1、BRs促进拟南芥幼苗中花青素的积累
作者测定了BR突变体cyp85a1a2和Sdet2中的花青素含量，结果表明cyp85a1a2和Sdet2突变体花青素积累水平低于野生型(图1A)。在14 d龄的拟南芥茎段中，cyp85a1a2和Sdet2的花青素含量也显著低于野生型(图1B)。经过BR生物合成抑制剂丙环唑PCZ处理后，拟南芥花青素含量也随之降低(图1C)。与野生型相比，BR受体油菜素内酯受体蛋白( BRI1 )的两个功能缺失突变体bri1-116和bri1-5的花青素水平降低(图1D-E)。相反，BIN2的功能缺失突变体bin2-3 bil1 bil2比野生型产生了更多的花青素苷。功能获得突变体bzr1-1D恢复了bri1 - 116、bin2-1突变体中降低的花青素水平(图1F)，表明BR响应转录因子BZR1正调控花青素的产生。![]()
图1. BR促进拟南芥幼苗中花青素的产生。(A) 野生型Col-0、Sdet2和cyp85a1a2早期幼苗中花青素的积累。(B)Col-0、Sdet2和cyp85a1a2幼苗芽中花青素水平。(C) PCZ处理后花青素水平的变化。(D-F) Col-0、bri1-116、bri1-116 bzr1-1D 、WS、bri1-5和bin2-3 bil1 bil2，以及Col-0、bin2-1杂合子(+/−)、bin2-1纯合子(−/−)和bin2-1 bzr1-1D的花青素水平。
作者通过施加不同浓度的BL(一种活跃的BR物质)，发现BL促进了Col – 0、bzr1-1D中花青素的积累(图2A-B)。对BL处理的Col - 0和bzr1 - 1D中花青素生物合成相关基因的表达分析发现，BL显著促进了花青素生物合成基因以及花青素正调控转录因子的表达，bzr1-1D突变体进一步增强了BL诱导的基因表达(图2C-D)。测定花青素含量发现，bzr–q(四突变体bzr-q ;bzr1 bes1 beh2 beh3)与Col-0相比，花青素含量显著降低(图2E-F)，对BL或Bikinin(拟南芥类糖原合成酶激酶3类激酶的抑制剂)几乎没有响应，并且BR诱导的花青素生物合成基因的表达在bzr-q突变体中受损(图2G-H)。![]()
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图2. BZR1介导BR调控的花青素生物合成。(A) Col-0和bzr1-1D幼苗的表型。(B) A在含0,、5、50 nM BL培养基中幼苗花青素含量。(C-D)对Col-0和bzr1-1D幼苗芽中花青素生物合成基因C和组成MBW复合体的转录因子D的表达水平分析。(E)Col-0和bzr-q突变体的表型。(F) E在含0、5、50 nM BL的培养基中幼苗芽的花青素含量。(G)E在含0、5、10μM bikinin的培养基中幼苗芽中的花青素含量。(H) Col-0和bzr-q幼苗芽中花青素生物合成基因表达水平分析。
3、BR诱导的花青素积累依赖于MBW复合体的活性
为了研究BR诱导的花青素积累是否与MBW复合体的活性有关，作者检测了BL对MBW复合体相关突变体的影响。先前研究表明，PAP1驱动MBW复合体对花青素苷生物合成的转录调控，被PAP1标签激活的突变体pap1-D显著提高了的花青素水平。在本文中，作者发现除了花青素苷生物合成基因外，PAP1的过表达还显著上调了2个转录因子PAP2和TT8的表达(图3A-B)。此外，BL处理进一步促进了parp1-D突变体中花青素的积累，而pap1功能缺失突变体对BL和Bikinin不敏感(图3C-E)。说明PAP1对BR诱导的花青素积累是必需的。![]()
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图3. PAP1影响BR诱导的花青素积累。(A)和(B) Col-0和pap1-D幼苗芽中花青素生物合成基因A和组成MBW复合体的转录因子B的表达水平分析。(C)Col-0和pap1-D幼苗的表型。(D)C的花青素含量。(E) Col-0和pap1的花青素含量。
4、BZR1在体外和体内直接结合PAP1和PAP2启动子
