2024年7月，南京农业大学黄小三教授团队在国际知名植物学高水平期刊The Plant Journal上发表了题为PbGBF3 enhances salt response in pear by upregulating PbAPL2 and PbSDH1 and reducing ABA-mediated salt sensitivity的论文。本研究中，作者通过转录组筛选到梨抗盐胁迫的相关转录因子PbGBF3以及PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1的调节模块，揭示了PbGBF3-PbAPL2和PbGBF3-PbSDH1模块通过增强ABA信号传导和减少ABA介导的生长抑制来增强梨的耐盐性。本研究为梨的抗逆育种提供了新的参考![]()
=== 研究背景 ===
盐胁迫是影响植物生长发育的主要非生物胁迫之一。研究植物的耐盐性对开发抗盐的植物新品种至关重要。梨是全世界产量最多的水果之一，具有极高的生产和研究价值。植物的耐盐性受到一个复杂的转录因子调控网络控制，先前的研究表明，碱性亮氨酸拉练（bZIP）家族成员G-box结合因子3（GBF3）等转录因子在拟南芥中会参与响应ABA信号并对盐胁迫作出反应。基于先前的研究成果，作者期望通过转录组测序等手段，探寻梨控制耐盐性的关键转录因子，进一步完善相关的基因调控网络。
# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1.梨幼苗对盐胁迫的生化反应
为了验证盐胁迫处理的可靠性，作者先使用200 mM的NaCl溶液对梨组培苗进行了胁迫处理，并测定生理生化指标的变化。在处理后48小时，梨组培苗的叶缘和中心的嫩芽开始出现褐化（图1A），丙二醛（MDA）含量、脯氨酸(Pro)含量、ROS水平（H2O2含量、Anti O2含量）均发生显著变化。其中MDA在处理后6小时达到峰值，此后持续下降至最低值；Pro含量在处理后4-12小时降至最低值，然后上升到峰值。H2O2在胁迫开始6小时内持续增加，随着Anti O2含量在12小时达到峰值，H2O2含量也下降至最低值（图1B-E）。以上结果和先前梨盐胁迫时生理生化指标变化趋势基本一致，因此作者认为，本实验中的盐胁迫结果是科学可靠的。![]()
图1. （A）200 mM Nacl处理48 h后梨组培苗褐化。（B-E）梨组培苗盐胁迫下四种生化指标的相对含量变化。
作者对盐处理和未处理样品进行了RNA-seq测序（图2A）。盐处理后4、6、12、24、48小时后的差异表达基因（DEG）数量分别为3540、3831、8374、6267和5381，作者从中挑选了共有的1163个DEG作为候选盐响应基因（图2B）。KEGG分析表明，这1163个DEG主要富集在与光合作用、碳固定以及植物激素信号转导和MAPK信号传导相关的通路途径中（图2C）。RNA-seq的结果与已知在盐胁迫期间激活的整体生化途径一致。为了进一步分析这1163个盐胁迫相关DEG的表达模式，作者还进行了STEM分析（图2D），结果表明这些DEG主要聚集成四个轮廓，轮廓14、0、13和1，分别为包含119、270、244和360个DEG，这些DEG在应激反应过程途径中高度富集。![]()
图2. （A）梨组培苗盐胁迫响应的分析方法。（B）盐胁迫后不同时间产生的DEG数量。（C）KEGG分析。（D）STEM分析检测处DEG的四个显著分区。
为了确定这些DEG中盐响应的基因，作者对不同盐处理时间下DEG的组合进行了WGCNA并构建了层次聚类树（图3A），并将不同功能的基因分成了12个区块（图3B）。其中，黑色区块内的基因和盐胁迫以及H2O2、Pro含量相关。将黑色模块中基因用热图呈现后作者发现，有一小部分在盐胁迫处理的前期表达较低，而在处理后期高表达；同时更多的基因则在处理的早期表达较低，而在后期高表达（图3C）。这个结果与先前测定梨组培苗中H2O2和Pro含量的变化趋势一致，作者分析黑色模块中的基因可能与梨的盐胁迫相关。为了进一步筛选黑色模块中盐胁迫相关基因，作者基于KEGG分析和WGCNA分析构建了转录调控网络（图3D）。在网络中鉴定出了一个潜在的ABA响应基因PbGBF3以及PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1的调节模块。PbGBF3先前被报导作为bZIP-TF在梨中参与寒冷和干旱胁迫相关的生理活动，然而，PbGBF3响应盐胁迫的功能仍不清楚。作者选取了PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1模块作为研究对象，探究它在梨抗盐胁迫中的作用。![]()
