2023年4月西北农林科技大学江元清老师发表了题为ANAC087 transcription factor positively regulates age‐dependent leaf senescence through modulating the expression of multiple target genes in Arabidopsis的研究论文。通过对ANAC087转录因子的剖析，揭示了一种新的NAC TF介导叶片衰老过程，加深了我们对叶片衰老复杂调控网络的理解。![]()
=== 研究背景 ===
叶片是大多数植物产生能量和吸收养分的主要光合器官。叶片衰老涉及植物细胞和组织的程序性分解。激素、繁殖、干旱、热、冷和病原体攻击等多种内部或外部因素都会导致叶片衰老，是一个涉及基因表达的严格调控过程。例如：叶绿素降解会导致叶片变黄，加速叶片衰老；程序性细胞死亡（PCD）是叶片衰老的最后阶段，也是一个严格控制的过程；活性氧（ROS）在植物衰老的调节中也发挥着关键作用。因此，叶片衰老的开始时间和进程对于植物繁殖和健康至关重要。在植物中，叶片衰老的发生和进程受到复杂的信号转导和基因表达的严格调控。通常上述大多数基因诱导衰老会受到转录因子（TF）的调控。转录因子是基因表达中的关键蛋白，在胁迫反应或植物发育过程中与顺式作用元件相互作用，特异性激活或抑制基因表达。在油菜中已经有报道 NAC87 TF正向调节ROS积累和细胞死亡。也有报道证实ANAC087与ANAC046一起被确定为根冠发育 PCD的调节因子。作者通过对ANAC087转录因子的深入研究，阐明了其在叶片衰老中发挥的重要作用。
# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1. ANAC087在衰老叶片中上调，是一个转录激活因子
作者通过在拟南芥数据库中对不同组织的表达模式进行分析发现，ANAC087在衰老叶片中表现出较高的表达水平。为了证实这一点，作者采集了不同发育阶段的拟南芥叶片并进行了组织定量分析（图1A，B）。结果表明ANAC087是一个衰老相关基因。为了了解ANAC087的亚细胞定位，作者构建了ProANAC087驱动的ANAC087-GFP融合构建载体与核标记NLS-mCherry一起在烟叶中瞬时表达（图 1C）。结果显示ANAC087定位于细胞核中（图 1D）。通过酵母转录活性分析发现ANAC087是一个转录激活因子。![]()
图1. ANAC087的表达模式和ANAC087的转录活性测定。(A)不同发育阶段的拟南芥莲座叶的照片，(B)各阶段叶片中ANAC087的表达水平，(C)亚细胞定位分析使用的载体示意图，(D)ANAC087的亚细胞定位，(E)酵母中ANAC087转录激活测定为了研究ANAC087的功能，作者构建了CaMV35S启动子驱动的过表达载体，得到两个独立的IOE株系25#和42#用于叶片衰老分析。结果表明，在BE诱导后，ANAC087-IOE株系的叶片与对照植株相比提前衰老，而对照组（用稀释剂二甲亚砜[DMSO]处理）则没有显著差异（图2A）。DAB染色显示ANAC087-IOE株系的莲座叶明显染成深棕色，表明产生了H2O2（图2B）。过表达株系中过氧化氢的含量也显著高于对照（图2C）。经BE诱导后，ANAC087-IOE株系中的叶绿素含量显著低于对照，而在DMSO处理条件下未观察到显著差异（图 2D）。ANAC087-IOE株系的相对电导率显著增加，而模拟条件无明显差异（图2E）。通过NBT染色来检测O2−的产生，与对照植物相比，IOE-25#和IOE42#的叶片在BE诱导后被染成明显的蓝色（图2F）。以上结果表明ANAC087过表达能够促进叶片衰老。
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图2. ANAC087过度表达导致叶片早衰。(A)分别用BE与DMSO处理后对照与ANAC087过表达植株表型，(B) (A)中相应植物叶片进行DAB染色检测活性氧，(C) 过氧化氢含量，(D) 叶绿素含量，(E) 相对电导率，(F)NBT染色检测超氧阴离子。为了进一步研究ANAC087表达被阻断时转基因植物的表型，作者获得了三个T-DNA插入的纯合突变体。对这三个突变体和WT植物进行表型测定。可以看出，这三个突变体的莲座叶的衰老速度比WT植物稍晚（图3A）。叶绿素含量的进一步定量测定表明，三个anac087突变体的叶绿素含量高于对照（图 3B）。接下来，作者又利用显性抑制技术来研究ANAC087的功能，首先生成了两个独立的ANAC087-SRDX系17#和21#用于表型分析。结果表明，两个ANAC087-SRDX转基因株系叶片衰老更晚（图3C）。叶绿素含量显著高于对照植物，并且这两个ANAC087-SRDX转基因株系的相对导电率显著低于WT（图3D，E）。这些结果表明ANAC087的显性抑制延迟了叶片衰老进程。
