摘要
次生木质部和韧皮部起源于一个被称为维管形成层的侧分生组织，它由一到几层分生组织细胞组成。近期谱系追踪研究表明，在每层径向细胞中，只有一个形成层细胞作为干细胞，能够同时产生次生木质部和韧皮部。在这篇文章中，首先论述了植物激素和信号肽如何调节维管形成层的形成和活性。然后，提出了干细胞概念如何可以应用于形成层的研究。最后，讨论了这个概念如何为未来的研究奠定基础。关键词：韧皮部；径向生长；次生生长；干细胞；维管形成层；木质部
Ⅰ 前言
植物的生长起源于茎顶端分生组织（SAM）和根顶端分生组织（RAM），这种生长称为初生生长或者纵向生长。而次生生长或称侧向生长发生在被称为维管形成层和木栓形成层的侧生分生组织。本文综述的重点是维管形成层，它为这两个位于维管形成层相对两侧的次生木质部和次生韧皮部提供了新的细胞（表1；图1）。干细胞的概念（表1）在维管形成层的研究中还没有得到很好的建立，因此形成层和干细胞这两个词在文献中经常被互换使用。维管形成层或形成层区是指次生组织中解剖学上公认的的分生组织细胞，在维管形成层的每个径向区域中，不同物种中这些细胞的数量也不同，从1个到几十个不等。拟南芥和杨树的谱系追踪研究（表1）表明，在每个径向细胞区中都有一个单一的多能干细胞，同时产生次生木质部和韧皮部（图2a，b）。在这篇综述论文中，作者试图详细阐述维管形成层中的干细胞概念。首先，讨论了植物激素和信号肽转导及其下游因子如何调控维管形成层的发育。然后，提出三种干细胞。干细胞、组织细胞和过渡扩增细胞（表1）在维管形成层中被发现，并将关键调控因子与这一概念联系起来。最后，讨论我们设想的干细胞概念如何指导未来的维管形成层的研究。值得注意的是，次生生长也包括木栓形成层，在一定意义上，也可以创造出包含上述这些细胞类型。然而，关于木栓形成层环境中的干细胞概念却知之甚少。因此，在这篇综述中，将重点关注维管形成层，并进一步将维管形成层称为形成层。![]()
图1 拟南芥形成层发育有关的突变体/处理的次生组织
14 d龄幼苗成熟根（下胚轴下0.5 cm）的横截面。黑色和白色的图形是共焦图像，黑色图像是使用SR2200所展示的可视化的植物细胞壁。红色方框是共焦图像的图示，每种颜色代表单元格类型（见图例）。pxy突变体是一个干细胞维持受到干扰的形成层突变体的例证。ga1突变体的韧皮部增加，而赤霉素（GA4,7）处理的幼苗（+GA）的木质部增加。
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图2 拟南芥中维管形成层动力学的图形概述
（a）单能干细胞和多能干细胞的区别。单能干细胞仅在分裂平面的一侧提供新细胞。这些新细胞的身份取决于干细胞的分生组织和位置。双面在分裂平面的两侧提供新的单元。（b）形成层中不同细胞类型的谱系追踪结果。上图中的蓝色细胞代表不同细胞类型中的原始克隆激活事件。下方面板中的蓝色单元格表示从该单元格派生的谱系类型。（c）干细胞分裂后组织细胞定位的动力学，定义了干细胞在维管形成层中的位置。图例表示细胞类型。
表1 术语表
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表1 术语表
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Ⅱ 形成层发育中的分子调控网络
1. 植物激素
在过去的三十年里，分子遗传学者研究次生生长的典型方法是对形成层、次生木质部和韧皮部（以下简称木质部和韧皮部）的大小或细胞数量的分析。这些区域内的相对或绝对变化被认为是与给定突变体或转基因株系的次生生长相关的差异生长的指示。为了阐明维管发育的分子调控因子，主要对拟南芥和杨树维管组织进行了转录组学和代谢分析。代谢分析表明，几种植物激素优先富集于不同的维管组织类型中。具体来说，在杨树茎中，细胞分裂素、生长素和赤霉素（GA）水平分别富集于韧皮部前体、形成层和木质部前体中。利用遗传方法，这些植物激素已被证明对拟南芥和杨树的次生生长很重要。首先，细胞分裂素是次生生长的关键植物激素。这对于拟南芥根中形成层分裂的开始至关重要，当缺乏细胞分裂素会导致无法激活形成层，而应用细胞分裂素则导致形成层的过早激活。在次生生长开始后，细胞分裂素水平升高导致拟南芥和杨树的次生生长增强，而细胞分裂素水平降低导致杨树形成层生长受损，证明了细胞分裂素在调节形成层活性中的重要性。