PC | ZAT5和BLH2/4调节拟南芥种皮粘液中的同聚半乳糖醛酸去甲基酯化

作者使用实时定量PCR（qPCR）来研究ZAT5在4 DPA（开花后的天数）发育种子中以及7、10和13 DPA后种皮中的表达（图1A）。在这4个时间点均检测到ZAT5转录本。ZAT5的表达水平在7-10 DPA之间达到最高水平。为了检测ZAT5的组织特异性表达，在发育中的种子外皮表皮细胞以及在10至13 DPA阶段从种皮表皮细胞释放的粘液中检测到了强GUS信号（图1B-1E）。进一步将GUS信号定位在10和13 DAP发育种子的部分。结果显示两个阶段的合点区种皮、种皮表皮细胞、胚和外胚乳中均存在清晰的信号（图1F，1G）。为更精细确定ZAT5的表达，作者进行了原位杂交测定。ZAT5在7至10 DPA时在种皮表皮细胞中强烈表达，在13 DPA时表达更多。在10至13 DPA时，还在胚和外胚乳中检测到ZAT5转录本（图1H），表明ZAT5在发育中的种子中广泛表达。

图1. 发育种子中ZAT5的表达谱分析。

(A) qPCR分析。(B-G) 在ProZAT5:GUS转基因拟南芥组织不同阶段的GUS活性组织化学分析。(H) 原位杂交。

ZAT5属于C2H2型锌指蛋白（ZFP）家族的C1-2i亚类，该家族是植物中最大的TF家族之一。亚细胞定位结果显示ZAT5-GFP融合信号主要在细胞核中被观察到，表明ZAT5是核蛋白（图S4）。为了确定ZAT5是否影响种皮粘液形成，作者获得了的两个独立纯合突变等位基因（SAIL_13_H11和SALK_048250），二者的ZAT5编码区均包含T-DNA插入，并将这两个纯合系命名为zat5-1和zat5-2。利用RT-PCR来鉴定突变体，三对引物均未获得扩增（图2B），因此，zat5-1和zat5-2是无效突变体。

使用钌红（RR）染色检测zat5-1和zat5-2突变体的种子粘液表型。当种子在水中不摇动的情况下染色时，突变体和野生型（WT）没有明显差异。然而，在水中以200 rpm摇动种子2小时后，zat5-1和zat5-2种子粘液的染色晕圈与WT相比更薄，体积也显著减小（图2C，2D）。通过用ProZAT5:ZAT5构建体转化zat5可以改善粘液变薄这一表型，表明粘液缺陷可能是由ZAT5突变引起的。作者进一步将zat5突变体（母本）和WT（父本）杂交以产生F1种子，观察其表现与zat5突变体的粘液表型相似。为进一步研究zat5粘液缺陷是否是由种皮分化异常引起的，使用扫描电子显微镜观察种皮表面，zat5与WT种皮的形态没有观察到明显的差异（图S6）。

图S4. ZAT5在烟草细胞中的亚细胞定位。

图2. zat5突变体具有缺陷的AM（粘性粘液）表型。

图S6. WT和zat5干种子的SEM分析。

作者接着用高效液相色谱（HPLC）测定发现，zat5突变体和WT种子粘液具有相似的单糖组成，并且用水或EDTA溶解的材料中存在的总糖没有显着差异（表1）。这些结果表明ZAT5对种子产生粘液多糖的量和组成没有明显影响。

3.zat5粘液中果胶甲酯化和PME活性发生改变

图3. zat5降低了种子黏液中HG的DM

4.ZAT5下调PME5、HMS/PME6、PME12和PME16

图4. ZAT5直接靶向PME5、HMS/PME6、PME12和PME16。

(A) PME基因在野生型和转基因植株的7~10 DPA种皮中的相对表达量。(B) 双荧光素酶实验中使用的载体。(C) 相对LUC/REN比值。

5.ZAT5在体内和体外识别TGATCA元件

通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验以确定ZAT5是否在体内直接调控PME基因。在PME基因启动子上设计了5对引物，使其能够被ChIP-qPCR检测到（图5H）。结果显示PME启动子中的所有片段均显著富集MYC抗体（图5I-5L），表明ZAT5在植物中是与这些序列结合的。结合PME基因的表达在zat5突变体中上调，但在过表达ZAT5的植物中下调（图4A）。作者合理推测PME5、HMS/PME6、PME12和PME16的表达通过ZAT5与其启动子中的TGATCA元件的结合而受到抑制。

