2024年6月7日，中国林科院林木遗传育种全国重点实验室李全梓/闫晓婧团队教授课题组在Horticulture Research上在线发表了一篇题为“MiR319a-mediated salt stress response in poplar”的研究论文，该研究阐明了miR319通过两种机制协调杨树对盐胁迫的响应，丰富了次生木质部结构和长距离离子运输平衡在杨树耐盐性中协同作用的理解。维持细胞内离子平衡，特别是Na+和K+，在植物对盐胁迫的反应中起着重要作用。木质部的导管负责维管植物中的长距离离子运输，由于树木较长的生长周期和独特的次生生长结构，树木应该进化出特定的Na+/K+长距离运输机制来适应和耐受盐胁迫，并且这种运输调节机制可能与一年生草本植物不同，然而在树木这方面的研究很少，对关于木本植物盐胁迫反应的了解有限。![]()
# 思维导图
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由于84K杨（Populus alba×P. glandulosa）miR319家族9个成员的pre-miRNA序列不同，作者首先检查了miR319成员在包括叶、茎和根在内的不同组织中的表达模式。RT-qPCR分析检测到茎和叶中miR319a丰度相对较高，而根中丰度较低（图1A）。为了研究杨树中miR319对盐胁迫的响应，作者用150 mM NaCl处理杨树约7天，并通过RT-qPCR测定盐胁迫后叶、茎和根不同组织中miR319的积累水平，结果表明茎中miR319a表达水平在氯化钠处理后相对增加最显著（图1B）。这些结果表明，木本植物茎和叶中miR319a的丰度较高，盐胁迫增强了杨树茎中miR319a的积累。图1.在对照和盐水条件下杨树中miR319丰度的RT-qPCR分析。(A)杨树不同组织中miR319a-i的丰度。(B)150 mM NaCl盐胁迫下不同组织中miR319a-i的表达水平。为了研究miR319a在杨树响应盐胁迫中的功能，作者分别培育了MIR319a过表达和抑制的转基因株系。选择两个OsaMIR319a过表达增强转基因系（319-OE1和319-OE-2）和两个miR319a丰度显著降低的抑制转基因株系（319-MIM-22和319a-MIM-25）用于后续研究。2月龄WT、miR319a-OE和miR319a-MIMIC转基因植物用150 mM NaCl处理14天后，与WT相比，miR319a-MIMIC转基因植物（319MIM-22和-25）的叶表现出更明显的萎蔫和失绿，而miR319a-OE转基因植物（319-OE-1和-2）的叶生长比WT更好（图2A和B），且miR319a-OE转基因植物的高度和生物量增加（图2C和D）。作者检测了转基因植物从地下到地上不同组织中Na+和K+的含量。在150 mM NaCl处理之前，WT、miR319a-OE和miR319a-MIMIC转基因植物的根、木质部、树皮和叶中的Na+/K+比率没有显示显著差异（图2E-H）。盐处理后，与WT相比，在根部和树皮中，miR319a-MIMIC转基因植株的Na+/K+比率显著减少，miR319a-OE转基因植株中Na+/K+比率显著增加；在木质部和叶片中，miR319a-MIMIC转基因植物的Na+/K+比值显著增加，而miR319a-OE转基因植物中Na+/K+比值显著降低（图2E-H）。这些结果表明，miR319a-MIMIC转基因植物在木质部和叶中比WT植物积累了更多的Na+，而miR319a-OE转基因植物在根和树皮中积累了更多的K+。因此，作者推测miR319a通过影响Na+从根到地上部的转运以及茎木质部的Na+流出来正向调节杨树的耐盐性。![]()
图2.野生型(WT)、miR319a-MIMIC和miR319a-OE转基因杨树的耐盐性表型分析。(A)在对照和150 mM NaCl盐处理下，2个月大的WT、miR319a-MIMIC转基因系（319-MIM-22和-25）和miR319a-OE转基因系。(B)在对照和150 mM NaCl盐处理下，WT、319-MIM-22和319-OE-1转基因植物的顶叶表型。(C–D)150 mM NaCl盐处理后，WT、miR319a-MIMIC和miR319a-OE转基因植物的相对高度增加和生物量减少。(E-H)WT、miR319a-MIMIC和miR319a-OE转基因植物在对照和150 mM NaCl下的根、木质部、树皮和叶中的Na+/K+比率。3.miR319a调控与盐胁迫反应和木质部细胞壁发育相关的基因为了进一步研究miR319a调节盐胁迫的分子机制，作者对WT、miR319a-MIMIC和miR319a-OE转基因植物的分化木质部组织进行了高通量转录组测序（RNA-seq）。