2024年1月，浙江大学农业与生物技术学院徐建红教授研究团队在Plant, Cell & Environment期刊上发表了题为“The rice LATE ELONGATED HYPOCOTYL enhances salt tolerance by regulating Na+/K+ homeostasis and ABA signalling”的研究论文，揭示了OsLHY如何通过调节Na+/K+离子平衡和ABA信号通路来增强水稻的耐盐性，为理解昼夜节律如何调控水稻对盐胁迫的反应提供了新的视角。
研
究
背
景
水稻是促进全球粮食安全的重要谷类作物之一，研究水稻对盐胁迫响应的潜在分子机制具有重要意义。盐胁迫通常是由土壤中高浓度的Na+和Cl−引起的。高亲和力K+转运体（HKT）家族的成员已被证明参与维持Na+/K+稳态。在水稻中，ABA信号通路也参与了非生物胁迫耐受性的调节。生物钟在调节植物的生长、发育和对各种非生物胁迫的响应中起着多种作用，近年来的研究表明，昼夜节律在水稻对盐胁迫的响应中起着重要作用，水稻生物钟核心组成基因LATE ELONGATED HYPOCOTYL（OsLHY），也被称为CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1（OsCCA1），是一种在自然条件下促进开花的核定位蛋白，此外，先前已有报道表明，OsLHY通过激活OsPP108和OsbZIP46来调控ABA信号通路。
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研
究
结
果
1.OsLHY正向调控水稻耐盐性
本研究中oslhy‐1、oslhy‐5、oslhy‐7突变体是在Nipponbare（Nip）背景下通过CRISPR/Cas9系统创制的。为了研究OsLHY在盐胁迫响应中的作用，作者研究了其在盐胁迫下的表达模式。与Nip相比，oslhy突变体表现出盐敏感表型和较低的存活率（图1a，b），表明OsLHY可能参与调节盐胁迫的耐受性。oslhy突变体的叶绿素含量始终与未经盐处理的Nip相似，但在盐胁迫下显著降低（图1c）。通过测定MDA含量，发现盐胁迫处理下oslhy突变体的MDA含量显著增加（图1d）。进一步通过DAB和NBT染色证实，盐胁迫下oslhy突变体的ROS含量显著积累（图1e）。
图1. oslhy突变体对盐胁迫敏感
在NaCl胁迫下，与Nip相比，oslhy突变体稻芽的Na+和K+含量显著升高，而根中K+含量显著降低（图2a，b，d，e），并且oslhy突变体的Na+/K+比值明显高于Nip（图2c，f）。由此推断异常的Na+/K+比值和ROS稳态导致了oslhy突变体的盐敏感性。
图2. 在180 mM氯化钠处理或不处理7天后，oslhy突变体稻芽和根中Na+和K+的含量。
2. oslhy突变体的转录组学分析
作者为了进一步研究OsLHY响应盐胁迫的直接靶点，分别在盐胁迫和正常条件下对oslhy突变体和Nip的稻芽进行了RNA-Seq检测。与Nip相比，在正常条件下和180 mM NaCl胁迫条件下，oslhy突变体分别鉴定出3127个DEGs（1914个下调，1213个上调）和3045个DEGs（1586个下调，1459个上调）（图3a）。超过三分之一的DEGs在两种情况下重叠（图3b）。盐胁迫下的oslhy突变体，在离子转运相关的55个差异基因中，编码K+转运蛋白的3个基因（OsHAK17、OsHAK5和OsHAK7）显著上调，编码高亲和K+转运蛋白的3个基因（OsHKT1;1、OsHKT1;4和OsHKT2;1）显著上调，一个K+转运蛋白基因（OsHAK16）显著下调（图3c）。这些结果表明，OsLHY可能通过调节Na+/K+稳态来调控水稻的耐盐性。
KEGG通路分析表明，盐胁迫下oslhy突变体的DEGs主要富集于碳代谢、苯丙烷类生物合成、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢以及MAPK信号通路（图3d）。在植物激素信号转导和MAPK信号通路中，有10个基因属于ABA信号转导的核心成分，是植物盐胁迫和干旱胁迫响应的核心。热图显示，7个基因（OsSAPK4、OsbZIP72、OsPYL8、OsPP2C09、OsPPP2C49、OsPP2C51和OsPP1P108/OsPP2C68）显著下调，3个基因（OsSAPK2、OsSAPK9和OsPYL6）在盐胁迫下的oslhy突变体中显著上调（图3e）。RT-qPCR的验证结果与RNA-seq数据相似。作者进一步分析比较了从中国水稻数据中心鉴定出来的差异基因，结果表明表明ABA信号可能参与了OsLHY调控的水稻对盐胁迫的响应。
图3. 盐胁迫下oslhy突变体的转录组学分析。
3. OsLHY直接调控OsHKT1;1和OsHKT1;4的表达
相比于盐胁迫下oslhy突变体中Na+和K+转运体相关基因的表达受到显著影响，正常条件下只有OsHKT1;1和OsHKT1;4的表达发生了显著改变（图3c）。通过检测正常情况和胁迫条件下的oslhy突变体和Nip中OsHKT1;1和OsHKT1;4的表达发现，OsHKT1;1和OsHKT1;4基因可能是OsLHY应对盐胁迫的潜在靶点。利用双荧光素酶报告基因检测系统证明，OsLHY可以激活OsHKT1;1的转录（图4b）。
