2024年5月，中国科学院分子植物科学卓越创新中心王二涛团队、张余团队以及何祖华院士团队在国际知名期刊Nature上发表了题为Release of a ubiquitin brake activates OsCERK1-triggered
immunity in rice的研究论文。作者通过揭示了E3泛素连接酶OsCIE1与模式识别受体OsCERK1互作精细调控产量与免疫平衡的分子机制，为深入理解植物利用免疫系统这把双刃剑协调抗病、共生和生长的平衡奠定了理论基础。![]()
水稻作为全球重要的粮食作物，在农业生产中处于重要的地位。水稻在生长发育过程中易受病原微生物影响，当前防治手段主要依赖于农药，对环境污染严重。因此探究水稻免疫的分子机制是当前水稻育种的重点和热点。
植物可通过细胞表面的模式识别受体(PRR)识别微生物相关分子模式(MAMP)，从而启动信号转导并引发免疫活动抵御外来病原体，如水稻和拟南芥可通过模式识别受体CERK1识别MAMP。MAMPs是一类高度保守的微生物分子(如几丁质和肽聚糖)，其通常埋藏在微生物的复杂结构中。免疫信号在植物体内受到严格监管调控，磷酸化和泛素化等翻译后修饰途径常调节信号网络以维持细胞稳态，而这些调控之间常存在串扰。关于如何调控OsCERK1并介导免疫的分子机制尚不清楚。# 思维导图：
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一、OsCERK1与OsCIE1相互作用
先前的研究表明，OsCERK1对于水稻免疫至关重要，过表达OsCERK1可提高植株抗病性。然而在缺乏病原体情况下，过表达植株会产生异常信号传导和免疫激活。作者首先使用OsCERK1–FLAG在水稻原生质体中进行免疫沉淀-质谱分析，筛选得到了编码U-box E3连接酶的OsCIE1。Y2H结果显示，OsCERK1与OsCIE1互作，且互作依赖于ARM蛋白互作结构域而非U-box结构域(图1)。此外，亚细胞定位结果显示OsCERK1和OsCIE1共定位于水稻原生质体的质膜和内质网；Pull-Down、Split-LUC和Co-IP的结果均显示OsCIE1和OsCERK1存在互作(图S2)。![]()
图S2. OsCERK1与OsCIE1相互作用。(a–c) OsCIE1和相关U-box E3连接酶同源物的系统发育分析。(b) Pull down。(c)亚细胞定位。(d) Split-LUC。(e) Co-IP。
二、OsCIE1负向调节OsCERK1
为研究OsCIE1的功能，作者使用CRISPR-Cas9创制了水稻突变体。几丁质处理植株后，野生型ROS水平提高，且相较于WT，Oscie1 ROS的增量显著增加(图S3b)。此外，作者观测到了调节ROS稳态相关基因(如OsRbohH、OsCATA)存在表达变化(图S3c)。Oscie1突变体对外来病原体均表现出增强的抗性(图1b-d，图S3d-g)。此外Oscie1表现出了和OE-OsCERK1植株相似的结实率降低、籽粒产量降低、抗性增加的表型(图S4a-e)。由于E3泛素连接酶常具冗余功能，作者通过实验发现OsCIE1同一进化枝中的蛋白质也与OsCERK1互作(图S4g)。鉴于Oscie1突变表型类似于OsCERK1过表达表型，作者创制了Oscerk1/Oscie1双突变体，发现表型很大程度上得到恢复，包括几丁质诱导的ROS爆发(图S4f)、对病原体的抵抗力(图1e-g和图S3d-e)、结实率和谷物产量(图S4a-e)。已知水稻中spl11可表现出细胞程序性死亡和自身免疫水平提高，作者因此创制了spl11和spl11/Oscie1双突变体。表型分析显示spl11/Oscie1双突植株表现出更强的程序性细胞死亡，ROS水平增加(图S4i)，证明了OsCIE1和SPL11冗余地发挥抑制水稻自身免疫的功能。总之，以上研究结果均表明OsCIE1通过负向调节OsCERK1，提高水稻产量但降低抗病性。图1. OsCIE1与OsCERK1互作并负向调节OsCERK1介导的免疫。(a) Y2H。(b–d) Oscie1突变体表现出对稻瘟病更强的抗性。(c)病斑面积。(d)相对真菌生长。(e) Oscerk1/Oscie1双突变体表型。(f)病斑面积。(g)相对真菌生长。![]()
