2024年7月，首都师范大学何奕騉教授团队在Plant Physiology发表了题为“Abscisic acid–mediated autoregulation of the MYB41-BRAHMA module enhances drought tolerance in Arabidopsis”的研究论文。该研究发现ABA介导的MYB41-BRM自调节可增强拟南芥耐旱性，增进对植物抗旱机制的理解。![]()
=== 研究背景 ===
自然界中，植物容易受到各种胁迫，包括非生物和生物因素。干旱是一个突出的非生物胁迫，威胁着植物生长和农业生产力。脱落酸(ABA)是一种应对干旱关键的植物激素，在干旱条件下会显著增加。ABA促进多种植物反应，包括气孔关闭和基因表达改变等，从而增强植物应对胁迫的能力。转录因子MYB家族在生长、发育、应激反应和生物合成中发挥着不同的作用，但它们在气孔调节中的作用仍不清楚。作者通过对ABA与拟南芥中几种MYB转录因子的分析，揭示了一种干旱响应机制，有可能大大提高农业生产力。# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1.MYB41、MYB74和MYB102在调节ABA介导的气孔运动中发挥关键作用
为了探索MYB转录因子家族的六个成员（MYB41、MYB74、MYB9、MYB39、MYB102和MYB107）在ABA信号传导中的潜在作用，作者测试了它们在ABA处理下的转录反应。结果表明，MYB41、MYB74和MYB102在ABA处理后表达量显著增加，而MYB9、MYB39和MYB107的表达水平相对不变（图1A）。为了进一步研究在ABA处理下MYB41的表达模式，作者构建了pMYB41:GUS载体，染色观察发现MYB41主要定位在叶脉和气孔中（图1B）。随后，为了了解MYB41在气孔调节中的作用，作者比较了myb41突变体和野生型 (WT) 植物对ABA处理的气孔反应，计算了气孔孔径的宽度与长度之比。观察发现正常条件下气孔孔径没有显著差异。而在ABA处理后，与WT植物相比，myb41突变体表现出明显更宽的气孔孔径（图1C和D）。这表明MYB41在ABA诱导的气孔关闭中发挥积极作用。进一步通过验证发现MYB74和MYB102在调节气孔孔径中的作用与MYB41一致。作者通过比较WT和myb41突变体背景中各种MYB转录因子的转录水平发现，在ABA处理下，与WT植物相比，myb41突变体中MYB74转录物水平略低，而myb41突变体中MYB102转录物水平略有升高（图1E和F）。可能是一MYB转录因子共同控制气孔关闭。为了验证这一假设，作者生成了双突变体myb41 myb102 (doub-myb)、myb41 myb74和三突变体 myb41 myb74 myb102 (trip-myb)植株。在正常生长条件下，myb41和doub-myb的气孔孔径与WT相似。而trip-myb表现出比WT稍微更开放的气孔。ABA处理后，WT气孔显著关闭，但突变植物气孔孔径关闭受损，在trip-myb植物中尤其明显。（图1G、H）。气孔关闭对于防止植物水分流失至关重要。因此作者分析了WT、myb41、myb74、myb102、doub-myb和trip-myb的离体叶片的失水率。与WT相比，trip-myb突变体表现出最高的失水率，其次是doub-myb和myb41，而WT的失水率最低（图1I）。随后，作者比较了WT、myb41、doub-myb和trip-myb植物在土壤中的抗旱性发现trip-myb突变体对干旱的敏感性增强（图2A和B）。![]()
图1.MYB41快速响应 ABA，促进气孔关闭
(A)WT中候选MYB基因的相对表达水平，(B)AtMYB41-CUS染色,中，(C)20倍保卫细胞代表性图像,(D)气孔孔径(宽/长)，(E、F)WT和myb41中MYBY74和MYB102的相对表达水平,(G)保卫细胞的代表性图像,(H)气孔孔径(宽/长),(I)离体叶片的失水率。
2.控制气孔关闭和NO生物合成：MYB在ABA介导的调节中的作用大量研究表明植物干旱胁迫期间NO在ABA介导的气孔关闭中非常重要。为了检验ABA诱导的保卫细胞中NO的产生，作者使用了NO敏感荧光探针DAF-FM-DA。在正常条件下，突变体中的NO水平略低于WT中的水平。相反，在ABA处理后，与WT相比，突变体植物表现出NO积累受损，导致荧光强度显著降低（图2C和D）。为了阐明MYB41和其他MYB转录因子之间的相互作用，作者生成了pER8GW:MYB41转基因植物，雌二醇诱导3小时后，MYB41表达显著激增。MYB9、MYB74、MYB102和MYB107的表达水平也出现上调。这一观察结果表明了MYB41对这些MYB的潜在调节影响（图2E）。RT-qPCR分析发现在ABA处理下，与WT相比突变体中MYB41表达水平显著降低（图2F）。为了探索MYB41的调节机制，作者使用源自pER8GW:MYB41和pMYB41:GUS植物杂交的F1植物进行了一项研究。分析了各种条件下MYB41和GUS的转录水平。在这些F1植物中雌二醇处理后显著诱导了MYB41的表达。雌二醇处理后GUS表达水平也显著增加（图2G）。以上结果表明MYB41、MYB74和MYB102转录因子在控制气孔关闭和NO生物合成中发挥的关键作用，作为ABA诱导的干旱胁迫反应的一部分。此外，这些发现表明MYB41的调控网络中存在自动调节机制。