在木质部细胞中，TARGET OF MONOPTER-OS5/LONESOME HIGHWAY（TMO5/LHW）通过LONELY GUY3/4（LOG3/4）控制的细胞分裂素产生对细胞增殖和正确的前形成层模式至关重要。TMO5/LHW及其同源物对正常的形成层发育也很重要，然而，TMO5/LHW是否通过细胞分裂素的生物合成调控形成层的发育仍有待研究。在初生根分生组织中，细胞分裂素诱导PHLOEM EARLY DOF（PEAR）转录因子的表达，促进原形成层增殖和形成正确模式。HIGH CAMBIAL ACTIVITY2（HCA2）是PEAR家族成员之一，已被证明能促进拟南芥茎束间形成层形成过程中的细胞增殖。然而，目前尚不清楚HCA2和其他PEARs是否也在次生组织中受到细胞分裂素的调控。AT-HOOK MOTIF CONTAINING NUCLEAR LOCALIZED 15（AHL15）已被证明通过增加细胞分裂素的生物合成来促进次生生长。最近，一组LATERAL BOUNDARY DOMAIN（LBD）转录因子被发现作用于细胞分裂素的下游，激活次生生长。除了激活形成层外，进一步的次生生长也需要LBD3和LBD4，因为lbd3lbd4双突变体在次生生长后期显示细胞分裂数量减少。此外，高阶lbd突变体（lbd3lbd4lbd11和lbd1lbd3lbd4lbd11）在放射状细胞的亚群中显示了分化干细胞。总之，这些发现表明，LBD基因参与了细胞分裂素下游的干细胞维持。有趣的是，细胞分裂素信号通路在LBD3或LBD11过表达系中下调，而在lbd突变体中上调，表明细胞分裂素和LBDs之间存在负反馈调控。这些LBDs的同源物在杨树次生生长和韧皮部发育中也有作用。最近，研究发现LBD11与活性氧（ROS）形成一个反馈调节回路，以调节形成层细胞的增殖（图3）。LBD11促进ROS代谢基因的表达，导致维管形成层中ROS最大值的形成，促进形成层细胞的增殖。相反，ROS的过量产生抑制了LBD11的转录，从而维持了维管形成层细胞的增殖。LBD11参与了细胞分裂素和ROS依赖的促进形成层细胞增殖的过程，表明在径向生长过程中，细胞分裂素和ROS信号通路之间存在串扰。除了细胞分裂素，生长素在形成层中达到峰值，且已被证明对形成层生长至关重要。拟南芥和杨树中编码几种Class-A AUXIN RESPONSE FACTORS（ARFs）的基因功能缺失突变体显示出形成层活性降低。唯一的例外是ARF5/MP的功能缺失突变，它导致拟南芥茎的形成层活性增加。当过表达抑制生长素信号传导的显性AUX/IAAs的抗降解变体时，观察到形成层活性降低。这表明了生长素信号传导对维持次生生长的重要性。此外，生长素响应因子ARF6和ARF8似乎具有更具体的作用，因为它们促进木质部在韧皮部的形成。这说明生长素信号传递家族的不同组成部分对形成层生长有不同的影响，说明了生长素信号传递在次生生长中的复杂性。在蔷薇中，通过RhYUC10的局部生长素生物合成已被证明对乙烯诱导的促进维管束生长大小具有重要作用。影响生长素下游的因素之一是HD-ZIP III基因—AtHB8。拟南芥中所有5个HD-ZIP III基因的功能缺失导致了木质部分化的抑制，使它们能够像形成层细胞一样分裂，但没有形成层细胞的特性。此外，在杨树中，HD-ZIP III基因—PtrHB4的减少导致杨树不能完全形成束间形成层，而过表达HD-ZIP III基因则导致形成层和木质部的异位形成。这表明HD-ZIP III基因虽然对分裂有一定的抑制作用，但对形成层的形成具有重要作用。有趣的是，在杨树和拟南芥的HD-ZIP III突变体中，生长素相关基因被下调，说明HD-ZIP III基因与生长素之间存在正反馈。第三，赤霉素（GA）在拟南芥和杨树中促进木质部的形成，并抑制拟南芥根韧皮部薄壁组织细胞的形成。赤霉素通过降解赤霉素信号抑制因子GAI和RGA来调控木质部的形成。除了促进木质部的形成外，赤霉素的升高与拟南芥茎木质部纤维的形成有关，这是开花过程中茎强化过程的一部分。相比之下，在GA生物合成突变体中，ga requiring1（ga1），木质部导管和木质部薄壁细胞数量减少，而韧皮部细胞总数增加。有趣的是，韧皮传导细胞相较于韧皮薄壁组织的占比，在赤霉素处理下会增加，在ga1突变体中减少。因此，赤霉素对韧皮部形成有积极影响，而对韧皮薄壁组织形成有消极影响。