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图3. T-DNA插入和ANAC087显性抑制系的叶片衰老分析。(A)对照与ANAC087的三个 T-DNA插入突变体的叶片衰老分析，(B)测量(C)中第5-8个莲座叶的叶绿素含量，(C)对照与ANAC087-SRDX转基因植物的叶片比较，(D)总叶绿素含量，(E)相对电导率。4. ANAC087过表达可激活一些与PCD和叶片衰老相关的基因的表达
由于ANAC087是一种转录激活因子，且相关转基因植物的表型很明显，作者通过鉴定其下游靶基因以阐明其促进叶片衰老的分子机制。对与ANAC087共表达基因的分析筛选了一些PCD和衰老调节基因，选择了与叶绿素分解代谢、PCD、ROS产生或清除相关的几个标记基因以及一些SAG。通过qRT-PCR进行分析发现大部分基因在ANAC087过表达株系中都显著上调（图4）。为了进一步检查ANAC087与上述差异表达基因（DEG）之间的调控关系，作者进行了双荧光素酶报告基因测定。将DEG的启动子（包括5'UTR）克隆到报告质粒中，并使用重组质粒pYJHA-ANAC087作为效应子（图5A）。结果表明，ANAC087可以显著激活NACRS驱动的LUC表达的活性（图5B）。然后在2天和3天时分别测量靶基因的相对LUC/REN比率（图5C-M）。可以看出，与GFP表达对照相比，3个CCGtype（NYE1、PPH和PAO）基因的启动子在2和3 dpi时被 ANAC087表达显著激活（图 5C-E）。此外，与PCD（BFN1、MC9、VPE和CEP1和ROS产生（RbohD）相关的基因启动子也显示出具有较高LUC/REN比率（图5F-K）。此外，SAG13和SAG15启动子的相对LUC/REN比率也显著高于GFP对照（图5L，M）。![]()
图4. 对照与ANAC087过表达株系中衰老相关基因的表达分析![]()
图5. ANAC087激活一系列与衰老相关的基因的启动子活性.(A)双荧光素酶 (LUC) 报告基因检测中使用的报告基因和效应质粒的示意图，(B–M) LUC结果，通过农杆菌介导在烟草叶片中瞬时表达。5. ANAC087直接结合细胞死亡和衰老相关基因的启动子
上述结果表明ANAC087激活了几个假定靶基因的表达，然后作者又通过EMSA和ChIP-qPCR以确认它们之间体外和体内直接调节关系。EMSA证实了 ANAC087结合的顺式元件NACRS(5'-TTNCGT-3')，并且CGT核心基序改为 ATC的突变探针未能竞争GST-与天然探针的结合。而之前的LUC分析的10个DEG（BFN1、PAO、αVPE、PPH、MC9、RbohD、CEP1、SAG13、NYE1、SAG15）的启动子区域，发现它们都含有不同数量的NACRS基序（图 6A）。EMSA结果显示GST-ANAC087融合蛋白能够与每个启动子的F1探针结合并引起迁移率变化，而单独的GST则没有这种效果（图6B）。此外，还进行了体内ChIP-qPCR测定，以验证ANAC087和这些假定靶基因启动子之间的直接相互作用。结果显示ProNYE1的P1和P3片段显著富集，而对照片段没有显著差异（图7A）。另外两种CCG，PAO和PPH没有表现出显著的富集（图7H，I），表明它们可能不是ANAC087体内的直接靶标。与PCD、ProCEP1、ProBFN1和ProMC9相关的基因的启动子显示出ANAC087的显著富集（图7B、G、J），但ProαVPE没有（图7C）。ROS相关基因RbohD与对照相比，仅P1显示出ANAC087 TF的显著富集（图7D）。两个SAG（SAG13和SAG15）均显示出 ANAC087 TF的显著富集（图7E、F）。
