3K9/K14/K27乙酰化水平显著降低，而ptrhda907/908中的富集则显著增加。同时，在干旱胁迫下，PtrHDA907/908对PtrECPP44启动子的H3乙酰化水平和RNAPII富集的负调节减弱（图8C-D、图9C-D）。综上所述，作者推测，PtrHDA907/908介导的H3脱乙酰化和RNAPII与PtrECPP44启动子的解离在正常条件下抑制其转录，而在干旱胁迫时，PtrHDA907/908对PtrECPP44的转录抑制作用减弱。![]()
图8：（A-B）PtrHDA907-OE中的H3K9/K14/K27Ac水平显著降低，而ptrhda907-ko中的水平升高。（C-D）ChIP结果显示，PtrHDA907-OE中H3K9/K14/K27乙酰化水平显著降低，ptrhda907-ko中乙酰化水平则显著升高。![]()
图9：（A-B）PtrHDA908-OE中的H3K9/K14/K27Ac水平显著降低，而ptrhda908-ko中的水平升高。（C-D）ChIP结果显示，PtrHDA908-OE中H3K9/K14/K27乙酰化水平显著降低，ptrhda908-ko中乙酰化水平则显著升高。
=== 总结 ===
本文中，作者从PtrMYB94的抗旱性入手，筛选出了其转录激活的下游基因PtrECPP44，并发现PtrMYB94可以将组蛋白脱乙酰酶PtrHDA907/908募集到PtrECPP44的启动子上，并减少组蛋白H3赖氨酸残基9、14 和27的乙酰化，导致正常条件下PtrECPP44呈现相对较低的转录表达水平。而在干旱胁迫时，PtrMYB94与PtrHDA907/908的互作减弱，从而松弛染色质结构，并促进RNA聚合酶II与PtrECPP44启动子的结合，进而促进PtrECPP44的表达以提高植株的耐旱性。本研究建立了经PtrHDA907/908修饰的PtrMYB94-PtrECPP44转录调控模块，揭示了应对干旱胁迫的氧化调节的部分分子机制。
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