这说明，在木质部和韧皮部，形成层中形成韧皮部或木质部的决定和传导元件的分化是相互独立的。赤霉素促进木质部导管形成依赖于PIN-FORMED1（PIN1）介导的生长素运输和ARF介导的生长素信号转导。在pin1和 arf7 arf19 突变体中，赤霉素促进的木质部导管形成被抑制，这表明PIN1介导的生长素极性转运和ARF介导的生长素信号转导是是赤霉素促进的木质部发育所必需的。除了这三种植物激素，乙烯、茉莉酸和独脚金内酯已被证明调节次生生长，表明一个高度连接的激素信号网络调节形成层生长。除植物激素外，分泌肽介导的信号传导在形成层生长中起着至关重要的作用。CLAVATA3/EMBRYOSURROUNDING REGION（CLE）肽家族是植物中最大的信号肽家族之一。活性形式的CLE多肽是由CLE前体蛋白加工而成的12或13个氨基酸。拟南芥CLE家族的创始成员CLAVATA3（CLV3）是从clv3突变体的分离中鉴定出来的，该突变体表现出SAM增大，伴有过度增殖未分化的分生组织细胞。导管分化抑制因子（TDIF）是CLE家族的另一个成员，一种在Zinnia elegans L.叶肉细胞培养系统中抑制导管分子分化的十二肽TDIF由拟南芥CLE41和CLE44基因编码，这些基因在韧皮部表达（图3）。TDIF被加工成十二肽后，迁移到形成层，在那里它与其同源受体TDR/PXY结合（图3）。TDR/PXY是富含亮氨酸的重复序列受体类蛋白激酶家族的成员。此外，体细胞胚发生受体激酶（SERK）蛋白作为共受体，与TDIF-PXY形成复合体。通过CLE41/CLE44的过度表达或合成TDIF肽段处理产生的过量TDIF促进了木质部中异位的形成层细胞分裂，从而导致了维管模式被打乱。根据上文，pxy/tdr和cle41cle42cle43cle44功能丧失突变体显示出原形成层细胞数量减少，并且形成层组织紊乱，其中木质部和韧皮部被分散。此外，当相关的类受体激酶（LRKs）PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM-LIKE 1（PXL1）和PXL2与PXY/TDR一起突变时，观察到维管形成层的紊乱增强，这表明PXY、PXL1和PXL2在维管组织组织中具有功能上的过度表达。总而言之，这些数据表明，TDIF-PXY信号在维管形成层发育中具有三种不同的功能：促进维管形成层细胞增殖，抑制木质部分化，以及组织和维持正确的形成层模式。有趣的是，CLE6和CLE41的共同处理增强了单独CLE41处理的维管细胞增殖，表明CLE6和CLE41在维管细胞增殖中协同作用。然而，其机制尚不清楚。除PXY外，富含亮氨酸重复受体样蛋白激酶家族的另一个成员ERECTA（ER）及其旁系同源物ER-LIKE1（ERL1）和ERL2也参与次级生长的调节。ER和ERL1过度促进拟南芥茎的次生生长，而在拟南芥下胚轴中它们限制次生生长。有趣的是，er erl1 erl2 三重突变体在拟南芥下胚轴中表现出次生生长减少。目前尚不清楚er erl1双突变体和er erl1 erl2三突变体在拟南芥下胚轴的次生生长过程中如何表现出相反的表型。进一步的遗传相互作用分析显示，er增强了pxy突变体的形成层组织缺陷，这表明ER和PXY在平行的信号通路中发挥了作用。除了在径向生长中的作用外，ER和ERL1还有在拟南芥的茎和下胚轴中对木质部细胞增殖有负向调节作用此外，ER和ERL1与SOBIR1/EVR共同作用，有效防止拟南芥下胚轴次生生长第二阶段木质纤维过早分化。包括EPF和EPFLs在内的一些ER的配体已被鉴定出在许多发育过程中发挥作用。其中，EPFL4和EPFL6被提出在花序茎的形成层发育过程中作为ER的配体。这主要是因为EPFL4和EPFL6在花序茎中表达，而epfl4 epfl6突变增强了pxy突变体的维管紊乱，类似于er pxy双突变体。然而，epfl4 epfl6没有表现出任何形成层表型，这表明在调节形成层发育的过程中，肯定还存在其他具有功能过度表达的ER/ERLs配体。在TDIF-PXY信号通路的下游，WOX/WUS转录因子家族的两个成员，WOX4和WOX14，已被证明在形成层增殖中起冗余作用（图3）。在35S:CLE41转基因系中WOX4和WOX14被上调，而在pxy突变体中被下调。WOX4的过度表达导致更多的形成层细胞增殖，而wox4突变体则显示出细胞增殖减少。