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=== 研究背景 ===
在植株生长发育过程中，花朵的脱落是一个重要的生理现象，尤其是在弱光照条件下,光照不足会直接影响植株的生长和繁殖，导致花朵的提前脱落。作者在之前的研究中发现番茄 (Solanum lycopersicum) 花序脱落缺陷基因(INFLORESCENCE DEFICIENT IN abessision-like, SlIDL6) 与弱光诱导落花有关。然而，SlIDL6作为信号调控弱光诱导花脱落的分子机制尚不清楚。本研究旨在探究SlIDL6/SlCPK10信号模块参与调控弱光诱导花脱落的分子机制，为生产上减少花朵脱落提高产量提供新思路。
# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1.弱光诱导番茄落花需要SlIDL6触发胞质Ca2+信号Aequorin是一种来自水母的发光蛋白，通常用作生物钙指示剂。研究发现，拟南芥中的细胞质Ca2+由IDA调控。为探究SlIDL6是否也调控细胞质Ca2+，研究者构建了表达aequorin的转基因番茄植株，并用5μM的SlIDL6合成肽处理。结果显示，SlIDL6肽的应用迅速增加了脱落区的[Ca2+]cyt。Ca2+通道抑制剂 (LaCl3或Ver) 能有效阻止SlIDL6肽诱导的[Ca2+]cyt增加，并显著抑制弱光条件下的花朵脱落。SlIDL6过表达株系的花朵脱落率高于野生型，且在LaCl3或Ver处理下显著降低。这些结果表明，SlIDL6诱导的细胞质Ca2+增加在弱光条件下对番茄花朵脱落具有重要作用 (图1)。![]()
图1. SlIDL6诱导的细胞质Ca2+是弱光诱导落花所必需的。(A) SlIDL6诱导的AZ (离层带) 细胞质Ca2+升高。(B) 在弱光条件下落花 (用20mM LaCl3或Ver处理WT、slidl6和35S:: SlIDL6突变体)。(C-D) Ca2+通道抑制剂对SlIDL6肽处理WT植株花梗脱落的影响。2.SlCPK10参与SlIDL6介导的弱光下落花CPK蛋白在植株中可以识别和传递Ca2+信号。为了研究CPK蛋白是否参与SlIDL6调控的落花，CPK抑制剂staurosporine (stau) 在SlIDL6肽处理后对花梗进行处理。SlIDL6在32h时花梗脱落率达到100%，而stau抑制CPK后会使脱落率降低 (图2A)。同样，stau处理也显著降低了35S::SlIDL6转基因植株32h时的花梗脱落率 (图2B)。与此一致的是，stau处理也显著延迟了弱光下35S SlIDL6的花落 (图2C)。这些结果表明CPK在SlIDL6介导的落花中可能起作用。通过分析WT、slidl6和35S::SlIDL6转基因植株的29个SlCPK基因 (SlCPK1-29) 在AZ (离层带) 的表达，发现SlCPK1、-2、-3、-6、-8、-10、-11、-12、-13、-14、-16、-17、-18、-19、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28和-29均在AZ中表达，其中SlCPK6、-10和-17在35S::SlIDL6转基因植株中上调，而在slidl6植株中下调 (图2D)。花梗脱落实验表明，只有slcpk10株系在32小时内脱落率延迟 (图2E)。![]()
图2. SlCPK10敲除在弱光下延迟花朵脱落。(A) 不同浓度的stau对经过SlIDL6预处理的花梗脱落的影响。(B) 35S::SlIDL6植株在对照和5µM stau处理下的花梗脱落率。(C) 在弱光条件下，WT和35S::SlIDL6植株经stau处理后的花朵脱落率。(D) WT、slidl6和35S::SlIDL6在AZ中SlCPK基因的转录水平。(E) WT和CR-slcpk10株系(CR-slcpk10#7、CR-slcpk10#9和CR-slcpk10#13)的花梗脱落实验。3. SlCPK10的过表达在弱光条件下促进花朵脱落由于SlIDL6在AZ中高表达，作者分析了SlCPK10在AZ、远端和近端的表达模式。qPCR分析显示，SlCPK10在AZ中的表达明显高于近端和远端 (图3A)。原位杂交分析进一步揭示，SlCPK10阳性探针信号在AZ细胞中积累，并在弱光下增强，而在近端和远端的信号较弱 (图3B)。此外，弱光诱导的SlCPK10在AZ的表达在slidl6植株中被抑制 (图3C)，这表明SlCPK10的表达在弱光下受到SlIDL6的调控。
