2024年7月12日，广西大学生命科学与技术学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室团队在The plant journal上联合发表了题为Xanthomonas oryzae pv. oryzicola effector Tal10a directly activates rice OsHXK5 expression
to facilitate pathogenesis的研究论文。该研究证明了Tal10a对Xoc完全毒力的重要性，确定OsHXK5是Tal10a的宿主靶点，Tal10a可以激活OsHXK5的表达从而增加水稻的易感性，提示了OsHXK5可能是培育抗病水稻品种的潜在靶点。![]()
细菌性条斑病（BLS），由水稻黄单胞菌稻条斑致病变种（Xanthomonas
oryzae pv. oryzicola，简称Xoc）引起，是水稻的一种主要细菌性病害。单黄胞菌通过II型分泌系统(T3SS)将II型分泌效应物(T3SEs)传递到宿主细胞中，以支持植物免疫并促进感染。转录激活因子样效应物 (Transcription activator-like
effector, TALEs) 是T3SS效应物的一种，可易位到植物细胞核中，作为转录因子对宿主转录组进行重编程。TALEs的结构是保守的，在N端包含一个II型分泌信号、一个中央重复区(CRR)、核定位信号和一个C端转录激活域(AD)。最近，在Xoo中发现了一个隐藏的TALE(Tal6b/AvrXa27A)，它同时靶向水稻中S基因OsSWEET11a和R基因Xa27。在黄单胞菌中已经发现了多种与Tale相关的毒力靶点，X.oryzae pv. oryzicola (Xoc)也具有多个TALEs，越来越多的研究关注TALEs在促进细菌毒力方面的作用。
# 思维导图：
![]()
#根据原文整理，以原文为准，欢迎指正！
|
![]()
1. Tal10是X. oryzae pv. oryzicola的一种毒力因子
研究人员利用同源重组在Xoc GX01中构建一个无TALE的多突变株。与野生型GX01相比，Tal10基因群(∆tal10)的缺失导致损伤明显缩短，这表明Tal10与GX01的毒力有关(图S1a,b)。补体实验将Tal10a重新引入到∆tal10中可以恢复∆tal10对NIP受损的毒力(图S1a,b)。Tal10a是BL256中Tal3a的同源物，在几个Xoc菌株中保守(图S1c) 。但BLS256中Tal3a的缺失并没有导致毒力的显著变化。为了验证Tal10a在GX01毒力中的重要性，将野生突变体GX01和tal10在同一片叶片的中脉两侧对称接种，并排测定病变长度。∆tal10突变体的毒力低于野生型GX01，而野生型和补体株没有显著差异(图1a,b)。这些结果表明，Tal10a参与了GX01的毒力。为了研究Tal10a是否能抑制水稻的防御反应，研究人员检测了接种GX01、∆tal10和补体菌株∆tal10/Tal10a水稻叶片中部分防御相关基因的转录变化。与野生型菌株相比，OsPR1b和OsPR10b在∆tal10胁迫的水稻叶片中表达上调(图1c,d)。通过免疫印迹分析与野生型和补体菌株相比，∆tal10胁迫下水稻叶片的MAPK激活在30分钟时增加(图1e)。这些数据表明，Tal10a可以抑制水稻的先天免疫。
![]()
图S1. Tal10a 在Xoc菌株GX01中对致病力的贡献。(a)
NIP中，Xoc菌株 GX01、Δtal10 和 Δtal10/Tal10a接种后病变表型。 (b) Xoc菌株GX01、Δtal10和Δtal10/Tal10a 接种14天，NIP病变长度。 (c) Xoc菌株Tal10a同源蛋白的比对和系统发育关系。![]()
图1. Tal10a与水稻GX01毒力有关。(a) Xoc菌株GX01、∆tal10和∆tal10/Tal10a接种后NIP病变表型。(b)接种Xoc菌株GX01、∆tal10和∆tal10/Tal10a 14天NIP的病变长度。(c, d)接种Xoc菌株GX01、∆tal10和∆tal10/Tal10a 72 h后，NIP中OsPR1b (c)和OsPR10b (d)的相对表达量。(e)接种Xoc菌株GX01、∆tal10和∆tal10/Tal10a 30 min后NIP中MAPK的激活情况。
2. OsHXK5是Tal10a的候选靶基因