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(A)干旱处理植物对比图，(B)植株存活率，(C)20倍保卫细胞代表性图像,(D)荧光强度，(E)雌二醇处理后候选MYB基因的相对表达水平,(F)MYB41的相对表达水平(G)F1植物中MYB4和GUS基因的相对表达水平。为了阐明MYB41潜在的自我调节机制，作者使用了trip-myb原生质体瞬时荧光素酶测定系统。MYB41启动子序列的各种截短的DNA片段与LUC报告基因偶联，而MYB41编码序列（CDS）作为效应子被过表达（图3A）。结果发现在存在MYB41 CDS的情况下启动子活性显著升高（图3B），表明MYB41内存在自动调节。在2k至1.5k上游区域时，启动子活性显著增强，表明该片段内可能存在关键调控基序。预测了MYB41启动子区域元件，并在此区域并确定了一个标记为“ATTACT”的推定增强子结合位点基序，该基序在控制MYB41启动子活性中很重要。随后将将上游2k、1.5k和突变结合位点2k (2k-mut)启动子与GUS融合并将其引入WT和三重突变体植物中，产生了稳定的转基因拟南芥植物。GUS染色发现WT中2k片段活性最高。相反，在1.5k和2k-mut片段中观察到活性降低，表明该位点在MYB41的自动调节中发挥着关键作用（图3E、F）。此外，当MYB41的“2k”启动子与GUS基因序列融合后，与WT相比，trip-myb中的MYB41启动子活性明显，表明由于MYB41、MYB74和MYB102 功能丧失而导致MYB41表达减少（图3G、H）。这一发现暗示了MYB41、MYB74和MYB102在调节MYB41启动子活性中的潜在调节作用。然后作者通过染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR和EMSA证实MYB41与其自身启动子的直接结合（图4）。![]()
(A)LUC测定的报告子和效应子构建体的示意图，(B)原生质体与pMYB41:LUC报告基因和MYB41过表达效应子共转化，(C)MYB41启动子2-kb区域内突变位点的示意图,(D)原生质体与pMYB41:LUC报告基因突变融合，(E、G)GUS染色,(F、H)MUG测定。
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(A)MYB41及其启动子基因组结构示意图，(B)ChIP 实验，(C)EMSA。
4.BRM与MYB41相互作用
为了解析MYB41的复杂调控机制，作者通过蛋白互作进行分析。先前有报道揭示MYB41和BRM之间存在相互作用。鉴于BRM在ABA信号转导中的作用，作者假设它参与调节ABA触发的气孔关闭及其与NO产生调节的关系。随后通过确定BRM和MYB41之间的蛋白互作开始了探索。将MYB41蛋白分为N端和C端结构域（图5A）。通过酵母双杂交验证BRM-N和MYB41 CDS片段之间存在相互作用（图 5B、C、D）。双分子荧光互补（BiFC）实验验证了BRM-N片段与MYB41 N端和C端结构域之间的相互作用，揭示了与MYB41 C端区域的独特相互作用模式（图5E）。进一步又通过Pull-down证实了BRM-DVII和MYB41之间的直接相互作用（图5F）。
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(A)Y2H测定中使用的全长BRM及其各种片段，(B-D)Y2H，(E)BiFC，(F)Pull-down。
5.BRM在ABA介导的气孔运动和NO积累中与MYB41不同
