2024年11月，北京林业大学尹伟伦院士/夏新莉教授团队在国际知名高水平期刊Plant Physiology上发表了题为Transcription factor PagWRKY33 regulates gibberellin signaling and immune receptor pathways in Populus的论文。本研究通过研究杨树中抗病相关转录因子PagWRKY33a/b，发掘下游直接靶基因，提出了PagWRKY33a/b通过直接激活NLR免疫受体NRG1.1的转录，增强杨树对外来病菌的抗性。同时，找到了关键互作蛋白E3泛素连接酶，为杨树的抗病研究提供了新的思路。
=== 研究背景 ===
为了适应自然界的逆境环境，植物进化出了多层次免疫系统。杨树作为世界上分布最广泛的木本植物之一，在广大的种植区域经常受到外来病菌侵染，严重影响了杨树木材的品质和产量。因此，探索杨树抗病相关的关键调控模块，对提高杨树存活率、改良木材品质有重要意义。拟南芥中，AtWRKY33已经被报导在植株抗病方面起到关键调控作用。然而在杨树中，AtWRKY33是否存在同源基因，同源基因是否在杨树自身免疫方面起到作用，目前仍没有相关报导。
# 思维导图： #根据原文整理，以原文为准，欢迎指正！ |
=== 研究结果 ===
1. PagWRKY33a/b功能丧失会触发自身免疫
此前，拟南芥的转录因子AtWRKY33在植物抗逆中多次被报导。因此作者推测，PagWRKY33是否在杨树中有类似的功能？作者首先鉴定了杨树中的100多个WRKY类转录因子，并通过和拟南芥AtWRKY33的同源比对找到了亲缘关系最近的两个转录因子，并命名为PagWRKY33a/b。作者首先利用PagWRKY33a/b的启动子驱动GUS基因创制了84K杨树转基因植株（图1A），发现在根中GUS信号最强，茎和叶中也有相关信号（图1B-E）。RT-qPCR也表明，PagWRKY33a/b在根中表达量最高（图1F-G）。亚细胞定位显示，PagWRKY33a/b定位在细胞核中（图1H-I）。为了测定PagWRKY33对外界病菌的响应机制，作者使用了两个不同真菌进行诱导，结果显示在C. Gloeosporioides感染后PagWRKY33a/b表达水平达到峰值（图2A、B）。在转基因杨树中，GUS酶活性在C. Gloeosporioides和Cytospora Chrysosperma诱导后达到峰值（图2C-E）。RT-qPCR结果显示，PagWRKY33a和PagWRKY33b对植物防御激素也有不同的反应，在脱落酸（ABA）和SA处理后下调，而在油菜素内酯（BR）和茉莉酸甲酯（MeJA）处理后上调（图2F-M）。综上，PagWRKY33a和PagWRKY33b在杨树根和叶中表达，它们的表达受病原体攻击和防御激素的调节。
接下来，作者利用CRISPR-Cas9系统创制了wrky33a、wrky33b、wrky33a/b，并创制了过表达株系，选取了其中表达量较高的株系进行后续实验。在C. Gloeosporioides感染的三周龄过表达株系oxPagWRKY33a-l2/l3和oxPagWRKY33b-l2/l5中，受感染的叶片面积和孢子数量明显低于WT（图3A、C），过表达株系在感染后死细胞面积减少（图3B）。而突变体株系表现出与过表达株系相似的抗性，其中wrky33a/b呈更强的抗性（图3A、B）。与WT相比，突变株每个叶面积的孢子数量更少，细胞死亡更少（图3B、C）。
基于以上结果，作者推测PagWRKY33a/b突变可能会通过诱导自身免疫增强其抗逆性。观察得知，突变体呈现出包括生长迟缓、叶片变小和提早衰老的表型，其中wrky33a/b受到的影响最大（图3D）。两周后，突变体的鲜重也低于WT和过表达株系（图3E）。三个月时，突变体株系与过表达株系和WT鲜重差别不大，但DW/FW较高（图3F-H）。wrky33a、wrky33b和wrky33a/b突变体的内源SA含量高于WT，其中wrky33a/b的内源SA含量约为WT的两倍（图3I）。在正常条件下，突变株中与致病性相关的基因NDR1、PR1、PR2等的表达上调（图3L、M）。感染C. Gloeosporioides后，WT和过表达株系的PagPR1和PagPR2表达量增加，而突变株的表达量始终保持在较高水平（图3J-M）。以上发现表明，在杨树中破坏PagWRKY33a/b的功能会诱导自身免疫，从而提高抗病性。