结果表明miR319a-MIMIC转基因植物有67个DEG，其中46个上调，21个下调（图S4A）。而在miR319a-OE转基因植株中，总共有492个DEG，其中462个上调，30个下调（图S4B）。GO分析表明，miR319a-MIMIC和miR319a-OE转基因植物中的大多数DEG可分为两类：一类与植物盐胁迫响应过程相关，另一类与木质部相关细胞壁发育（图S4C）。为了验证RNA-Seq结果并检测盐胁迫下两类基因的表达水平，作者选择测序结果中的部分基因进行RT-qPCR。在与盐胁迫反应相关的类别中，最重要的是PagSKOR1-b基因，一种负责K+长距离运输的蛋白质。该基因的表达水平在盐胁迫后显著增加，在miR319a-OE转基因植物中表达水平最高，在miR319a-MIMIC转基因植物中表达水平最低（图3A）。非生物胁迫反应因子基因PagFBS1、PagChlAKR和PagHMG1的表达水平在盐胁迫后显著变化（图3A）。作者还检测到了调节离子转运的PagHKT1;2、PagSOS1和PagNHX2的表达水平在miR319a-MIMIC中降低，而在miR319a-OE转基因植物中升高，与非生物胁迫相关的PagRD29A基因在miR319a-MIMIC中下调，而在miR319a-OE转基因植物中上调（图3B）。在另一组与木质部细胞壁发育相关的基因中，调节次生细胞壁生物合成的转录因子基因PagMYB52在盐胁迫后在miR319a-OE中上调，在miR319a-MIMIC中下调（图3C）；PagABCB15编码参与木质部导管形成的关键调节因子，PagXTR6编码细胞壁成分合成的关键酶，在miR319a-OE中上调，在miR319a-MIMIC中下调（图3C）。PagTRM12与细胞分裂和分化相关，在盐胁迫后在miR319a-MIMIC中上调，在miR319a-OE中下调（图3C）。此外，参与杨木质部导管形成（PagXCP1）、次生细胞壁沉积（PagIRX15）、次生细胞壁形成（PagVND6）和形成层细胞活性（PagWOX4）的调节基因的表达水平在miR319a-OE中增加并在miR319a-MIMIC转基因植物中减少（图3D）。上述分析结果表明，miR319a主要调控杨树盐胁迫反应和木质部细胞壁发育基因的表达。![]()
图4S.木质部RNA-seq测序分析。(A)miR319a-MIMIC转基因植株差异表达基因(DEG)。(B)miR319a-OE转基因植株差异表达基因(DEG)。(C)基因本体（GO）富集分析。图3.对野生型(WT)、miR319a-MIMIC(319-MIM-22)和miR319a-OE(319-OE-1)分化木质部中盐胁迫相关基因和木质部发育相关基因进行RT-qPCR分析。(A)与盐胁迫反应相关的基因的表达水平。(B)报道的与盐胁迫反应相关的基因的表达水平。(C)与木质部细胞壁发育相关的基因的表达水平。(D)与木质部细胞壁发育相关的基因的表达水平。4.miR319a调控盐胁迫后杨树茎次生木质部发育为了进一步探讨miR319a响应盐胁迫的机制，作者对2个月大的WT和转基因植物在150 mM NaCl处理下进行次生生长的第10个节间的茎横截面进行了分析。盐处理后发现，与对照（未盐处理）相比，miR319a-MIMIC转基因植株形成层细胞层数增加19.6%（图4B、E），次生木质部层数增加5.1%（图4A和F）；但在miR319a-OE转基因植物中，形成层细胞层数减少了43.8%（图4B、E），次生木质部层数增加了36.9%（图4A、F）。导管是植物体内运输水和无机盐离子的主要通道。因此，作者通过扫描电子显微镜（SEM）进一步检查了野生型和转基因植物第10节间茎横截面的木质部导管。与对照相比，盐胁迫下的miR319a-MIMIC转基因植物的导管数量相对增加（9.1%）（图4C、G），导管面积相对减少（4.4%）（图4D、H），细胞壁厚度相对减少的（8.6%）（图4D、I）。而盐胁迫下的miR319a-OE转基因植物与miR319a-MIMIC植物相比表现出更高程度的改变，导管数量相对增加26.9%（图4C、G），导管腔面积相对增加18.2%（图4D、H），细胞壁厚度相对减少19.5%（图4D、I）。作者还观察到在miR319a-MIMIC和miR319a-OE转基因植物中，木质部纤维数量的相对增加分别为6.3%和46.6%（图4C、J），木质部纤维管腔面积的相对增加分别为-13.7%和10.5%（图4D、K），木质部纤维细胞壁厚度的相对减少分别为4.17%和10.8%（图4D、L）。上述结果表明，盐胁迫后杨树茎形成层数减少，次生木质部变宽，导管和纤维细胞数量增加，次生壁变薄。这些结果还表明miR319a在盐胁迫后次生木质部细胞的发育中发挥重要作用，miR319a可能通过减少次生细胞壁的厚度、增加导管和纤维的管腔面积来调节杨树对盐胁迫的响应。![]()
