=== 研究背景 ===
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=== 研究结果 ===
1. VvbHLH036的鉴定注释及表达模式分析
图1：（A）VvbHLH036其他植物中功能表征的bHLH蛋白的序列比对。（B-C）冷处理后VvbHLH036在葡萄叶和根中的RT-qPCR表达分析。（D）VvbHLH036定位在细胞核中（E）VvbHLH036呈转录激活活性。
图2：（A）VvbHLH036的过表达载体示意图（B）VvbHLH036-OE表达量升高（C）VvbHLH036的过表达提高了葡萄根的耐冷性（D）突变体编辑类型（E）突变体根EL下降
为了深入进一步解析VvbHLH036介导的转录因子调控网络，作者对VvbHLH036-OE和对照葡萄植株的根进行了RNA-seq测序。VvbHLH036在VvbHLH036-OE中显著过表达。（图3A）。基因功能富集分析显示，许多上调基因与次级代谢、溶质转运、细胞壁组织和植物激素作用有关（图3B）。VvbHLH036-OE中检测到的下调基因与上调基因具有相似的富集性（图3B）。CACGTG元件（G-box）在VvbHLH036-OE上调基因的启动子中高度富集（图3C），并且在VvbHLH036-OE上调基因的启动子中也观察到G-box靠近转录起始位点（TSS）（图3D）。基于上述结果，作者认为在VvbHLH036-OE会结合到下游基因的G-box上发挥转录调控作用。作者随后筛选出了苏氨酸合酶VvThrC1，在它的近端启动子区域存在多个高度聚集的G-box元件（图3E）。此外，作者还对叶片在冷胁迫下进行了RNA-seq测序。发现在处理的不同时期，大多数在VvbHLH036-OE中上调的下游靶基因都是协调上调的（图3F），而VvbHLH036和VvThrC1上调的相关性是最高的（图3G），并且在VvbHLH036-OE植株的根中VvThrC1显著上调（图3H）。
接下来，作者对冷处理下营养组织中VvThrC1的表达情况进行了实验。结果显示，VvThrC1在冷处理24和48小时后在叶片和根中显著增加（图3J-K）。接着，作者通过RT-qPCR检验了对照植株和bhlh036突变体根中VvThrC1的表达。冷处理后对照组根中VvThrC1的表达显著上调；然而，在bhlh036突变体根中，VvThrC1表达受到显著抑制（图3I）。这些结果表明VvThrC1是VvbHLH036调控的潜在下游基因。
图3：（A）VvbHLH036-OE转基因植株的表达量提高（B）上调基因与各种生理生化过程有关（C）（G-box）在VvbHLH036-OE上调基因启动子中高度富集（D）:VvbHLH036-OE上调基因的启动子G-box靠近TSS（E）VvThrC1被选为VvbHLH036潜在的下游靶基因（F）大多在VvbHLH036-OE中上调的下游靶基因协调上调（G）VvbHLH036和VvThrC1上调的相关性最高（H）VvbHLH036-OE植株的根中VvThrC1显著上调（I）bhlh036突变体根中，VvThrC1表达受到显著抑制（J-K）VvThrC1在冷处理24和48小时后在叶片和根中显著增加
为了确认VvbHLH036是否可以激活VvThrC1的转录，作者进行了酵母单杂交实验。构建的载体结构如图所示（图4A）。结果发现，VvbHLH036可以结合VvThrC1的启动子区G-box元件（图4B）。为了进一步证实该结果，作者在烟草中进行了双荧光素酶报告基因测定，构建载体如下（图4C）。结果发现互作时的荧光强度显著提高（图4D-E）。此外，EMSA实验的结果也证实了VvbHLH036在体外可以结合含有G-box元件的探针（图4F）。以上结果表明，VvbHLH036通过直接结合近端启动子区域的G-box元件来激活VvThrC1表达。
图4：（A）酵母单杂载体构建示意图（B）酵母单杂证实VvbHLH036可以结合VvThrC1的启动子区G-box元件（C）双荧光素酶报告载体示意图（D-E）双荧光素酶报告实验证明VvbHLH036可以结合VvThrC1的启动子区（F）EMSA证实了VvbHLH036在体外可以结合G-box元件
5.VvbHLH036的敲除会抑制低温下Thr的积累