图1：（A）载体构建示意图（B-E）GUS信号强度（H-I）PagWRKY33a/b定位在细胞核中
图2：（A-B）PagWRKY33a/b表达受外来菌影响（C-E）GUS信号强度也受外来菌影响（F-M）PagWRKY33a/b表达受植物内源激素影响
图3：（A-C）过表达株系和突变体抗病性提高（D）突变体株系生长受阻（E-H）突变体的鲜重低于WT和过表达株系，DW/FW较高（I）wrky33a/b的内源SA含量约为WT的两倍（L-M）突变株中与致病性相关的基因表达上调（J-M）染病前后突变株致病基因表达量始终保持在较高水平
先前的研究中多次报道了GA信号在植物生长和发育调控中作用，GA生物合成或信号转导途径的破坏通常会导致植株矮小的表型。在wrky33a、wrky33b和wrky33a/b突变体中，作者观察到了生长抑制的表型。作者通过RNA-seq分析以及RT-qPCR分析发现，在oxWRKY33a和oxWRKY33b株系中，属于GASA家族的基因有不同程度的上调（图4A-C）。而GASA蛋白被报导参与了激素信号转导和植物生长发育的调控。于是作者推测，PagWRKY33a和PagWRKY33b可能通过调节GA信号通路来调控植物生长。于是作者通过GA及其抑制剂paclobutrazol（PAC）处理，检测了其对转基因杨树株系生长的影响。研究结果表明，GA能显著促进oxPagWRKY33a和oxPagWRKY33b株系的生长，而wrky33a/b双突变株系则没有受到明显影响（图4D-E）。PAC处理明显抑制了所有株系的生长，oxPagWRKY33a、oxPagWRKY33b、wrky33a/b突变体和野生型之间没有差异（图4D、F）。这表明wrky33a/b的生长抑制可能是由于PagWRKY33a和PagWRKY33b参与了调控赤霉素信号通路。
随后，作者发现PagWRKY33a和PagWRKY33b的转录随GA诱导而增加（图4G、H），并观察到PagWRKY33a蛋白随GA补充而在杨树中积累（图4I）。先前实验得知，突变株系表现出SA积累增加，而SA可抑制GA信号转导，于是作者用SA、SA和GA的组合以及PAC处理转基因株系。结果表明，在这三种条件下，PagWRKY33a蛋白的积累都有不同程度的减少（图4I）。由于在oxPagWRKY33a中PagGASA14的表达明显升高，作者随后的研究主要集中在GASA14的表达上（图4C）。PagGASA14在84K杨树幼叶中的表达量明显较高，而在成熟叶和老叶中的表达量则有所下降（图5A）。此外，PagGASA14的表达在GA诱导下明显增强（图5B）。RT-qPCR显示，PagWRKY33过表达株系在感染C. gloeosporioides后PagGASA14的表达明显增强，而在突变体株系中则下调（图5C）。这表明病原体诱导的GASA14表达上调受WRKY33调控影响。为了确定GASA14是否是WRKY33的直接靶标，作者在PagGASA14的启动子区域鉴定了11个W-box元件（图5E）。Y1H证实了PagWRKY33a和PagWRKY33b与PagGASA14启动子之间的互作（图5D）。LUC检测表明它们提高了GASA14的转录水平（图5F）。作者选择了最靠近转录起始位点的W-box元件，并通过EMSA证实了它们与PagWRKY33a和PagWRKY33b的结合活性（图5G）。综上结果表明，PagWRKY33a和PagWRKY33b通过调控PagGASA14以调节植物生长与免疫防御。