然而，与pxy/tdr和tdif突变体不同的是，wox4单突变体和wox4双突变体的形成层模式都是正常的，这表明在TDIF-PXY信号通路下游还有其他因素作用于调节维管组织的组织。有趣的是，研究发现编码GRAS结构域转录调控因子的毛状分生组织（HAM）与WUS/WOX相互作用。进化保守的TDIF-PXY-WOX4信号促进杨树形成层细胞分裂。鉴于pxy wox4双突变体比pxy4单一突变体表现出更强的细胞增殖缺陷，wox4和pxy除了位于TDIF-PXY下游外，还可能在平行信号通路发挥作用。事实上，WOX4在调节形成层活性的同时被生长素以不依赖于PXY的方式诱导。此外，WOX4对于乙烯促进的形成层细胞增殖是必需的。由于乙烯不敏感突变增强了pxy突变体的形成层细胞分裂缺陷，乙烯信号可能与TDIF-PXY信号并行调节形成层细胞分裂。综合这些数据，WOX4可能在调节形成层细胞增殖中汇聚乙烯和TDIF-PXY信号。然而，乙烯过量产生突变体中WOX4的转录并没有改变。一种可能性是乙烯可能以转录后的方式调控WOX4。最近的一项研究表明，在杨树中，泛素化的泛素受体的PagDA1通过26S蛋白酶体和E3泛素连接酶PagDA2负向调节PagWOX4的蛋白质稳定性。有趣的是，最近的一项研究表明，在毛果杨（Populus trichocarpa）中，PtrWOX4受到表观遗传控制。PtrVCS2通过包含组蛋白乙酰转移酶的蛋白复合体调节PtrWOX4启动子上的组蛋白乙酰化水平。在TDIF-PXY-WOX4/14调控的形成层细胞增殖的同时，糖原合成酶激酶3蛋白（GSK3s）被鉴定为TDIF-PXY信号下游的重要组分，它们通过抑制叶脉部分原形成层细胞的木质部分化来发挥作用（图3）。此外，通过抑制BRI1-EMS-SUPPRESSOR1（BES1）的活性，GSK3s抑制了油菜素内酯信号中的关键转录因子，抑制了木质部的分化（图3）。与BES1相比，其同源蛋白BES1/BZR1同源蛋白3（BEH3）充当形成层稳定因子，因为敲除beh3突变体显示出形成层大小的大幅度变化。除了抑制木质部分化，GSK3s对于拟南芥下胚轴的形成层维持也是必需的。通过bikinin（一种GSK3s激酶活性的抑制剂）处理或降低GSK3s的表达，会导致形成层组织紊乱，木质部和韧皮部嵌入，这与pxy突变体的表型相似。在wox4突变体中，bikinin诱导的木质部与韧皮部交织的表型频率增加，表明GSK3s与WOX4共同作用于形成层维持的调控。BIN2-LIKE 1（BIL1）是GSK3s家族成员之一，它与PXY有物理上的相互作用。然而，BIL1在叶脉中不表达，因此它对于TDIF-PXY抑制的叶中木质部分化不是必需的。相反，BIL1通过促进赤霉素信号的负调节因子ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR 7（ARR7）和ARR15的表达，抑制PXY信号下游的形成层活性。值得注意的是，拟南芥花序茎中CLE41过表达诱导了LBD4。lbd3lbd4lbd11三突变体在拟南芥根部表现出明显的形成层缺陷，偶尔导致形成层细胞在次生生长开始时缺失。这与pxy突变体的表型相似。lbd3lbd4lbd11pxy与单独的pxy或lbd3lbd4lbd11突变体相比，表现出累加效应，这表明PXY和LBDs在形成层干细胞维持中具有冗余作用。LBDs很可能在多个途径中起作用，因为它们的表达受到赤霉素（如前一节所述）和TDIF-PXY信号的共同调节。图3 拟南芥根/下胚轴维管形成层动态的植物激素和肽调节网络
三角形表示生长素信号传导和PXY的梯度表达。该多边形显示由于PXY蛋白的隔离，形成层干细胞中TDIF肽梯度急剧下降。实线表示转录调节、物理相互作用或蛋白水解加工。虚线说明了TDIF肽的运动。灰色文本表示抑制状态。这个信号网络的未知部分是用“？”。
Ⅲ 改变形成层中干细胞的种类