图S3. Oscie1突变体与野生型相比显示出增强的免疫反应。(a) CRISPR-Cas9介导的基因编辑类型。(b)几丁质处理后的ROS水平。(c)几丁质处理后ROS稳态相关基因的水平。(d-e)接种病斑后各植株的表型。(f) Oscie1和spl11突变体表型。(g)ROS水平测定。![]()
图S4. OsCIE1及其同源物负向调节OsCERK1以平衡免疫和产量。(a-e)野生型和转基因植株产量相关表型。(f) Oscerk1/Oscie1双突植株产生了表型回补。(g)酵母双杂交。(h) CRISPR-Cas9介导的SPL11基因编辑类型。(i) spl11/Oscie1双突植株表型。
三、OsCIE1泛素化OsCERK1
OsCIE1作为一种E3连接酶，作者在体外检测到了GST-OsCIE1的自泛素化。由于OsCERK1和OsCIE1互作，作者使用OsCIE1进行了MBP-OsCERK1-FLAG的泛素化测定，发现OsCERK1可被其泛素化(图2a)。此外，作者关注到当OsCERK1激酶活性结构域产生突变后，其与OsCIE1的互作显著减少，且不能被OsCIE1泛素化。这些结果表明，当OsCERK1处于活性构象时，OsCIE1优先与OsCERK1相互作用并促使其泛素化。作者同时检测到了可与OsCERK1互作的OsCIE1同源物也能泛素化OsCERK1。综上，OsCIE1可以泛素化OsCERK1，并且可能与其他OsPUB以冗余方式发挥作用，这与spl11/Oscie1双突变体具更旺盛的细胞程序性死亡活动表型一致。为了测试OsCERK1是否在体内被OsCIE1泛素化，作者在Oscie1突变水稻原生质体中共表达FLAG-Ub和OsCERK1-HA，并在此基础上共表达GFP-OsCIE1或突变类型GFP-OsCIE1(C234A/W261A)。免疫共沉淀的结果显示，表达GFP-OsCIE1的原生质体中OsCERK1的泛素化水平增加(图2b)。与野生型相比，Oscie1突变体中OsCERK1的泛素化水平降低，野生型原生质体经几丁质处理在较早时间内(30分钟)降低了OsCERK1的泛素化(图2c)。以上实验证实了OsCIE1在体内靶向OsCERK1进行泛素化，并且这种靶向受到几丁质感知的调节。图2. OsCIE1泛素化并抑制OsCERK1的激酶活性。(a) OsCERK1体外泛素化水平检测。(b) OsCERK1体内泛素化水平检测。(c) OsCERK1的泛素化依赖于OsCIE1，且在几丁质刺激后水平降低。(d-e)体外磷酸化测定。(f-h)体外激酶活性测定。
四、OsCIE1抑制OsCERK1的激酶活性
为确定OsCIE1介导的泛素化对OsCERK1的影响，作者创制OsCERK1的OsCIE1二转材料进行研究。作者发现无论OsCIE1存在与否，结果都呈现相似的OsCERK1转录和蛋白水平，表明OsCIE1泛素化OsCERK1并不诱导其在细胞内的降解。为确定OsCERK1中被OsCIE1泛素化的位点，作者使用体外泛素化的OsCERK1进行了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析并发现十个赖氨酸残基(Lys329、Lys347、Lys352、Lys445、Lys453、Lys458、Lys548、Lys558、Lys570和Lys584)处存在泛素化修饰。当这十个氨基酸均被精氨酸取代时，OsCERK1(10KR)不会再被泛素化，且蛋白失去了激酶活性。在Oscerk1背景下表达OsCERK1和OsCERK1(10KR)后用几丁质诱导，结果显示几丁质诱导的MAPK激活和ROS爆发被OsCERK1恢复，但OsCERK1(10KR)没有恢复 (图S9c-f)。进一步对OsCERK1泛素化修饰后的激酶活性进行测定，结果显示泛素化OsCERK1的ATP水解反应速率显著降低(图S9g-h)。OsRLCK185作为OsCERK1的关键底物，可激活下游免疫反应。