图4：（A-C）GASA家族基因在PagWRKY33中上调（D-F）GA促进PagWRKY33生长，wrky33a/b不受影响。PAC抑制所有株系生长（G-H）PagWRKY33a和PagWRKY33b的转录随GA诱导而增加（I）SA、SA/GA、PAC减少PagWRKY33a蛋白积累
图5：（A）PagGASA14在幼叶中的表达量较高，在成熟叶和老叶中的表达量较低（B）PagGASA14的表达在GA诱导下增强（C）PagWRKY33过表达株系在感染C. gloeosporioides后PagGASA14的表达增强，而在突变体株系中下调（D）Y1H证实PagWRKY33a和PagWRKY33b与PagGASA14启动子之间的互作（E）PagGASA14的启动子区域鉴出11个W-box元件（F）LUC检测表明W-Box提高了GASA14的转录水平（G）EMSA证实了它们与PagWRKY33a和PagWRKY33b的结合活性
在先前进行的RNA-seq分析中作者发现，参与氧化还原酶活性的多个基因在突变体株系中都出现了上调（图6A-B）。GO分析显示，过氧化物酶活性和钙离子结合以及蛋白质泛素化等早期免疫反应元素均富集（图6A-B）。接下来作者用DAB和NBT对三周的叶片进行染色，发现突变株wrky33a、wrky33b和wrky33a/b都含有较高水平的H2O2和O2-（图6C）。随着MV浓度的增加，PagWRKY33a::GUS和PagWRKY33b::GUS株系反应强度均增加（图6D-E）。
RNA-seq和RT-qPCR显示，在wrky33a、wrky33b和wrky33a/b突变体中，呼吸猝灭氧化酶同源物（RBOH）家族成员PagRBOHD和PagRBOHI的表达增加（图7A-B）。PagRBOHD和PagRBOHI启动子上均含有多个W-box（图7C），这表明PagWRKY33a和PagWRKY33b可能通过调控这些顺式作用元件来调控ROS的产生。双荧光素酶报告试验表明PagWRKY33a和PagWRKY33b抑制了这些基因的转录（图7D）。EMSA实验进一步证实了PagWRKY33a和PagWRKY33与PagRBOHD和PagRBOHI启动子的结合（图7E-F）。
接下来，作者用Y2H筛库找到了与PagWRKY33a互作的蛋白MKK1（图7G）。先前的研究表明，mkk1/mkk2双突变体表现出矮化、高浓度SA积累和抗病性增强，这可能与wrky33a/b获得的免疫力相关。BiFC证实了PagWRKY33a和PagMKK1的体内互作（图8C）。通过RT-qPCR，作者检测到PagMKK1在根部的表达水平最高，其次是成熟叶片（图8A）。这与PagWRKY33a在杨树中的组织特异性表达一致。作者还发现，MKK1在WT植株感染C. Gloeosporioides后下调（图8B）。因此，作者假设PagMKK1通过使PagWRKY33a磷酸化，以增强其与PagRBOHD和PagRBOHI启动子的结合力。通过激酶试验，作者验证了PagMKK1的体外激酶活性，证明它能够磷酸化WRKY结构域内的位点（图7I）。通过在烟草叶片中将PagMKK1与PagWRKY33a和PagWRKY33b以及PagRBOHD和PagRBOHI启动子的报告基因共同表达，作者观察到PagMKK1会提升PagWRKY33a对PagRBOHD和PagRBOHI启动子的抑制（图7H）。基于上述发现，作者得出结论：PagWRKY33a/b直接与PagRBOHD/I启动子结合并抑制其转录。此外，PagMKK1与PagWRKY33a互作并使其磷酸化，增强了其与下游靶标的结合能力。
图6：（A-B）参与氧化还原酶活性的多个基因在突变体株系中上调（C）突变体株系中都含有较高水平的H2O2和O2-（D-E）PagWRKY33a::GUS和PagWRKY33b::GUS株系反应强度随着MV浓度的增加而增加
图7：（A-B）PagRBOHD和PagRBOHI的表达在突变体中增加（C）PagRBOHD和PagRBOHI启动子上均含有多个W-box（D）双荧光素酶报告试验证实PagWRKY33a和PagWRKY33b抑制W-Box的转录（E）EMSA实验证实PagWRKY33a和PagWRKY33与PagRBOHD和PagRBOHI启动子结合