图3. （A）WGCNA分析基因的聚类树状图。（B）不同功能基因分区。（C）黑色模块中DEG的表达情况。（D）与植物激素信号转导和MAPK信号通路相关的DEGs的预测共表达网络。
4.NaCl和ABA诱导PbGBF3的表达
根据上述的实验结果，PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1调节模块可能响应了盐胁迫和ABA信号通路。为了具体阐述该模块在两者中发挥的作用，作者在梨组培苗和愈伤组织中使用了qRT-PCR测定这三个基因的表达量（图4、图5）。结果显示，外源盐处理和ABA处理高度诱导PbGBF3表达（图4A、D；图5A）。为了进一步验证盐胁迫和ABA对PbGBF3转录的影响，作者克隆了PbGBF3的启动子并进行了梨组织GUS染色，结果显示，NaCl和ABA处理显著增强了PbGBF3启动子的转录活性（图5B）。此外，PbAPL2和PbSDH1的表达也在受到ABA和盐处理时与PbGBF3共同上调（图4B-F）。为了验证基因发挥功能的位置，作者还进行了亚细胞定位。结果显示，PbGBF3位于细胞核内（图5C-D），而PbAPL2和PbSDH1位于细胞膜上（图5）。实验结果表明，PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1共表达模块可能参与响应盐胁迫并受到ABA信号传导。![]()
图4. （A-C）梨组培苗中PbGBF3、PbAPL2和PbSDH1在NaCl处理下的相对表达水平。（B-D）梨组培苗中PbGBF3、PbAPL2和PbSDH1在ABA处理下的相对表达水平。
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图5. （A）梨愈伤组织中PbGBF3、PbAPL2和PbSDH1在NaCl和ABA处理下的表达水平。（B）NaCl和ABA处理增强了PbGBF3启动子的转录活性。（C-D）亚细胞定位。
5.PbGBF3在ABA信号影响下正向调节梨盐耐盐性
为了进一步研究PbGBF3的生物学功能，作者分别在拟南芥和梨愈伤组织中过表达PbGBF3，并分别在梨中沉默PbGBF3，然后进行盐胁迫和ABA处理。在正常生长条件下，野生型和转基因愈伤组织之间不存在表型差异。而盐胁迫处理后，与野生型的愈伤组织相比，PbGBF3过表达株系呈现出较强的抗盐性，鲜重和K+含量都有所提高（图6A、B、E），同时H2O2含量降低（图6C）、Na+浓度（图6D）和Na+/K+比值（图6F）在盐胁迫下都有所下降。从上述的实验中可以看出，PbGBF3对梨的耐盐性有正反馈调节作用。在ABA处理下，转基因植株表现出与盐胁迫下相似的响应趋势（图6）。作者随后评估了转基因愈伤组织在ABA存在时的耐盐性，结果表明，在盐和ABA联合处理下，PbGBF3转基因愈伤组织的生长速率、ROS和离子水平与单独盐处理相比没有显著差异，相反，野生型愈伤组织的生长速率显著降低。ROS水平升高（图6）。这些结果表明，PbGBF3可以增强植物的耐盐性并降低ABA介导的盐敏感性。![]()
图6. （A）不同处理下PbGBF3转基因梨愈伤组织的表型。（B）过表达株系鲜重提高。（C-F）H2O2含量、Na+浓度、K+浓度、Na+/K+比值变化。
6.PbGBF3激活PbAPL2和PbSDH1的启动子
上述的实验中，作者已经发现了PbAPL2和PbSDH1的表达受到ABA和盐处理的诱导，并与PbGBF3共表达，PbGBF3可能对PbAPL2和PbSDH1起到一定的调节作用。为了研究PbGBF3增强耐盐性的机制，作者分析了其对PbAPL2和PbSDH1表达水平的影响。实验结果显示，PbGBF3的过表达导致梨愈伤组织中PbAPL2和PbSDH1表达量显著上调（图7A），表明PbGBF3可能直接调控PbAPL2和PbSDH1的启动子。酵母单杂交结果表明，共表达PbGBF3以及全长或截短形式的PbAPL2（PA1-PA2）和PbSDH1（PS1-PS3）启动子的酵母细胞在SD/Leu和SD/Leu/ABA培养基上成功生长，这证实了PbGBF3与PbAPL2（图7B-D）以及PbSDH1（图6I-L）启动子区域之间的互作。为了进一步发掘PbGBF3与PbAPL2和PbSDH1启动子的结合位置，作者进行了EMSA实验。实验发现，结合信号的强度随着未标记靶序列数量的增加而降低，同时当目标顺式元件序列突变时，就无法产生结合（图6E，F，M-O）。这表明PbGBF3结合在PbAPL2和PbSDH1启动子的G-box基序上。同时，作者还使用双荧光素酶报告基因测定来研究PbGBF3是否在体内激活PbAPL2和PbSDH1的启动子。与对照相比，当PbGBF3与PbAPL2和PbSDH1共同表达时，观察到明显更高的荧光素酶比率（图6H、Q）。以上的实验表明，PbGBF3可能在体内激活PbAPL2和PbSDH1。![]()