为了确定Tal10a的潜在靶标，研究人员预测水稻基因启动子区域的Tal10a- ebes。与GX01相比，OsHXK5是∆hrcC胁迫下水稻叶片中唯一下调的基因。因此，本研究将重点放在OsHXK5上进行进一步研究。OsHXK5编码一个具有n端跨膜结构域(mTPs和NLS)和两个己糖激酶结构域的己糖激酶(图S2a)。此外，系统发育分析显示，OsHXK5在水稻中与OsHXK6的同源性最高，与小麦HvHXK5和玉米ZmHXK5的同源性比与烟草NtHXK5和拟南芥AtHXK1的同源性更密切(图S2b)，表明OsHXK5在植物中是保守的。![]()
图 S2. OsHXK5的序列分析。(a) 基于序列比对的OsHXK5功能域分析。(b) 来自不同植物物种的OsHXK5及其同源蛋白的系统发育分析。
3. Tal10a靶向并激活OsHXK5的表达
为了确定OsHXK5是否是Tal10a的真正靶点，研究人员测定了接种不同Xoc菌株的稻谷组织中OsHXK5的基因表达水平。相对于模拟接种的叶片，GX01接种的叶片显著诱导了OsHXK5转录本，而∆tal10接种的叶片则消除了这种诱导(图2a)。在接种了∆tal10/Tal10a的叶片中，OsHXK5的表达被诱导到与GX01感染的叶片相似的水平(图2a)，这表明GX01诱导的OsHXK5的表达依赖于Tal10a的存在。通过EMSA研究Tal10a是否与OsHXK5的启动子区结合。结果表明，Tal10a直接结合到OsHXK5的启动子区域(图2b)。通过烟草瞬时表达，发现与单独表达Tal10a或pHXK5相比，Tal10a和pHXK5共表达可产生较强的荧光，说明Tal10a诱导OsHXK5表达具有特异性(图2c)。综上所述，这些结果表明Tal10a能够诱导OsHXK5的表达。![]()
图2. Tal10a通过结合启动子的EBE激活OsHXK5的表达。(a)接种Xoc菌株GX01、∆tal10和∆tal10/Tal10a后24、48和72 h, NIP中OsHXK5的相对表达量。(b)EMSA。(c)烟草瞬时表达。
4. EBE位点的破坏破坏了水稻Tal10a介导的易感性
为了验证突变OsHXK5 EBE位点是否会赋予水稻对Xoc的抗性，作者设计了一种靶向OsHXK5 EBE位点的单导RNA (gRNA)，并通过农杆菌介导的转化将其转化为NIP。鉴定了两个具有同源EBE突变的T2水稻系gEBE-6和gEBE-9。测序分析显示，gEBE-6在EBE区有一个1 bp的插入，gEBE-9在EBE区有一个-17/+9的插入(图3a,b)。瞬时表达试验来研究Tal10a是否能识别gEBE系中突变的EBE位点。烟草叶片中pEBE-6或pEBE-9与Tal10a共表达不产生荧光(图3c)。gEBE植物中OsHXK5的Tal10a依赖性诱导被消除(图3d)。这些数据表明，OsHXK5的Tal10a依赖性诱导依赖于相应上游Tal10a-EBE的完整性。为了评估潜在抗性，将野生型NIP和2个gEBE品系分别接种GX01和∆tal10。接种14天后，GX01在两个gEBE系中引起的病变长度小于NIP(图3e)。然而，在gEBE系中，∆tal10引起的病变长度与NIP相似。这些结果表明oshxk5促进Xoc易感性的能力依赖于Tal10a的存在。
![]()
图3. OsHXK5启动子EBE基因编辑增强水稻对GX01的抗性。(a, b) OsHXK5启动子在NIP中的示意图及编辑水稻品系的分析。(c)烟草瞬时表达。(d) 接种GX01或∆tal10 24 h后，NIP和OsHXK5基因编辑系中OsHXK5的相对表达量。(e) GX01或∆tal10激发的NIP和OsHXK5基因编辑细胞系中病变扩展的表型。(f)接种GX01或∆tal10后14天NIP和OsHXK5基因编辑系的病变长度。
5. OsHXK5诱导增强毒力
根据上述结果，作者假设，携带dTALE的GX01特异性诱导OsHXK5可以恢复gEBE-6系中受损的毒力。设计了一个设计TALE (dTALE-6)来特异性识别基因编辑植物gEBE-6中Tal10a的突变EBE(图4a)。dTALE-6和pEBE-6共表达在烟草中产生较强的荧光，而dTALE-6和pEBE-6共表达不产生任何信号(图4b)，说明dTALE-6具有识别Tal10a突变EBE的能力，而不能识别原始EBE。随后，作者检测了GX01/dTALE-6在gEBE-6植物中促进OsHXK5表达的能力。与瞬时表达结果一致，GX01/dTALE-6特异性显著诱导OsHXK5(图4c)。作者又分别用GX01/Ev和GX01/dTALE-6接种gEBE-6植株。GX01/dTALE-6在gEBE-6植物中引起的病变长度比GX01/Ev引起的病变长度长(图4d,e)。这些结果进一步证明了Tal10a激活OsHXK5促进水稻易感。
![]()