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图4.野生型(WT)、miR319a-MIMIC和miR319a-OE转基因杨树中次生木质部发育相关的表型分析。(A-B)WT、miR319a-MIMIC(319-MIM-22)和miR319a-OE(319-OE-1)转基因植物中第10个节间的茎横截面。(C-D)WT、miR319a-MIMIC(319-MIM-22)和miR319a-OE(319-OE-1)转基因植物在对照和150 mM NaCl盐处理下的第10个节间的茎横截面的SEM图像。（E-L）形成层细胞层数、木质部细胞层数、导管数、导管内腔面积、导管细胞壁厚度、木纤维数量、纤维腔面积和纤维细胞壁厚度。5.miR319a通过影响次生木质部发育和PagHKT1;2/PagSKOR1-b基因表达提高杨树的耐盐性为了进一步探讨miR319a对盐胁迫的响应与miR319a对次生木质部导管和纤维细胞发育的调节之间的关系，作者培育了7个PdXCP1p-35Smini-miR319a（V-miR319a）转基因系和9个PdDUF579–9p-35Smini-miR319a（F-miR319a）转基因系，分别选择表达水平最高的两个（V-319-13和V-319-18）和（F-319-9和F-31915）用于下一步研究。与WT相比，V-miR319a转基因植物表现出导管数量和导管面积的增加以及导管细胞壁厚度减少（图5B和E）。而F-miR319a转基因植物表现出更大程度的变化，包括纤维细胞数量增加26.5%和纤维管腔面积增加47.3%（图5A、C），纤维细胞壁厚度减少了21.5%（图5B、E）。作者还发现与WT相比，V-miR319a转基因植物的纤维细胞壁和F-miR319a转基因植物的导管细胞壁更厚（图5E）。盐处理后，WT植物的叶片表现出明显的萎蔫和失绿现象，而F-miR319a转基因植物的叶片仅表现出明显的失绿现象，而V-miR319a转基因植物的叶片没有表现出明显的萎蔫和失绿表型（图5F）与WT中31.0%的生物量产量相比，V-miR319a和F-miR319a转基因植物的生物量分别增加了18.3%和9.2%（图5G）。与WT相比，V-miR319a转基因植物中Na+/K+比率降低了50.7%，F-miR319a转基因植物中Na+/K+比率降低了35.1%（图5H）。作者进一步检测了V-miR319a和F-miR319a转基因植物分化木质部中PagHKT1;2和SKOR1-b的表达水平。RT-qPCR分析显示，与WT相比，V-miR319a转基因植株中PagHKT1;2和PagSKOR1-b均上调，而F-miR319a转基因植株中它们的表达水平没有显著变化（图5I、J）。以上表明miR319a可以通过增加导管数量和管腔面积来提高杨树的耐盐性，并且是与PagHKT1;2和PagSKOR1-b基因的表达水平相关。![]()
图5.野生型(WT)V-miR319a和F-miR319a转基因杨的次生木质部和耐盐性的表型分析。(A)WT、V-miR319a和F-miR319a转基因植物第10个节间的茎横切面。(B)扫描电子显微镜(SEM)图像。(C-E）导管和纤维细胞数、每根导管和纤维的平均管腔面积、第10个节间的导管和纤维细胞的壁厚。(F)在对照和150 mM NaCl盐处理下，WT、V-miR319a和F-miR319a转基因植物的顶叶表型。(G–H)WT、V-miR319a和F-miR319a中生物量和芽Na+/K+比率。(I–J)RT-qPCR分析。总而言之，miR319a可以增加杨树的导管数量和管腔面积、减少细胞壁厚度同时，通过上调PagHKT1;2和PagSKOR1-b表达水平来调节木质部中Na+和K+的浓度来提高杨树的耐盐性。miR319可能通过这两种机制协调杨树对盐胁迫的响应，这在木本植物对盐胁迫的响应中发挥重要作用，丰富了我们对次生木质部结构和长距离离子运输平衡在杨树耐盐性中协同作用的理解。
期刊：Horticulture Research
投稿日期：2024.03.19
接收日期：2024.05.30
发表日期：2024.06.07
评述/编辑：吴凤霞
校对：吴姿锐
原文链接：https://doi.org/10.1093/hr/uhae157
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