图3. 过表达SlCPK10促进弱光下的花朵脱落。(A) 在花梗的远端、近端和AZ中，SlCPK10的转录水平。(B) 在正常光(对照)和弱光下，AZ中SlCPK10的原位杂交。(C) 在弱光条件下，通过实时qPCR测定WT和slidl6的AZ中SlCPK10的转录水平。(D) 35S::SlCPK10的花梗脱落实验。4.SlCPK10在落花过程中起作用于SlIDL6的下游作者研究了SlCPK10与SlIDL6在花梗脱落中的遗传相互作用。与WT中SlIDL6肽处理显著加速花梗脱落不同，slcpk10中的SlIDL6肽对花梗脱落影响较小，在32h仅达到68.5±4.1% (图4A)，与slcpk10突变体相似 (图4B)。这表明SlCPK10在花梗脱落中作用于SlIDL6的下游。然而，SlCPK10的过表达不足以拯救slidl6中的花梗脱落缺陷 (图4C)。作者假设SlCPK10的功能可能依赖于SlIDL6诱导的细胞内钙离子浓度([Ca2+]cyt)刺激。为验证这一点，对35S::SlCPK10植株进行了Ver处理。结果表明，SlCPK10的过表达加速的花梗脱落在Ver存在下显著受损 (图4D)，这些结果支持了SlCPK10在SlIDL6的下游作用，其脱落依赖于SlIDL6诱导的[Ca2+]cyt的变化。![]()
图4. SlCPK10促进花梗脱落依赖于SlIDL6信号。(A) 5 µM SlIDL6肽处理对WT和slcpk10花梗脱落的影响。(B) WT、slcpk10、35S::SlIDL6和slcpk10/35S::SlIDL6中的花梗脱落情况。(C) WT、slidl6和slidl6/35S::SlCPK10中的花梗脱落情况。(D) 35S::SlCPK10在有无Ver时的花梗脱落情况。5. .SlIDL6通过[Ca2+]cyt诱导SlCPK10磷酸化为研究SlCPK10如何响应SlIDL6诱导的[Ca2+]cyt增加，35S::SlCPK10-GFP转基因植株的花梗在花朵去除诱导的脱落过程中接受了SlIDL6肽处理，并在有无小肠碱性磷酸酶(CIP)处理下进行分析。结果显示，SlIDL6肽处理后，35S::SlCPK10-GFP转基因花梗中出现明显的磷酸化带，表明SlIDL6可以诱导SlCPK10的翻译后修饰。经过CIP或Ver处理后，该磷酸化带消失，确认SlCPK10是通过SlIDL6诱导的Ca2+信号进行磷酸化(图5A)。进一步分析发现，在弱光条件下，35S::SlCPK10-GFP转基因花梗中也出现了磷酸化带，且在CIP或Ver处理后该带消失，表明弱光诱导的SlCPK10磷酸化依赖于Ca2+信号(图5D)。此外，在弱光下，slidl6/35S::SlCPK10-GFP转基因花梗中未检测到SlCPK10的磷酸化(图5E)。这些结果表明，SlCPK10在弱光胁迫下通过SlIDL6诱导的[Ca2+]cyt发生磷酸化。图5. SlIDL6诱导SlCPK10的磷酸化。(A) 在35S::SlCPK10-GFP和slidl6/35S::SlCPK10-GFP花梗中检测SlCPK10磷酸化。(B) 35S::SlCPK10-GFP和slidl6/35S::SlCPK10-GFP花梗的磷酸化。(C) 在弱光和正常光条件下检测35S::SlCPK10-GFP花梗的磷酸化。(D) 在弱光条件下检测35S::SlCPK10-GFP花梗的磷酸化。(E) 在弱光条件下检测slidl6/35S::SlCPK10-GFP的磷酸化。6.SlCPK10的Ser-371磷酸化是SlIDL6诱导的弱光下落花所必需的为了识别SlIDL6诱导的SlCPK10磷酸化位点，从SlIDL6处理的35S::SlCPK10-GFP转基因花梗提取的蛋白质经过抗GFP抗体结合的琼脂糖珠分离，并通过液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 检测，确认在EF-hands的371位点 (Ser-371) 和489位点 (Thr-489) 为潜在磷酸化位点 (图6A)。通过转化slcpk10植株，构建了GFP标记的slcpk10/pSlCPK10-GFP, Ser-371磷酸失活型(slcpk10/pSlCPK10-S371A-GFP)和Thr-489磷酸失活型(slcpk10/pSlCPK10-T489A-GFP)。结果显示，pSlCPK10-S371A未能恢复slcpk10的脱落缺陷，而pSlCPK10和pSlCPK10-T489A则能加速脱落 (图6B、6C)。此外，Ser-371磷酸模拟持续激活型植株 (slcpk10/pSlCPK10-S371D) 成功恢复了slcpk10的脱落缺陷 (图6B)。在slidl6植株中，pSlCPK10和pSlCPK10-S371A未能恢复脱落缺陷，而pSlCPK10-S371D则成功恢复，表明Ser-371的磷酸化对SlIDL6诱导的花朵脱落是必需的 (图6D)。为进一步确认Ser-371是否为SlCDPK10的自磷酸化位点，针对Ser-371磷酸化的SlCPK10生成了单克隆抗体 (anti-CPK10S371)，并通过western blot验证了该抗体的特异性 (图6E、6F)。在弱光条件下，slcpk10/pSlCPK10-GFP转基因花梗中检测到明显的磷酸化带，而在slidl6/slcpk10/pSlCPK10-GFP中未检测到(图6G)。