形成层不是同质组织，因为它的细胞需要不断决定是否分裂或分化为木质部或韧皮部。这种动态行为对于响应内在发育调节因子以及适应环境变化的次生生长非常重要；然而，它使得研究和理解形成层的发育变得更加复杂。类似的情况也适用于初级分生组织，但这一难题已通过采用动物中的干细胞概念解决。在顶端分生组织中，细胞分为几种不同的类型，即干细胞、组织细胞和过渡扩增细胞。每种细胞在分生组织中都有自己的作用，并且具有不同的生长和分裂潜能。首先，干细胞是不断自我补充的分裂细胞。当子细胞（表1）之一在分裂时保持其干细胞特性时，干细胞谱系的连续性就发生了；另一个子细胞将逐渐分化成另一种细胞类型。然而，干细胞的这一经典定义并不能完全应用于所有干细胞系统。这是因为尚未在所有分生组织中鉴定出符合经典定义的干细胞的特异性标记。例如，在茎尖分生组织中，干细胞是由CLV3的表达模式定义的（图5a），尽管CLV3表达域比通过谱系追踪实验在SAM尖端的三至四个被定义为干细胞的细胞更宽。这三到四个细胞很可能与其他CLV3阳性细胞没有什么不同，并且其干性具有顶部细胞的动态特征。尽管情况如此，但出于可行性，CLV3仍是定义SAM中干细胞的合适标记。在拟南芥和杨树中基于谱系追踪我们可以得知，形成层干细胞在每个径向细胞列中是单个多能干细胞，可以向内提供木质部细胞或向外提供韧皮部细胞（图2a，b）。相比之下，RAM和SAM干细胞以单一方向产生分化细胞，因此这些细胞可以称为单能干细胞（图3a）。这些单面系统不仅存在于初生分生组织中，在一些已灭绝的进行次生生长的植物的形成层中也可能存在类似的单能干细胞。分生组织内干细胞的状态和特性通常由称为组织细胞或组织中心细胞的特殊细胞控制。这些细胞处于静止状态，分裂频率不高或分裂频率缓慢，细胞进行非自主地活动，并为邻近细胞提供干性。RAM或SAM内组织细胞的去除将会导致干细胞的分化和分生组织内其他部位干细胞的特化。在拟南芥根形成层中，我们提出木质部细胞具有形成层干细胞的特征。首先，根形成层干细胞起源于与初生木质部相邻的细胞，即木质部原形成层细胞和木质部中柱鞘细胞，这表明与木质部细胞相邻的细胞将成为形成层干细胞。其次，通过在韧皮部薄壁细胞中诱导局部高水平的生长素信号传导，可以促使木质部导管异位分化，进而引发了相邻细胞的类似形成层的分裂活动。尽管有充分的证据表明形成层的木质部侧存在组织细胞，但与顶端分生组织相比，确定形成层中的组织细胞并不那么简单。在顶端分生组织中，组织细胞在解剖学上是可识别的，因为它们是静态的（在RAM中）并且寿命长（在RAM和SAM中），或者可以通过它们在分生组织内的位置（在SAM中）进行定位。相比之下，形成层组织细胞更具活力，不断分化为木质部。为了应对这种损失，木质部干细胞子细胞失去分裂能力并成为组织细胞。这种组织细胞的持续丧失也提供了决定哪个干细胞子细胞应保留为干细胞的机制（图2c）。当组织细胞在干细胞分裂时保持其特性时，它将为其相邻的子代干细胞提供干性，从而允许韧皮部侧子代干细胞分化为韧皮部细胞。然而，如果组织细胞分化为木质部并且木质部侧干细胞子细胞成为新的组织细胞，则韧皮部侧子代干细胞将保留为干细胞。因此，每次干细胞分裂后，一个形成层干细胞子代仍保留为干细胞，而另一个在分化前则决定了成为木质部或韧皮部细胞（图2c）。当细胞分化方向确定时，我们提出了两种可能性。首先，干细胞的分化方向确定发生在组织细胞分化为木质部时。或者，当干细胞子细胞的分化方向确定，就会做出决定。总体而言，形成层中组织细胞的（重新）分化为植物提供了一种机制，通过该机制可以维持单个多能干细胞层，同时在相对侧形成两种细胞类型。最后，大多数分生组织内存在另一种类型的分裂细胞，称为过渡扩增细胞。与干细胞相反，它们的命运是最终失去分裂能力并在一系列细胞分裂后分化（图2b）。它们起源于与组织细胞失去直接联系的干细胞子细胞。由于干细胞和其他过渡扩增细胞的连续分裂将它们推离分化的分生组织从而使过渡扩增细胞失去了分裂潜力。因此，这些细胞正在从干细胞转变为分化细胞。虽然谱系追踪实验表明拟南芥根形成层的大部分分裂发生在干细胞中，但偶尔也会观察到一些类似过渡扩增细胞的细胞。虽然这些过渡扩增细胞位于木质部和韧皮部两侧，但尚不清楚这些分裂在何处以及如何发生。特别是，木质部侧的过渡扩增过程可能很复杂。木质部干细胞子细胞在成为组织细胞之前可以分裂。或者，组织细胞在分化为木质部之前进行分裂，类似于RAM中的静止中心（QC）。需要进一步的研究来确定拟南芥形成层中过渡扩增细胞分裂是如何发生的。由于树形成层由每个径向列中的数十个细胞组成，且包含多能干细胞，因此大多数分裂细胞很可能是过渡扩增细胞。然而，有关树形成层中过渡扩增细胞的位置和数量的详细信息尚不清楚。Ⅳ 定义形成层干细胞的挑战