为了阐明BRM在植物保卫细胞对ABA信号传导反应中的作用，作者获得了BRM的功能性部分缺失突变体，特别是brm-3和brm-5。与trip-myb相比，无论ABA处理如何，brm-3和 brm-5突变体气孔孔径都更小。这一观察结果表明，BRM参与抑制ABA诱导的气孔关闭，表明BRM与MYB41在ABA介导的气孔运动调节中存在不同调节模式（图6A、B）。brm-3和brm-5保卫细胞中的NO含量超过WT。而在ABA处理下，WT保卫细胞中的NO含量显著增加，但brm-3和brm-5的NO水平几乎没有改变。这一观察结果表明brm植物对ABA不敏感，表明了BRM在抑制保卫细胞内NO积累方面的作用（图6C、D）。进一步测定了WT、brm-3和brm-5突变体植物离体叶片的失水率。结果与trip-myb趋势相反，无论气孔密度如何，brm-3和brm-5突变体的失水率都显著低于WT（图6G），表明BRM会促进拟南芥植物的水分流失。对WT、brm-3和brm-5突变体植物进行干旱处理后发现，与WT相比，brm-3和brm-5突变体表现出增强的耐旱性（图6E、F）。为了阐明BRM和MYB之间的关系，作者创制了一个三重突变体（myb41 myb74 brm-5）和一个四重突变体（brm-3-trip-myb，即brm-3 myb41 myb74 myb102）进行分析。结果发现这两种突变体与trip-myb突变体和myb41 myb74双突变体更为相似（图6）。这些发现表明这些MYB可能在BRM下游发挥作用。RT-qPCR分析发现在没有ABA处理时，brm-3和brm-5突变体中的MYB41转录水平也显著升高图（图6H）。在不同时间ABA处理下，WT中MYB41表达水平先升高后降低，而brm-3和brm-5突变体中MYB41表达水平表现出显著变化。表明BRM对MYB41表达水平具有持续的抑制作用（图7A）。
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(A、C)(WT)、brm-3、trip-myb植物和brm-3-trip-myb (quad-bm)保卫细胞图像，(B)气孔孔径，(D)荧光强度，(E)干旱处理对比图，(F)植株存活率，(G)离体叶片的失水量，(H)WT和brm-3植物中MYB41的相对表达水平。6.BRM与MYB41共同抑制MYB41的自我调节活动
为了进一步研究BRM与MYB41启动子相互作用的机制，通过ChIP分析以确定MYB41和 BRM与MYB41启动子的结合效率。结果发现与WT相比，brm-1 pBRM: BRM-GFP中MYB41的富集效率明显更高，特别是在pMYB41-1中（图7B）。与WT p35S：MYB41-GFP相比，brm-3 p35S：MYB41-GFP中MYB41的富集效率显著升高（图7C）。与trip-myb brm-1 pBRM：BRM-GFP相比，brm-1 pBRM：BRM-GFP中pMYB41-1的富集效率显著更高，这表明MYB可以直接通过BRM与MYB41启动子结合（图7D）。进一步对WT和brm-3 植物进行分析以研究BRM是否影响MYB41启动子区域的组蛋白修饰。与brm-3相比，BRM增强了WT植物中MYB41启动子区域内的H3K27me3水平。BRM通过抑制MYB41的转录水平来协调保卫细胞中气孔孔径和NO含量的调节，从而影响植物对干旱胁迫的恢复能力（图8）。有报道证实SWI3B和BRM（SWI/SNF染色质重塑复合物的2个完整亚基）与组蛋白脱乙酰酶HDA6 (At5g63110) 直接相互作用。作者通过ChIP分析发现BRM招募其相互作用蛋白HDA6，促进pMYB41上组蛋白乙酰化标记的去除，从而调节MYB41转录水平（图9）。
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图7.MYB41介导的BRM募集抑制MYB41表达(A)WT和brm-3植物中MYB41的相对表达水平,(B-D)ChIP–qPCR。
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图8.BRM调节MYB41启动子处的组蛋白修饰(ChIP–qPCR)![]()
图9.HDA6参与ABA介导的MYB41表达是BRM依赖性的(A、C)ChIP-qPCR 分析，(B)WT、brm-3和axe-1-5植物中MYB41的相对表达水平。
=== 总结 ===
未经ABA处理时，在WT植物中，染色质重塑ATP酶BRM由MYB41转录因子招募。随后，BRM招募HDA6，从而介导组蛋白脱乙酰化，导致H3ac、H3K14ac水平降低，H3K27me3水平升高，最终抑制MYB41表达。在brm-3突变体中，由于BRM的敲除，BRM和MYB41的相互作用被破坏，从而阻止HDA6招募到MYB41启动子。导致H3ac、H3K14ac 和 H3K27ac水平升高，而H3K27me3水平降低，从而激活MYB41表达。在WT中，经过ABA处理，BRM会磷酸化并失活。这种磷酸化破坏了BRM和MYB41之间的相互作用。当BRM的抑制不起作用时，ABA会诱导MYB41转录，并通过其自身调节进一步激活MYB41转录。在brm-3突变体中，由于BRM的敲除，没有BRM的抑制以及pMYB41中H3K27me3水平较低，MYB41的自动调节增强，进一步增强了MYB41的表达。![]()
图10.MYB41作用模型
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