同时，在35S::SlIDL6/slcpk10/pSlCPK10-GFP转基因花梗中，无论是否弱光处理均检测到磷酸化带，而在35S::SlIDL6/slcpk10/pSlCPK10-S371A中则未检测到 (图6H)。这些结果进一步确认了Ser-371磷酸化的SlCPK10依赖于弱光诱导的SlIDL6。图6. Ser-371磷酸化对SlCPK10在SlIDL6信号诱导的花梗脱落中是必需的。(A) 质谱分析显示Ser-371和Thr-489为SlIDL6诱导的磷酸化位点。(B, D) 花梗脱落情况。(C) SlIDL6肽处理花梗脱落的影响。(E) Phos-tag SDS-PAGE分析SlCPK10和SlCPK10-S371A的蛋白迁移变化。(F) 在SlIDL6处理后，使用anti-CPK10S371抗体对slcpk10/pSlCPK10和slcpk10/pSlCPK10-S371A的磷酸化进行western blot分析。(G-H) 在弱光条件下，使用anti-CPK10S371抗体对slcpk10/pSlCPK10、35S::SlIDL6/slcpk10/pSlCPK10和slidl6/slcpk10/pSlCPK10进行western blot分析。7.SlIDL6诱导的Ser-371磷酸化增强了SlCPK10的稳定性作者研究了Ser-371的磷酸化是否影响SlCPK10的亚细胞定位或丰度。通过在正常光和弱光条件下分析slcpk10/pSlCPK10-GFP植株的SlCPK10蛋白稳定性，结果显示在弱光下，slcpk10/pSlCPK10-GFP植株的SlCPK10蛋白水平增强，slidl6/slcpk10/pSlCPK10的SlCPK10积累低于slcpk10/pSlCPK10-GFP，且slcpk10/pSlCPK10-S371A-GFP植株未显示SlCPK10积累 (图7G)。这些结果表明，SlIDL6诱导的Ser-371磷酸化稳定了SlCPK10蛋白，促进了弱光下的花朵脱落。
为了确定Ser-371的磷酸化是否改变SlCPK10的稳定性，作者进行了细胞外降解分析，结果显示来自35S::SlIDL6转基因花梗的SlCPK10-GST蛋白比来自WT的更稳定，而来自slidl6花梗的SlCPK10-GST蛋白降解更快 (图7A-C和F)。使用蛋白酶体抑制剂MG132显著抑制了SlCPK10蛋白的降解，支持SlCPK10是一种不稳定蛋白，可能通过26S蛋白酶体降解途径降解，而SlIDL6肽则有助于维持其稳定性。为进一步验证Ser-371磷酸化是否影响SlCPK10的稳定性，生成了SlCPK10-S371A-GST融合蛋白，并与35S::SlIDL6转基因花梗的蛋白提取物孵育，结果显示SlCPK10-S371A-GST蛋白降解速度快于SlCPK10-GST，而SlCPK10-S371D-GST蛋白则比SlCPK10-GST更稳定 (图7D-F)，表明Ser-371的磷酸化对SlCPK10蛋白的稳定性至关重要。
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图7. SlIDL6增强了SlCPK10的蛋白稳定性。(A-C) 细胞外降解实验显示重组SlCPK10-GST与来自WT (A)、35S::SlIDL6 (B)和slidl6 (C)的蛋白提取物共同孵育的结果。(D-E) 细胞外降解实验显示重组SlCPK10-S371A-GST和SlCPK10-S371D-GST与35S::SlIDL6的蛋白提取物共同孵育的结果。(F) A到E中SlCPK10-GST或SlCPK10-S371A-GST水平的定量结果。(G) 在正常光和弱光条件下，slcpk10/pSlCPK10-GFP、slidl6/slcpk10/pSlCPK10-GFP及slcpk10/pSlCPK10-S371A-GFP中的SlCPK10蛋白积累情况。
=== 总结 ===
结果表明，SlIDL6/SlCPK10信号模块在弱光胁迫诱导的落花中发挥了关键作用。SlIDL6触发的[Ca2+]细胞内信号通过SlCPK10传递，从而促进弱光胁迫下的花落，揭示了肽信号调节落花的机制。在正常条件下，SlCPK10的表达水平较低，且其蛋白易于降解。而在弱光胁迫下，SlIDL6通过刺激[Ca2+]细胞内信号激活SlCPK10，二者共同诱导SlCPK10的表达并通过磷酸化增强其蛋白稳定性，最终导致番茄花落的进一步发生。图8. SlCPK10介导的SlIDL6信号在弱光条件下调节花落的工作模型。在正常光照下，AZ细胞中的SlCPK10蛋白不稳定 (左侧)。弱光诱导高水平的SlIDL6，进而触发AZ细胞内游离Ca2+浓度的增加。SlCPK10在Ser-371位点以Ca2+依赖的方式被磷酸化，这增强了SlCPK10的蛋白稳定性，导致花落 (右侧)。
------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
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