图7. （A）PbGBF3转基因梨愈伤组织中PbAPL2和PbSDH1的表达量升高。（B-D）酵母单杂证明PbGBF3与PbAPL2启动子互作。（E-F）EMSA证明PbGBF3和PbAPL2启动子特异性结合。（G、P）构建表达载体示意图。（H、Q）双荧光素酶实验证实PbGBF3激活PbAPL2和PbSDH1的启动子。（I-L）酵母单杂证明PbGBF3特异性结合PbAPL2和PbSDH1的启动子。（M-O）EMSA证明PbGBF3特异性结合PbAPL2和PbSDH1的启动子。
7.PbGBF3-PbAPL2和PbGBF3-PbSDH1模型正向调节梨的耐盐性
为了确定PbAPL2和PbSDH1的生物学功能，作者在梨愈伤组织中过表达这两个基因，并进行盐处理。在正常生长条件下，WT和转基因愈伤组织之间不存在表型差异。而在盐胁迫下，过表达PbAPL2（图8A，B）和PbSDH1愈伤组织（图8G，H）比野生型长势更好，鲜重增加（图8B、H），K+水平更高（图8E，K），H2O2水平更低（图8C，I），Na+水平（图8D，J）和Na+/K+比率更低（图8F，L）。这结果表明PbAPL2和PbSDH1在调节梨的耐盐性中发挥积极作用。外源ABA处理后，PbAPL2和PbSDH1转基因愈伤组织的表型和生理指标表现出与盐胁迫相似的趋势。以上实验表明，PbAPL2和PbSDH1在ABA介导的耐盐性中发挥正调控作用。![]()
图8. （A、G）PbAPL2和PbSDH1过表达梨愈伤状态。（B-F）PbAPL2过表达梨愈伤较野生型鲜重增加、K+水平更高、H2O2水平更低、Na+水平和Na+/K+比率更低。（H-L）PbSDH1过表达愈伤较野生型鲜重增加、K+水平更高、H2O2水平更低、Na+水平和Na+/K+比率更低。
8.PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1增强梨ABA信号传导和耐盐性
为了研究PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1模型对ABA信号通路的影响，作者分析了PbGBF3过表达愈伤组织中ABA合成基因（PbABA2和PbNCED9）和ABA信号相关基因（PbPYL2）的表达水平以及ABA含量。在盐处理条件下，与野生型相比，转基因愈伤组织中ABA途径相关基因表达提高，ABA含量增加（图9A、B）。同样，在盐处理后过表达PbAPL2和PbSDH1的愈伤组织中也检测到ABA含量增加。这些观察结果表明，PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1模型在盐胁迫下增强了梨组织中ABA的信号传导，提高了耐盐性。为了进一步了解PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1介导的耐盐性的机制，作者检测了过表达PbGBF3和PbAPL2的转基因愈伤组织中的AGP和SDH活性，结果显示AGP和SDH活性提高（图9C-D）。综上所述，盐胁迫诱导ABA增加，从而促进PbGBF3的表达。![]()
图9. （A）转基因愈伤中ABA通路相关基因表达量提高。（B-D）盐胁迫后转基因愈伤中ABA含量、AGP活性和SDH活性均上升。
=== 总结 ===
PbGBF3通过改善植物细胞保护来增强胁迫耐受性的作用。盐胁迫诱导梨的ABA增加，从而促进PbGBF3的表达，然后PbGBF3可以激活PbAPL2、PbSDH1和ABA途径相关基因的转录，形成PbGBF3-PbAPL2-PbSDH1的调节模块，从而减轻ABA介导的生长抑制，使植物产生更高的ABA耐受性以适应不断变化的环境条件。该研究为理解ABA介导的盐敏感性反应的平衡与调控提供了新的见解，为梨抗逆种质资源的创制奠定了基础。![]()
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