VvThrC1编码苏氨酸合酶，可催化葡萄中苏氨酸的生物合成。由于在冷胁迫下VvThrC1的表达受到VvbHLH036的调节，作者推测苏氨酸的积累对于葡萄树的冷胁迫反应至关重要。于是作者测量了经过冷处理的葡萄植物的叶子和根中的苏氨酸含量。结果显示，冷处理后葡萄叶和根苏氨酸含量显著增加（图5A-B）。此外，作者还测定了VvbHLH036-OE、bhlh036突变体根和对照中的苏氨酸含量。VvbHLH036-OE根中的苏氨酸含量也显著高于野生型（图5C）。在正常条件下，bhlh036突变体品系和对照之间的苏氨酸含量没有观察到显著差异（图5D）。然而在冷处理12和24小时后，对照植株根中的苏氨酸含量显著增加，而bhlh03突变体根中的苏氨酸含量在冷处理后保持不变，这表明在冷胁迫的条件下，bhlh036的突变会造成VvThrC1的表达抑制，从而减少苏氨酸的积累。这些结果表明VvbHLH036通过调节VvThrC1的表达来增加苏氨酸含量，从而提高葡萄树的耐冷性。
图5：（A-B）冷处理后葡萄叶片和根中的苏氨酸含量显著提升（C）冷处理后VvbHLH036-OE根中的苏氨酸含量显著增加（D）突变体植株苏氨酸含量无显著变化
6.过表达VvThrC1增强转基因葡萄根的耐寒性
为了进一步阐明VvThrC1是否是葡萄中苏氨酸生物合成的功能途径酶，作者首先利用烟草原生质体明确了VvThrC1的亚细胞定位情况。结果表明，VvThrC1仅分布在叶绿体的小区域内（图6A）。为了验证VvThrC1在响应寒冷胁迫期间对苏氨酸合成的作用，作者获得了VvThrC1-OE过表达植株，表达量相较野生型显著提升（图6B）。接下来，作者测定了VvThrC1-OE过表达植株和对照组根中苏氨酸的含量，发现过表达植株的苏氨酸含量显著高于野生型（图6C）。接着作者又使用CRISPR-Cas9技术获得了vvthrc1突变体植株（图6E），并在冷处理后测定了它和野生型根中的苏氨酸含量。结果发现，正常情况下突变体和野生型根中的苏氨酸含量无显著差异，在冷处理后野生型植株中的苏氨酸含量显著上升，而突变体则基本保持不变（图6F）。作者还测定了过表达和突变体植株的抗寒性。与野生型相比，过表达植株EL值下降（图6D），显著提升了植株的抗寒性。而突变体在正常条件下EL值与野生型无显著差异，处理24小时后则高于野生型。以上结果说明了VvThrC1在葡萄中正向调控葡萄根的抗寒性。
图6：（A）VvThrC1定位在叶绿体小区域内（B）VvThrC1-OE过表达植株的获得（C）过表达植株根中苏氨酸含量上升（D）过表达植株抗寒性上升（E）突变体植株的编辑情况（F）过表达植株抗寒性上升（G）突变体植株抗寒性下降
为了进一步明确苏氨酸在葡萄植株抗寒中发挥的作用，作者对葡萄叶片施加了外源的苏氨酸并研究了其叶片的抗冷反应。与对照相比，外源的苏氨酸使得葡萄叶片LT50的值进一步降低，这表明外源苏氨酸确实可以提高葡萄叶片的抗寒性（图7A）。同时，作者还测定了不同突变体植株在处理后的EL率。结果发现与对照相比，在处理前thrc1和bhlh036的EL值与对照无显著差异，而处理后所有植株的EL都有所下降，并且thrc1和bhlh036的EL均高于对照。这表明了bhlh036和thrc1突变体根在冷胁迫下苏氨酸积累受到抑制，而外源苏氨酸有利于恢复其耐冷性（图7B）。
同时，作者还对处理后叶片的O2-和H2O2水平进行了检测。在常温下，对照和苏氨酸处理的叶片中DAB和NBT染色均显示浅色，这表明非胁迫条件下O2-和H2O2浓度较低。而冷处理后，对照叶片的染色程度比苏氨酸处理叶片更深（图7C-D）。对O2-和H2O2含量的定量检测也证实了这个结果（图7E-F）。以上结果表明，外源苏氨酸提高了葡萄叶片的耐寒性并降低了O2-和H2O2的含量。
图7：（A）外源苏氨酸提高葡萄叶片抗寒性（B）bhlh036和thrc1突变体根在冷胁迫下苏氨酸积累受到抑制，外源苏氨酸恢复其耐冷性（C-E）外源苏氨酸降低了葡萄叶片O2-和H2O2的含量
=== 总结 ===
本文中，作者通过转录组的测序结果，筛选到一个在葡萄冷胁迫后上调的转录因子VvbHLH036，找到了其下游潜在的靶基因VvThrc1，证明了VvbHLH036通过调控VvThrc1促进了苏氨酸的合成，显著提高了葡萄植株的抗寒性，为园艺作物葡萄抗性育种提供了新的思路。也进一步完善了葡萄转录因子调控网络。
VvbHLH036通过调控VvThrc1促进了苏氨酸的合成，显著提高了葡萄植株的抗寒性
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