作者由此检查了OsCERK1不同泛素化水平下OsRLCK185的磷酸化水平，结果显示与泛素化的OsCERK1一起孵育后，OsRLCK185的磷酸化水平大大降低(图2d-e)。与此同时，Oscie1中检测到OsCERK1和其底物更高的激酶活性(图2f-h)，这与在Oscie1/OsCERK1回补株系在未进行几丁质处理也可以检测到MAPK激活的结论一致。即以上数据表明OsCIE1介导的OsCERK1泛素化抑制其激酶活性，以防止稳态过程中过度的免疫信号传导。图S9. OsCERK1(10KR)无法恢复Oscerk1。(a)体外泛素化测定。(b)激酶活性测定。(c) OsCERK1转录水平测定。(d) OsCERK1体内蛋白水平测定。(e-f) MAPK活性和ROS水平测定。(g-h) OsCERK1的ATP水解活性测定。(i) MAPK活性水平测定。
五、OsCERK1抑制OsCIE1连接酶活性
作者首先发现了OsCERK1可在体外直接磷酸化OsCIE1(图S10a)，并随后利用LC-MS/MS确定了OsCIE1的磷酸化位点(Thr206、Thr215、Thr216和Ser237) (图S10b-e)，将所有四个残基突变为天冬氨酸会减弱OsCERK1介导的OsCIE1磷酸化(图3a)。通过在Oscie1原生质体中表达OsCIE1-FLAG并进行Phos-tag电泳以确定OsCIE1在体内是否被磷酸化，结果显示存在几丁质诱导的OsCIE1磷酸化。由于磷酸化的OsCIE1在Oscie1/Oscerk1原生质体中比在Oscie1原生质体中更丰富，但几丁质处理不再增强其在Oscie1/Oscerk1中的磷酸化。因此作者推断虽然其他未知激酶可以磷酸化Oscerk1中的OsCIE1，但几丁质诱导的OsCIE1过度磷酸化很大程度上依赖于OsCERK1(图S10f)。除此以外，作者发现了甲壳素处理不影响水稻原生质体中OsCIE1和OsCERK1之间的相互作用(图S10g)，并通过发现OsCIE1及其磷酸化模拟突变体OsCIE1(4D)、磷酸化无效版本OsCIE1(4A)的良好互作，表明OsCIE1的磷酸化并不会影响OsCIE1和OsCERK1相互作用(图S10h)。在确定OsCERK1磷酸化OsCIE1后，作者通过OsCIE1的体外泛素化检测，发现OsCIE1磷酸化显著阻碍了其泛素化活性(图S10i-j，图3b)。为了确定OsCIE1磷酸化如何影响水稻的免疫反应，作者在Oscie1突变体中回补了OsCIE1、OsCIE1(4D)和OsCIE1(4A) (图S10k)。与野生型OsCIE1类似，OsCIE1(4A)减少了ROS爆发并降低了Oscie1突变体的稻瘟病抗性。相比之下，磷酸化模拟突变体OsCIE1(4D)并没有完全挽救Oscie1突变体的表型(图3c-e和图S10l)。以上结果表明，几丁质诱导、OsCERK1介导的OsCIE1磷酸化负向调节其泛素连接酶活性并促使植物免疫反应。图S10. OsCERK1介导的磷酸化抑制OsCIE1的泛素连接酶活性。(a) OsCIE1磷酸化水平测定。(b-e)质谱图谱。(f)磷酸化水平测定。(g) OsCIE1和OsCERK1蛋白水平测定。(h)酵母双杂交。(i-j)泛素化水平测定。(k) OsCIE1蛋白水平测定。(l)转基因植株ROS水平测定。![]()
图3. OsCERK1通过磷酸化OsCIE1并抑制其泛素连接酶活性，进而促进免疫。(a) MBP-OsCIE1(4D)的体外磷酸化水平。(b) OsCERK1在转基因植株中的体内泛素化水平测定。(c–e)转基因植株抗病性表型。c，1.5月龄水稻植株表型；d，病斑面积；e，相对真菌生长。
五、Ser237磷酸化调节E3连接酶