图8：（A）PagMKK1与PagWRKY33a在杨树中的组织特异性表达一致（B）MKK1在WT植株感染C. Gloeosporioides后下调（C）BiFC证实了PagWRKY33a和PagMKK1的体内互作
4.过表达PagWRKY33a/b诱导C. Gloeosporioides感染后的PagNRG1.1转录
在RNA-seq分析中，作者注意到特定NLRs在wrky33a、wrky33b和wrky33a/b突变体中表达量增加，尤其是在wrky33a/b突变株中，这表明这些突变株表现出自身免疫特征的观点。而在过表达的株系中也发现了几种NLR的上调，作者用RT-qPCR对NLR基因的表达量进行了确认（图9A-C）。随后作者发现，NLR的免疫受体NRG1.1在感染C. gloeosporioides后在oxPagWRKY33a和oxPagWRKY33b株系中表达量显著上调（图9D）。于是作者推测PagNRG1.1可能是PagWRKY33a和PagWRKY33b的直接靶标。在PagNRG1.1启动子区域发现了六个W-box元件，包括连续的P4和P5 W-box（图9E）。Y1H证实了PagWRKY33a/b与PagNRG1.1启动子之间的互作（图9F），荧光素酶试验表明PagWRKY33a/b促进了NRG1.1的转录（图9G）。接下来，作者选择了W-box元件P4/P5，并通过EMSA证实了它们与PagWRKY33a和PagWRKY33b的结合活性（图9H）。接下来，作者利用CRISPR-Cas9系统创制了突变体nrg1.1和oxWRKY33a/nrg1.1。感染C. Gloeosporioides后，与WT相比，nrg1.1表现出对外来病菌更高的敏感性，细胞死亡面积更大，单位叶面积孢子数量更高（图9I-K）。与oxWRKY33a株系相比，oxWRKY33a/nrg1.1株系对球孢子菌的抗性降低，感染表型与WT无显著差异，而与oxWRKY33a相比，细胞死亡面积更大，单位叶面积孢子数更高，（图9I-K）。因此，过表达PagWRKY33a和PagWRKY33b可直接激活NLR免疫受体NRG1.1的转录，从而增强杨树对C. Gloeosporioides的抗性。
图9：（A-C）转基因株系中NLRs表达量（D）NRG1.1在感染C. gloeosporioides后在oxPagWRKY33a和oxPagWRKY33b株系中表达量显著上调（E）PagNRG1.1启动子区域的W-box元件（F）Y1H证实了PagWRKY33a/b与PagNRG1.1启动子之间的互作（G）荧光素酶试验表明PagWRKY33a/b促进了NRG1.1的转录（H）EMSA证实了W-Box元件P4/5与PagWRKY33a和PagWRKY33b的结合活性（I-K）nrg1.1对外来病菌更敏感，oxWRKY33a/nrg1.1株系对球孢子菌的抗性降低
5.PagWRKY33a/b的破坏导致通过ROS的释放激活PagNRG1.1的转录
由于在wrky33a、wrky33b和wrky33a/b突变体株系中检测到PagNRG1.1表达的显著上调（图10A），作者推测突变体株系中的PagNRG1.1可能被其他信号激活。PagWRKY33a和PagWRKY33b的功能紊乱可能导致PagNRG1.1通过ROS的大量释放激活，氧化应激诱导的NLR表达证明了这一点（图10A）。作者还发现，ROS可诱导NRG1.1蛋白水平的增加（图10B）。