尽管有明确的定义，但精确定义维管形成层内的干细胞仍然具有挑战性。在维管形成层内干细胞位置的灵活性和可变性可能是其适应不同内源性和环境变化能力的关键，但这使得在特定时刻难以确定哪些细胞扮演着干细胞的角色。在大多数径向细胞列中，拟南芥根形成层中似乎只有单个分裂细胞。在横切面中，这些细胞可以通过薄的初生细胞壁来识别，由于切片中软组织的弯曲，初生细胞壁通常呈波浪状（图4）。由于拟南芥分裂中很少产生额外的过渡扩增细胞，因此只要形成层细胞分裂，就可以回顾性地推断出拟南芥根中干细胞的位置（图4）。然而，分裂后由于组织细胞因分化为木质部细胞而不断变化，导致保留干细胞身份的子细胞的位置难以捉摸，所以，与RAM中的静止干细胞相比，它没有简单的参考点（图5a）。如第三节所述，研究人员采用细胞谱系追踪来确定干细胞在植物组织内的位置（图2b）。通过这种方法，可以追踪单个细胞的谱系，当纳入时间时，可以区分干细胞和反式扩增细胞的分裂（图2b）。使用这种方法，确定了干细胞在RAM、SAM和形成层中的位置（图5a）。然而，虽然该方法可用于回顾性确定干细胞位置，但它不能实时确定干细胞位置。在顶端分生组织中，使用共聚焦显微镜对细胞分裂进行实时成像已被用于可视化植物初级分生组织中的干细胞动态，但由于形成层位于次生组织深处，所以这种方法目前无法用于形成层。因此，研究人员一直在寻找形成层干细胞的特异报告基因，类似于SAM中的干细胞报告基因。常用的报告基因是AINTEGUMENTA（ANT）（图4），它在干细胞及其子细胞中表达。重要的是，在表达ANT的细胞中启动的谱系追踪证实ANT忠实地标记了干细胞。然而，由于形成层具有单个双面细胞层，ANT报告基因的更广泛表达表明ANT不仅仅在干细胞中表达。谱系追踪也支持了这一点：源自表达ANT的细胞的几个谱系并未从木质部扩展到韧皮部。因此，期望发现新的、更特异的形成层干细胞报告基因，不过，由于这种侧分生组织的动态性质，干细胞的单细胞范围的明显标记也可能不存在。![]()
图4 干细胞、木质部或韧皮部细胞以及13天龄拟南芥根形成层中具有高浓度生长素细胞的荧光报告基因的图像
（a）拟南芥根形成层中pANT:erRFP;pATHB8:erVENUS双报告基因的表达。pANT:erRFP和pATHB8:erVENUS分别在形成层干细胞和木质部细胞中表达。（b）拟南芥根形成层中pANT:erRFP;pPEAR1:erVENUS双报告基因的表达。pANT:erRFP和pPEAR1:erVENUS分别在形成层干细胞和韧皮部细胞中表达。（c）拟南芥根形成层中生长素响应报告基因DR5v2:erRFP的表达。p，韧皮部；x，木质部；白色箭头指示最近的细胞分裂。标尺，10 μm。
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图5 比较三种植物分生组织中的生长素/CLE/WUS-WOX因子
（a）拟南芥三种分生组织类型（根顶端分生组织、根维管形成层、芽顶端分生组织）的图形概述。上图显示了这些分生组织内的不同细胞类型。中图使用DR5表达模式，显示了这些分生组织中的生长素分布。下图显示了CLE肽、其受体和WUS/WOX转录因子的表达模式。（b）概述（a）中所示分子因素的遗传相互作用。灰色箭头或文本表示特定细胞类型的表达降低或缺失。虚线表示肽扩散到其他细胞。
Ⅴ 重新定位形成层中的分子调节剂
在过去几十年里，植物激素和肽信号在维管形成层发育中的关键作用已经通过遗传方法被揭示，但这些信号如何适配维管形成层的干细胞概念只是在最近几年才开始被研究。
1. AINTEGUMENTA-LIKE/PLETHORAs（AIL/PLTs）是形成层干细胞调节因子
已鉴定出大量调节形成层发育的转录因子，然而，对特定的形成层干细胞调节因子的了解是有限的。最近，一组AINTEGUMENTA-LIKE/PLETHORAs（AIL/PLTs）转录因子被确定为形成层干细胞调节因子。AIL/PLTs属于有两个AP2结构域的转录因子的一个分支，已被定性为RAM和SAM中的干细胞调节因子。在8个AIL/PLT家族成员中，ANT、PLT3、PLT5和PLT7在形成层干细胞及其子细胞中表达（图3）。ANT功能丧失导致次生生长减少。plt3plt5plt7突变背景中ANT（IGE-ANT）诱导基因组编辑导致径向扇区形成层细胞层数量严重减少。此外，PLT5的过度表达导致木质部和韧皮部薄壁细胞的异位细胞分裂，并抑制导管木质部和韧皮部的形成。该证据支持CAMBIUM-EXPRESSED AIL/PLTs（CAILs），ANT，PLT3，PLT5和PLT7是形成层干细胞调节因子，促进细胞分裂并抑制细胞分化。