图5. ZAT5直接靶向PME5、HMS/PME6、PME12和PME16。

作者创制了PME5、HMS/PME6、PME12和PME16的T-DNA插入突变体。RT-qPCR鉴定出pme6是一种敲除突变体。对在水中摇动的种子进行RR染色显示，所有pme突变体似乎都具有较薄的粘液表型。测量了去粘液种子和种子粘液的体积表明，去粘液种子的相对体积没有显著差异，而pme突变体的AM层体积相对于WT有所减少（图6）。为了进一步观察突变体的粘液表型，我们将pme突变体（母本）和WT（父本）杂交以产生F1种子。F1种子和pme突变体的RR粘液表型相似（图6）。因此，每个pme突变体与WT的杂交表明pme粘液表型是种皮缺陷的结果。与WT相比，在pme5-1、pme6、pme12-1和pme16突变体中，粘液的HG DM显著增加，并且7至10 DPA种皮中的PME活性降低（图3A，3B）。与WT相比，JIM5和JIM7免疫标记pme种子的强度分别在射线结构之间和外粘液外缘之间的区域增加，而CCRC-M38的标记强度沿着AM层的射线结构略有下降（图7），并且ELISA定量结果与免疫荧光结果一致。总的来说，这些果胶甲酯化酶参与种子粘液果胶去甲酯化。

作者创制一系列双突变体（zat5-1 pme5-1、zat5-1 pme6、zat5-1 pme12-1和zat5-1 pme16），并观察了它们种子粘液的表型（图6）。这些双突变体中的粘液圈厚度与WT无显著差异。因此，zat5-1突变体中的PME5、HMS/PME6、PME12和PME16各自的突变弥补了zat5粘液缺陷。总之，遗传证据表明，ZAT5通过直接抑制PME5、HMS/PME6、PME12和PME16的表达来调节果胶去甲基酯化。

图6. 遗传分析表明ZAT5调控PME5、6、12和16。

图7. 用JIM5、JIM7、CCRC-M38单克隆抗体对pme5、pme6、pme12和pme16种子进行免疫标记。

qPCR和双荧光素酶活性数据显示ZAT5可能间接抑制PME58的表达，结合先前的研究表明BLH2和BLH4冗余地激活PME58表达以调控果胶去甲基酯化，促使作者探究ZAT5与BLH2/4之间的关系。ZAT5的表达在blh2、blh4和blh2 blh4中显著增加。与WT相比，zat5突变体中BLH2和BLH4的表达增加（图8A）。因此，ZAT5和BLH2/4可能会抑制彼此的转录或阻止彼此正常发挥作用。

体外下拉实验（pull-down）表明，ZAT5和BLH2存在物理相互作用（图8B）。体内免疫共沉淀（Co-IP）再次表明，ZAT5与BLH2和BLH4发生物理相互作用（图8C，8D）。

为了确定ZAT5和BLH2/4之间的相互作用是否影响了ZAT5与PME5、PME6、PME12和PME16的结合能力，作者进行了EMSA检测。ZAT5可以识别标记PME5、6、12、16的TGATCA基序的探针，BLH2则不能（图8E-8H）。通过添加GST-BLH2融合蛋白的剂量确实减少了ZAT5与这些探针的结合（图8E-8H）。同样，BLH2与PME58的结合通过增加ZAT5的数量而被抑制（图8I）。这些结果表明，ZAT5和BLH2/4相互抑制对方的活性，且呈剂量依赖型的。

为了进一步了解ZAT5和BLH2/4在调节果胶DM过程中的关系，作者将zat5-1与blh2 blh4杂交，得到zat5-1 blh2 blh4三重突变体（图9）。zat5-1和blh2 blh4突变体种子的粘液层较WT明显减少，而zat5-1 blh2 blh4的种子粘液层与zat5-1相似，但较WT薄，较blh2 blh4厚（图9C，9D）。此外，与WT相比，zat5-1 blh2 blh4三突变体的PME活性降低，HG DM增加。ZAT5突变可以部分恢复blh2 blh4突变体的表型缺陷。

该研究表明，ZAT5和BLH2/4通过同一途径相互拮抗调控种子黏液中的果胶DM。

图8. ZAT5和BLH2/4在调节下游基因表达方面具有相互拮抗作用

图9. ZAT5和BLH2/4相互拮抗调节果胶DM

(A) 野生型与突变体种子的粘液表型。(B) AM层相对粘液厚度。(C) 突变体与WT相比的相对PME活性。(D) 野生型和突变体粘液中释放的甲醇含量。

图10. 拟南芥种皮HG去甲基酯化过程中ZAT5和BLH2/4调控网络的模型。

期刊：The Plant Cell

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