接下来，作者利用CRISPR-Cas9系统获得了突变体rbohd和wrky33a/b/rbohd。PagRBOHD功能的破坏导致wrky33a/b的ROS积累减少（图10C）。与wrky33a/b相比，PagNRG1.1在wrky33a/b突变体中的表达下调（图10D）。在感染C. Gloeosporioides后，wrky33a/b/rbohd的抗病性明显低于wrky33a/b，而rbohd没有表现出抗病性（图10E-G）。这表明过表达PagWRKY33a不仅能以NLRs依赖性方式获得免疫力，而且随着PagRBOHD功能的破坏，NLRs的表达也会降低（图10D）。这些发现表明，NLRs表达的积累受到ROS大量释放的影响，并且是ROS信号转导的下游。综上，PagWRKY33a和PagWRKY33b功能的破坏通过直接控制ROS的产生间接调节了NLR免疫受体PagNRG1.1的功能。在感染C. Gloeosporioides后，wrky33a/b/nrg1.1三重突变体的抗病性受损，而nrg1.1突变体没有表现出抗病性（图10H-J）。wrky33a/b/nrg1.1叶片中的H2O2和O2-积累水平与wrky33a/b没有显著差异，这表明PagNRG1.1是ROS信号转导的下游因子（图10K）。因此，PagWRKY33a和PagWRKY33b的功能中断所带来的免疫力是由NLR PagNRG1.1介导的。当PagNRG1.1缺失时，抗病性就会下降。
图10：（A）wrky33a、wrky33b和wrky33a/b突变体株系中PagNRG1.1表达显著上调（B）ROS可诱导NRG1.1蛋白水平的增加（C）PagRBOHD功能的破坏导致wrky33a/b的ROS积累减少（D）PagNRG1.1在wrky33a/b突变体中的表达下调（E-G）感染C. Gloeosporioides后，wrky33a/b/rbohd的抗病性低于wrky33a/b，而rbohd没有表现出抗病性（H-J）感染C. Gloeosporioides后wrky33a/b/nrg1.1抗病性受损，nrg1.1突变体无抗病性（K）wrky33a/b/nrg1.1叶片中H2O2和O2-积累水平与wrky33a/b无显著差异
6.E3泛素连接酶PagRNF5通过影响PagWRKY33a的稳定性调控84k杨树的生长和免疫力
通过对酵母筛库结果的分析，作者发现了152个可能与PagWRKY33a互作的植物防御相关基因，其中泛素连接酶相关蛋白最为常见（图11A）。作者发现具有核定位信号和Znf-C3HC4-RING结构域的E3泛素连接酶PagRNF5与PagWRKY33a存在互作（图12A-C）。考虑到RNF5在植物细胞中与泛素连接时的不稳定性，作者设计了一个在N端缺少Znf-C3HC4-RING结构域的PagRNF5蛋白，这种改造使PagRNF5定位在了细胞核中。（图12C）。Y2H和BiFC试验验证了PagWRKY33a和PagRNF5的互作（图11B-C）。Co-IP和Pull-down进一步证实了PagWRKY33a和PagRNF5在体内和体外条件的互作（图11D-F）。WB检测表明，PagRNF5可调节PagWRKY33a的稳定性（图11E）。接下来，为了评估PagRNF5在细胞中的作用，作者使用了PagRNF5-P2A-GFP构建物，发现完整的RNF5会降低WRKY33a蛋白水平（图11E）。泛素化实验表明，PagRNF5可以结合PagWRKY33a和泛素，促进PagWRKY33a的泛素化和降解（图11G）。此外，作者还观察到Gloeosporioides诱导了PagRNF5的表达（图6H）。
图11：（A）与PagWRKY33a互作的植物防御基因（B-C）Y2H和BiFC试验验证了PagWRKY33a和PagRNF5的互作（D-F）Co-IP和Pull-down证实了PagWRKY33a和PagRNF5的互作（G）PagRNF5促进PagWRKY33a的泛素化和降解（H）Gloeosporioides诱导PagRNF5的表达
=== 总结 ===
本研究中，作者通过拟南芥中抗病相关转录因子AtWRKY33入手，筛选到了杨树中的同源基因PagWRKY33a/b，发现了突变体会加强自身免疫。接下来，作者找到了PagWRKY33a/b下游的直接靶基因PagGASA14，又发掘了PagRBOH和PagNRG1.1在下游发挥的作用，最终形成了如图所示的PagWRKY33a/b抗病的调控通路。为杨树抗逆性的研究提供了新的见解。
原文链接（点击“阅读原文”）
～ The End! ～