2.局部高生长素水平确定形成层干细胞组织中心
生长素呈现梯度分布，高水平的生长素为AIL/PLT在多个发育过程中的表达提供位置信息。在拟南芥RAM中，QC组织细胞以高浓度生长素信号水平为标志（图5a）。同样，在非分裂的形成层细胞中，木质部细胞显示出较高的生长素信号水平，而在形成层干细胞中则观察到较低的生长素信号水平（图4c、5a）。这种高生长素信号对于组织细胞功能至关重要。因此，生长素信号至少部分通过HD-ZIP III基因来定义组织种类。HD-ZIP III转录因子决定了初级和次级组织中的木质部组分。HDZIP III基因突变或miR165a诱导（针对HD-ZIP III基因的5个mRNA）会导致木质部分化受到严重抑制。此外，miR165a的诱导导致几个形成层特异性基因WOX4、PXY和ANT的下调，表明HD-ZIP III转录因子是形成层特异性细胞所必需的。通过对具有显性效应的AtHB8基因变体（AtHB8d）进行诱导性过表达，发现其对miR165和miR166具有抗性，会抑制形成层细胞分裂，证实了AtHB8促进组织细胞沉默（图3）。然而，与异位生长素信号传导的克隆激活不同，韧皮部细胞中AtHB8d异位表达的克隆激活既不会导致木质部导管形成，也不会导致形成层特异性报告基因的表达，表明生长素信号下游的其他因素参与了这一过程。虽然高生长素信号水平时促进木质部细胞沉默，但相邻的中等生长素信号水平与干细胞的位置相关（图3、5a）。生长素促进形成层中PXY的表达，因此，PXY显示出类似于生长素信号传导的表达模式。PXY在木质部细胞中表达量最大，并向形成层干细胞逐渐减少。这里，PXY与其韧皮部衍生的配体TDIF结合，从而诱导形成层干细胞调节剂CAILs的表达（图3、5a）。CAILs在TDIF过量生产（CLE41过度表达）或应用时表达量上调。此外，PLT3和PLT5功能的丧失和突变能够抑制TDIF过量生产的表型，表明CAILs是TDIF-PXY介导的形成层干细胞自我维持的下游因子。有趣的是，与PXY不同，CAILs仅在形成层干细胞中表达。建模和实验分析表明，这是由于PXY蛋白对TDIF肽的螯合限制了形成层干细胞中的TDIF信号传导。PXY的敲除或CLE41的过表达导致CAIL表达扩展到了木质部支持了这一观点。然而，TDIF-PXY信号如何调节CAILs的表达仍不清楚。此外，PXY蛋白如何螯合TDIF配体也不清楚。然而，当研究人员需要在植物组织中观察可变形成层的尺寸时，对这种机制的探讨是必不可少的。如果没有螯合机制，在活跃生长期间形成层干细胞将需要更高的TDIF产量。因为形成层细胞数量的增加意味着产生韧皮部的TDIF将远离表达PXY的细胞。相比之下，在存在没有隔离的单个干细胞的情况下，TDIF会扩散到木质部中，导致木质部结构缺陷。PXY和HD-ZIP III的表达被生长素诱导，在干细胞特性上具有相反的功能，这部分解释了为什么生长素信号传导既可以诱导木质部细胞沉默，又对周围干细胞分裂至关重要。初级分生组织中也发现了类似的机制。在RAM中，非分裂QC细胞中的高生长素水平（图5a）是远端邻近低生长素水平细胞的分裂潜能是必需的，RAM中除此之外的分裂潜能是由生长素诱导的PLETHORA转录因子介导的，这些转录因子通过植物细胞生长的扩散以及细胞间的移动，在高生长素浓度区域之外发挥作用。与RAM和形成层不同，SAM中的组织中心具有低水平的生长素（图5a）。低水平生长素对SAM的分裂潜能是必需的，它通过WUSCHEL的表观遗传调控来维持。高水平生长素信号传导的位置以及形成层内的组织特性在生长过程中发生变化。组织细胞的位置已被证明依赖于由PIN1介导的长距离生长素转运体。这与RAM中PIN依赖性生长素运输的丧失导致集中的高生长素信号消散的发现类似。如上所述，GA调节木质部和韧皮部产量的比例。这是由于GA促进PIN1表达，从而增加生长素在子代干细胞中的积累（图3），因此有利于该细胞分化成组织细胞或木质部细胞（图2c）。如果GA浓度较低，子代干细胞中的PIN1和生长素水平也较低，则会有利于子代干细胞分化为韧皮部。这种机制允许形成层持续向外生长，并在需要时重新分化为干细胞和组织细胞。在初级生长期间不需要这种重新分化，因为初级生长的单向性允许干细胞向外生长。这些差异凸显了分生组织之间进行比较研究的必要性。Ⅵ 三种分生组织中CLE肽-WUS家族信号转导的比较