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图6. ANAC087与靶基因启动子结合的电泳迁移率变动分析 (EMSA) 。(A)靶基因启动子中NACRS元件的位置和数量，(B) EMSA 结果。
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图7. 免疫共沉淀(ChIP-qPCR)确认ANAC087与拟南芥中靶基因启动子结合.(A-J) 对照与转基因过表达系 ANAC087-IOE 25# 12日龄时用10 μM BE处理24小时后ChIP-qPCR结果6.ANAC087转基因株系的早期叶片衰老在bfn1突变体中得到缓解
ANAC087过表达导致叶片衰老，并伴有叶绿素降解和PCD。为了了解ANAC087与代表性靶基因之间是否存在遗传关系，作者首先选择了BFN1，因为它编码一种双功能核酸酶，在核苷酸降解中发挥重要作用，能够促进衰老期间核苷酸和磷酸盐的恢复。为了探索ANAC087和BFN1在调节叶片衰老方面的遗传关系，作者通过在T-DNA插入bfn1突变体的背景下过表达ANAC087生成 ANAC087-IOE/bfn1植物。通过对比不同基因型间的叶片衰老表型可以看出，在DMSO模拟处理下，35d时不同植株的叶片衰老程度相似，而用10 μM BE诱导7 d后，ANAC087-IOE的叶片加速衰老表型被bfn1突变抑制（图 8A）。在DMSO 模拟条件下，不同基因型的叶绿素含量和相对电导率没有显著差异（图 8B、C）。BE诱导后，ANAC087IOE/bfn1株系的叶绿素含量与GUS-IOE和WT对照相当，并且ANAC087IOE/bfn1-52#的叶绿素含量显著低于bfn1突变体（图8D）。ANAC087-IOE株系的相对电导率与其它基因型相比显著增加（图 8E）。以上结果表明BFN1功能的丧失抑制了ANAC087-IOE株系加速叶片衰老的表型。
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图8. BFN1突变减轻了ANAC087诱导过表达系的叶片早衰表型。(A)35日龄转基因植物和野生型 (WT) 植物的叶片衰老测定，每天喷洒10 μMBE，DMSO处理的植物用作对照。(B-E)在DMSO和BE条件下不同基因型莲座叶的叶绿素含量和相对电导率。7.NYE1突变缓解ANAC087过表达引起的叶片早期衰老
叶绿素降解是衰老叶片的典型特征，NYE1在叶片衰老过程中叶绿素降解中发挥着重要作用。NYE1在衰老叶片中高度且特异地表达，作者创制了nye1-1突变体用于生成ANAC087-IOE/nye1-1植物进行遗传分析，用BE和DMSO处理不同基因型的4周龄植物，并测量相关生理指标。在DMSO处理条件下，不同基因型之间没有显著的形态差异（图9A），叶绿素含量和相对电导率只有细微的差异（图9B、C）。在BE处理后，ANAC087-IOE株系表现出明显的早期叶片衰老，而nye1-1突变体与WT植物相比仍保持绿色，与ANAC087-IOE植物相比，ANAC087-IOE/nye1-1植物还表现出叶片衰老延迟（图 9A）。叶绿素含量测定结果显示，ANAC087-IOE植株的数据显著低于任何其他基因型；而nye1-1植物的叶绿素含量显著高于GUS-IOE和WT植物（图9D）。与ANAC087-IOE植物相比，ANAC087-IOE/nye1-1植物的相对电导率也显著降低（图 9E）。以上数据表明，ANAC087过表达所促进的早期叶片衰老表型可以通过其靶基因NYE1的突变得到缓解。![]()
图9. nye1-1突变体背景下ANAC087-IOE株系的早期叶片衰老表型得到缓解。(A)35日龄不同基因型叶片衰老分析，每天喷洒10 μMBE，DMSO处理的植物用作对照。(B-E)在DMSO和BE条件下不同基因型莲座叶的叶绿素含量和相对电导率。
=== 总结 ===
ANAC087可由内部或外部刺激诱导。然后，ANAC087通过直接结合启动子中的NAC识别序列（NACRS）基序，激活与叶绿素降解、细胞死亡、活性氧（ROS）积累和衰老相关的几组不同基因的表达，最终导致叶片衰老。
期刊：Journal of Integrative Plant Biology
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