图4. OsHXK5表达与毒力增强相关。(a)基因编辑系gEBE-6启动子区设计的dTALE。(b)烟草叶片瞬时表达。(c)接种GX01/Ev或GX01/dTALE-6后24 h基因编辑系gEBE-6中OsHXK5的相对表达量。(d) GX01/Ev和GX01/dTALE-6接种后基因编辑系gEBE-6损伤扩展的表型。(e)接种GX01/Ev和GX01/dTALE-6后14天基因编辑系gEBE-6的损伤长度。
6. OsHXK5的过表达增加了水稻对Xoc的敏感性
为了进一步探索OsHXK5在水稻免疫应答中的作用，作者构建了OsHXK5过表达株系。与野生型植物NIP相比，两个过表达系OsHXK50E-1和OsHXK50E-9的OsHXK5转录物水平分别增加了9倍和5倍(图5a)。随后，作者评估了OsHXK5过表达植株对GX01的潜在抗性。抗病试验显示，与野生型植株相比，OsHXK5过表达植株的病变更大(图5b,c)。RT-qPCR分析显示，接种∆hrcC后，OsHXK5过表达植株中OsPR1b和OsPR10b的表达明显低于野生型植株(图5d)。此外，MAPK在OsHXK5过表达植株中的激活水平低于野生型植株(图5e)。综上所述，OsHXK5对水稻BLS抗性和防御反应有负向贡献。![]()
图5. OsHXK5的过表达损害了水稻的基础防御。(a)OsHXK5在NIP和OsHXK5过表达系中的相对表达量。(b) GX01刺激后NIP和OsHXK5过表达系病变扩展的表型。(c)接种GX01后14天NIP和OsHXK5过表达系的病变长度。(d)接种∆hrcC后24 h, NIP和OsHXK5过表达系中OsPR1b和OsPR10b的相对表达量。(e) ∆hrcC接种1 h后NIP和OsHXK5过表达系的MAPK激活情况。
7. 同时编辑S基因OsSULTR3;6和OsHXK5增强水稻对Xoc的抗性
利用CRISPR/ cas9介导的基因编辑技术对水稻品种中华11号(ZH11)的S基因OsSULRT3;6的EBE突变。命名为ZT0918的水稻品系在OsSULTR3;6 EBE上有一个6 bp的缺失(图6a,b)。随后，作者设计了两个靶向OsHXK5和OsSULTR3EBE的引导RNA (gRNA)(图6a,b)，并将其同时克隆到载体pYLCRISPR/Cas9中。最终，我们通过遗传分离从T2水稻系Z151608中鉴定出一株具有OsHXK5和OsSULTR3;6的纯合突变。PCR扩增和测序分析显示，2151608在OsSULTR3上含有一个- 10/+3的缺失，在EBE上含有6个缺失，在OsHXK5 EBE上含有一个7bp的缺失(图6a,b)。接种GX01 24小时后，我们测定了OsSULTR3;6和OsHXK5在2151608中的表达量。与野生型植株相比，OsSULTR3;6和OsHXK5在2151608中的转录量显著降低(图6c)。将野生型ZH11、OsSULTR3;6 EBE突变体ZT0918和OsSULTR3;6 OsHXK5 EBE突变体Z151608接种于Xoc菌株GX01上。结果显示，GX01对水稻品系Z151608的损伤明显小于对水稻品系ZT0918和野生型植株的损伤(图6d,e)。这些结果表明，经过编辑的植株Z151608通过逃避相应的TALE诱导，表现出对BLS的抗性增强。![]()
图6. CRISPR/ cas9介导的OsSULTR3;6和OsHXK5靶向诱变增强了对Xoc的抗性。(a, b) ZH11中OsSULTR3;6和OsHXK5启动子示意图及编辑水稻品系分析。(c)接种GX01后，OsSULTR3;6和OsHXK5在ZH11和Z151608中的相对表达量。(d) GX01侵染ZH11、ZT0918和Z151608的病变扩展表型。(e)接种GX01后14天，ZH11、ZT0918和Z151608的损伤长度。![]()
在这项研究中报道了Tal10a作为一种毒力因子，靶向宿主S基因OsHXK5。在Xoc感染期间，Tal10a被分泌并转运到宿主细胞核中，从而与OsHXK5启动子结合，激活OsHXK5的表达。OsHXK5可以抑制PR基因表达和MAPK活化，导致易感性(图7)。本研究强调了Xoc TALE Tal10a靶向水稻葡萄糖传感器基因OsHXK5抑制宿主基础抗性和促进感染的潜在机制。这些见解促进了我们对tale介导的寄主-病原体相互作用的理解，为水稻抗病育种提供了新的思路。![]()
图7. Tal10a在水稻- Xoc相互作用中功能的工作模型。
------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
～ The End! ～
![]()