初生分生组织和维管形成层都具有由CLE家族信号肽、富含亮氨酸的受体，以及调控干细胞定位的WUSCHEL家族转录因子组成的信号模块（图5）。CLV3在SAM干细胞中转录。经过切割和修饰后，CLV3肽扩散到组织体中心细胞中，在那里它与受体CLV1结合，CLV1是一种质膜（PM）定位的富含亮氨酸的重复受体样激酶（LRR-LRK）（图5b）。CLV3-CLV1信号通路抑制了在组织中心表达的WUSCHEL（WUS），这是一种同源异型盒转录因子，以限制干细胞的增殖（图5b）。反过来，WUS蛋白移动到SAM干细胞中，并促进CLV3的表达，形成一个负反馈回路来控制干细胞的稳态（图5b）。在根尖分生组织（RAM）中，也发现了类似的CLE肽信号通路。简单来说，分化中的柱细胞分泌的肽类CLE40，与CLV3同源性最高的CLE肽，可被包括拟南芥Crinkly4（ACR4）和CLV1在内的复合物感知。这限制了WUSCHEL HOMEOBOX RELATED 5（WOX5）的表达，从而促进了根柱干细胞的分化（图5b）如上所述，每个分生组织中都存在同源信号组分。它们的信号传导机制在分生组织之间既有相似之处，也有差异（图5）。在这三个分生组织中，CLE肽以非细胞自主的方式产生，影响邻近细胞的类型。在根尖分生组织（RAM）和形成层中，肽是在分化的细胞中产生的，而在顶端分生组织（SAM）中，干细胞产生肽。CLE41促进干细胞分裂，而CLE40和CLV3则抑制干细胞分裂（图5）。在每个分生组织中，WUSCHEL家族的成员都在组织中心表达。WOX5和WOX4的表达是由生长素诱导的，而WUS的表达与生长素信号水平较低相关（图5b）。这些在分生组织调控中的相似性和差异性是进行比较进化研究的有趣起点。这些研究可能提供有关植物三大主要分生组织演化的信息。Ⅶ 未来展望
在这篇综述中，作者首先总结了前几年形成层研究的主要发现。提出了形成层中复杂的细胞分裂和分化如何通过初生分生组织的干细胞概念来呈现。这个概念可以弥合新旧发现之间的差距。然而，综述前半部分描述的大多数因素的确切作用仍有待确定。在许多情况下，人们对于形成层中的因素如何调节另一个因素，以及它们是否促进或抑制次生生长，有很好的生化和遗传学理解。通常缺乏的是对这些因素何时以及在哪些细胞中发挥作用的时空理解。这种时空研究在顶端分生组织中是常规的，因为它们相对容易通过实时成像进行观察。我们相信，通过结合谱系追踪、组织特异性基因操作系统、单细胞转录组分析和高分辨率共聚焦显微镜，在形成层中也可以实现类似实时成像的结果。此外，计算模型可以在形成层中分裂和分化时深入了解细胞的信号传导机制。我们相信，通过上述方法，我们可以获得更多关于维管形成层运作机制的观点，并且通过干细胞概念，我们将能够解释植物发育生物学家的组织特异性发现。当然，我们还处于早期阶段，当我们达到这种理解水平时，我们当前的想法（如本次综述中所述）很可能需要进一步调整。因此，我们希望这次综述是进一步讨论的良好开端。形成层研究的主要问题之一是拟南芥中的发现如何应用到其他物种。例如，树木物种的形成层形态尽管相似，但仍然不同。树木的形成层尺寸比拟南芥大得多，这可能暗示干细胞和组织细胞位置存在差异。此外，作为多年生植物，树木形成层活动随季节变化很大。在北方树木中，形成层宽度可以从初夏的数十个细胞层变化至冬季的几层甚至一层细胞层。在长达几千年如此相反的条件下，形成层如何维持其干细胞，并稳健地增加和减少其细胞产量，是一个悬而未决的问题。此外，许多树种都有射线细胞，负责营养物和水的径向运输。由于拟南芥中不存在射线细胞，因此只能在树木中研究同时产生径向定向射线细胞和轴向定向传导细胞的复杂性。因此，尽管一些基本发现可以从拟南芥对应到树木中，但有几个发育过程只能在树木中进行研究。大多数树木的分子形成层研究都是在木本模式植物杨属中进行的。尽管杨树因其基因组资源和易转化性而成为一种选择，但它并非最好的遗传模型。因此，具有更好遗传特征的其他物种应该应用于形成层研究，以便能够采用分子遗传技术，这对于了解拟南芥形成层发育至关重要。此类遗传模型之一可能是银桦树，它可以在一年内诱导开花，并且在树木本体感受和枝条结构研究中已运用正向遗传方法。总之，树木形成层研究可以受益于先前在拟南芥中建立的方法，例如谱系追踪和组织特异性基因操作，然而，同样重要的是研制木本遗传模型，使分子和遗传学研究变得更加可行。