为了解OsCIE1的磷酸化如何抑制其E3活性，作者对OsCIE1的U-box结构域及E2-E3二元复合物OsUBC8-OsCIE1的晶体结构进行了解析。结果显示存在两种不同构象的OsUBC8-OsCIE1复合物(图4a)，其依赖于数个氨基酸位点产生的疏水相互作用及氢键维持(图S11a-b)。OsCIE1主要通过两个表面斑块接触OsUBC8，其中斑块A包含一个环A(图4b-d)。作者关注到Ser237(OsCIE1磷酸化的四个残基之一)，不与OsUBC8直接相互作用，但其位于环A的中心位置(图4c)。由于NMR的结果显示环A较OsCIE1的U-box核心区域具更灵活的构象(图4e)，因此作者猜测在OsUBC8不存在时，Ser237采用灵活的构象，易于在OsCIE1表面磷酸化，并且OsCIE1中未磷酸化的Ser237可以稳定环A，从而与OsUBC8相互作用。通过将237位Ser取代为Asp(S237D)，作者观察到Ser237取代不影响环A的灵活性，但其影响构象及核Overhauser效应(NOE) (图4f，扩展数据11e-n)。以上结果使作者假设OsCIE1的S237D将影响其与OsUBC8的互作。作者进行了酵母双杂交测定和体积排除色谱法发现S273D的OsCIE1和OsUBC8互作极弱或不互作(图S11o-q)。表面等离振子共振(SPR)的结果显示Ser237突变为Asp极大降低了U-box结构域和OsUBC8之间的亲和力(图S11r)。此外，S237D会导致OsCERK1的自泛素化和反泛素化减少(图S11s-t)。进一步地，作者发现OsCIE1被OsCERK1特异性磷酸化，且几丁质处理增强了磷酸化，但Ser237的磷酸化无效突变和Oscerk1则会导致磷酸化信号的丢失(图4g-h和图S12b-c)。转基因的结果显示OsCIE1和S237A都可恢复Oscie1对稻瘟病的敏感性，S237D则不行(图3c-e)。综上，作者证明OsCIE1的Ser237是一种通过磷酸化调节的E3连接酶位点开关，可调控植物免疫发生。图4. OsCIE1-OsCERK1介导免疫的磷酸化开关和制动/释放模型。(a-f) OsCIE1-OsUBC8二聚体蛋白晶体结构图。(g-h)蛋白质磷酸化水平测定。(i) OsCIE1-OsUBC8开关介导植物免疫的模型示意图。![]()
图S11. OsCIE1-OsUBC8复合物的结构分析和Ser237磷酸化抑制OsCIE1的催化活性。(a-d) OsCIE1-OsUBC8二聚体蛋白晶体结构模型图。(e-n) NMR的HSQC-NOESY图谱。(o)酵母双杂交。(p-q)体积排除色谱及SDS-PAGE电泳分析SEC级分。(r)表面等离振子共振(SPR)。(s-u)泛素化活性测定。
六、OsCIE1的Ser237在各个物种中都是保守的
OsCIE1中的Ser237磷酸化位点及其侧翼氨基酸序列在不同物种的E3连接酶中高度保守(图S12a)。不同物种E2-E3的结构模型揭示了其各自的E3和E2间存在相同的互作模式，保守的丝氨酸残基则位于不同晶体结构中的相同位置(图S12e)。序列保守性和结构相似性意味着U-box结构域中跨界保守丝氨酸的磷酸化可能会影响各物种的E3连接酶活性。事实上，磷酸化模拟实验证实了不同物种间的磷酸化调控均会产生相关E3的泛素化活性受损。利用来自黑腹果蝇、斑马鱼和智人的CHIP同源物进行的体外实验表明，与野生型和磷酸化无效版本相比，磷酸化模拟的黑腹果蝇CHIP、斑马鱼CHIP和智人WDSUB1均表现出明显的自泛素化活性受损 (图S12f)。由此作者推测U-box结构域可能具有与调节泛素连接酶活性的类似OsCIE1-Ser237残基相似且保守的、新的共识基序。图S12. OsCIE1的Ser237进化保守，调控与E2的相互作用。(a) OsCIE1的Ser237是跨界物种中潜在磷酸化的进化保守位点。(b-c)蛋白磷酸化水平测定。(d) OsCIE1蛋白丰度测定。(e)不同E2-E3蛋白结构示意图，存在保守丝氨酸残基的内部构象。(f)自泛素化活性水平测定。(g) OsCIE1表达水平测定。(h) OsCERK1和泛素化OsCERK1形成双负反馈环路的双稳态开关模型示意图。![]()
在本研究中，作者鉴定了OsCIE1-OsCERK1这一通过泛素化和磷酸化双负反馈调节的开关，揭示了其精细互作以调控产量与免疫平衡的分子机制，同时拓宽了泛素化受体蛋白命运的认识。研究丰富了人们对于植物利用免疫系统调节抗病、生长的认知，为水稻进行分子育种提供了丰富的理论基础。
期刊：Nature
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