先前的报道中，OsLHY可以与CCA1结合位点（CBS）和晚间元件（EE）结合。为了进一步证实OsHKT1;1和OsHKT1;4是否是OsLHY的直接靶点，对其启动子序列进行分析发现二者都具有两个CBS基序。随后，Y1H发现转化后能够在选择培养基SD/- Leu/-Trp/-His上成功生长。EMSA结果显示，GST-OsLHY蛋白可以结合到已标记的CBS探针上，而未标记的探针可以有效地与结合物竞争（图4d）。综上所述，OsLHY直接与OsHKT1;1和OsHKT1;4的启动子结合，并调控它们的表达。
图4. OsLHY直接调控OsHKT1;1的转录
(a) 在正常（‐NaCl）和盐（+NaCl）条件下，通过RT-qPCR分析oslhy突变体和Nip中OsHKT1;1的表达。(b) Dual-LUC报告基因实验显示OsLHY激活了OsHKT1;1的转录。(c) 酵母单杂交实验（Y1H）显示了OsLHY与OsHKT1;1启动子之间的相互作用。(d) EMSA实验显示OsLHY能够结合到OsHKT1;1启动子中的CBS-1和CBS-2序列。
4. OsLHY的功能损失提高了植物对ABA的敏感性
为了进一步研究ABA信号是否参与了水稻耐盐性中的调控，作者研究了不同浓度ABA条件下oslhy突变体和Nip的株高和种子发芽率。虽然ABA浓度降低了oslhy突变体和Nip的株高，但与Nip相比，ABA对oslhy突变体的抑制作用更明显（图5a，b）。同时，oslhy突变体的发芽率低于Nip，此外，ABA对种子发芽率有明显的剂量效应（图5c-f）。OsLHY可能在ABA信号通路中起着负调控因子的作用。
(a)经不同浓度脱落酸处理后oslhy突变体和Nip幼苗的表型。(b)用不同浓度的ABA处理后oslhy突变体和Nip的植物高度。(c-f)在正常条件和1, 3, 5 µM ABA处理下，oslhy突变体和Nip的发芽率。
5. OsLHY与OsSAPK9启动子结合并抑制其表达
在oslhy突变体中，OsSAPK9的表达显著增加（图6a）。此外，作者发现OsSAPK9在Nip中表达强烈且具有节律性，其峰值出现在ZT16。在未经盐处理的oslhy突变体中，OsSAPK9的表达主要在白天增加（图S5E），而在盐胁迫下，oslhy突变体的表达波形几乎在所有时间点均有所增加（图S5F）。Dual-LUC实验显示，OsLHY可以显著抑制OsSAPK9的转录（图6b）。Y1H实验结果显示OsLHY可以直接与OsSAPK9的启动子结合（图6c），EMSA显示，这种结合与OsSAPK9启动子区域中的CBS和EE基序有关（图6d）。以上结果表明，OsLHY直接调控ABA信号通路相关基因OsSAPK9的转录。
图6. OsLHY直接与OsSAPK9启动子结合，抑制其转录
(a)在正常（-NacCl）和盐（+NaCl）条件下，OsSAPK9在oslhy突变体和Nip中的表达。(b) Dual-luc检测显示，OsLHY抑制了OsSAPK9的转录。(c)酵母单杂交结果显示OsLHY与OsSAPK9启动子相互作用。将pHis2-POsSAPK9和OsLHY-Rec2共转染到酵母细胞Y187中，然后转化在SD/-Trp/-Leu/-His（SD/-TLH）和含有50 mM 3-AT的SD/-TLH培养基上生长。(d) EMSA显示OsLHY可与OsSAPK9启动子中的EE-1和CBS-5序列结合。
图S5.OsHKT1;1的昼夜表达模式
在正常生长条件和180 mM NaCl胁迫处理下，oslhy-5和Nip品种的幼苗中OsHKT1;1 (A-B),OsHKT1;4 (C-D)和OsSAPK9 (E-F)的表达情况。
6. OsSAPK9负调控水稻的耐盐性
利用CRISPR/Cas9系统创建了两个ossapk9突变体（ossapk9-1和ossapk9-2），在第一个外显子中分别缺失4 bp和插入1 bp（图7a，b），产生了提前终止。与预期的一样，ossapk9突变体中OsSAPK9的表达显著降低（图7c）。随后，用180 mM NaCl对其突变体和Nip的14日龄幼苗进行处理，ossapk9突变体对盐胁迫的耐盐性和存活率均高于Nip（图7d，e），表明OsSAPK9确实参与了水稻对盐胁迫的响应。
图7.OsSAPK9负调控水稻的耐盐性。
(a) OsSAPK9的基因结构示意图。(b) 测序结果证实了ossapk9突变体中OsSAPK9的基因型。突变体位点用红框表示。(c) OsSAPK9在ossapk9突变体和Nip中的表达分析。以Actin基因作为对照。(d) ossapk9突变体在180 mM NaCl处理前（左）和恢复10天后（右）的幼苗表型。(e) 对恢复后的ossapk9突变体和Nip的存活率进行统计学分析。
总
结
OsLHY可以通过直接与启动子结合或通过OsbZIPs调控水稻Na+/K+稳态来调控OsHKT1;1和OsHKT1;4（图8）。此外，OsLHY调控参与ABA信号通路的基因，包括PP2Cs、OsbZIPs和SnRK2s，这些基因随后控制下游基因对盐胁迫的响应（图8）。OsSAPK9可能激活OsbZIPs或其他ABA响应基因，分别对水稻的耐盐性产生正向或负向影响，OsbZIP46在之前的研究中被证明是ABA信号传导和干旱胁迫耐受性的激活因子。在盐胁迫下，ABA信号下游基因OsbZIP72显著低表达（图3），表明oslhy可能激活OsbZIP72（图8）。OsbZIP72作为转录激活因子，促进OsHKT1;1的表达，以响应盐和干旱胁迫。综上所述，OsLHY与ABA信号通路共同调控Na+/K+稳态以响应盐胁迫。
图8. OsLHY调控水稻耐盐性的工作模型
实线表示实验验证，预测的调节用虚线表示。
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