作者通过分析PAP1 和PAP2基因的启动子，PAP1中找到3个含有E-box ( CANNTG )和1个G-box ( CACGTG )(图4A)，PAP2中找到8个含有E-box和1个G - box(图4F)。利用PAP1这4个E/G-box探针对MBP-BZR1进行电泳迁移率变动分析(图4B)，发现BZR1与含有G-box基序的探针有较强的结合。通过EMSA进一步证实了BZR1与PAP1-3探针的特异性结合(图4C)。为了研究BZR1在体内与PAP1启动子结合，作者通过荧光素酶活性测定，发现BZR1的加入使酶活性显著增加(图4D)。在PAP1启动子的染色质免疫共沉淀-实时定量PCR分析中，发现结合主要富集在包含PAP1-3和PAP1-4探针在内的PAP1-II区域(从ATG的-49到-220 bp)(图4E)。此外，相同的实验也发现BZR1在体内体外与PAP2启动子的含G-box的DNA区域发生结合(图4G-H)。![]()
图4. BZR1直接调控PAP1和PAP2的表达。(A)PAP1启动子的结构图。(B)EMSA验证MBP-BZR1与PAP1的结合。(C)利用突变DNA探针或竞争DNA探针验证。(D)ProPAP1:LUC荧光素酶活性测定。(E)ChIP-qPCR分析BZR1与PAP1启动子的结合。(F) PAP2启动子的结构图。(G)ProPAP2:LUC荧光素酶活性测定。(H)ChIP-qPCR分析BZR1与PAP2启动子的结合。
5、BZR1在体外和体内与PAP1和PAP2蛋白相互作用
通过测定花青素含量，作者发现由pap1-D突变引起的花青素积累在bri1 - 301和Sdet2突变体中显著减少(图5A)。这表明除了BR诱导的PAP1表达外，BR活性是PAP1蛋白调控花青素产生所必需的。之后通过pull down实验在体外验证GST-BZR1、BZR1-myc与MBP-PAP1的互作(图5B-C)。通过双分子荧光互补实验在拟南芥原生质体中进一步证实了BZR1与PAP1的体内互作(图5D)。在BL处理过的植株中，Co-IP实验发现PAP1主要与去磷酸化的BZR1相互作用，而不是与磷酸化的BZR1相互作用(图5E-F)。与PAP1类似，PAP2在体外和体内中也与BZR1存在相互作用。此外，在体内(附图S11C)中发现PAP2优先结合去磷酸化的BZR1。![]()
图5. BZR1与PAP1在体外和体内相互作用。(A)不同突变体的花青素含量。(B)和(C) pull down验证BZR1和PAP1的体外相互作用。(D)BiFC验证测BZR1与MBW复合体成员之间的相互作用。(E)Co-IP验证BZR1与PAP1之间的相互作用。(F)BL处理对BZR1与PAP1相互作用的影响。
6、BZR1与花青素合成基因的启动子结合
PAP1与BZR1存在相互作用，意味着BZR1可能与PAP1靶基因的启动子区结合。因此，作者进一步验证了BZR1与受PAP1调控的基因TT8和DFR的启动子结合。作者在TT8启动子中发现了1个G-box，1个PCE核心( CNCCAC )，和5个E- box基序(图6A)。设计5个探针( TT8-1~5)进行EMSA实验，结果表明BZR1与TT8 -1探针显著结合(图6B)。通过ChIP-qPCR实验也验证了这点(图6C)。作者发现在TT8和DFR启动子中，BZR1都结合在G-box和PCE核心基序的重叠区域，而花青素合成基因LDOX启动子含有一个G-box，不含PCE核心(图6D)。通过EMSA和ChIP-qPCR实验证明BZR1与LDOX基因启动子发生结合(图6E-F)。![]()
图6. BZR1直接结合TT8和LDOX启动子。(A)TT8启动子结构。(B)EMSA验证MBP-BZR1与TT8探针结合。(C)ChIP-qPCR验证BZR1-myc与TT8-1探针显著结合。(D)LDOX启动子结构。(E)EMSA验证MBP-BZR1与LDOX探针结合。(F)ChIP-qPCR验证BZR1-myc与LDOX-Ⅱ探针显著结合。
7、BZR1与PAP1/2的互作促进了花青素生物合成基因的表达
为了研究了BZR1与PAP1的相互作用是否增加了BZR1的DNA结合活性，作者发现在His-PAP1存在的情况下，MBP-BZR1与TT8-1探针结合程度显著增加(图7A)。PAP1的共表达进一步增强了BZR1对荧光素酶表达的激活作用(图7B)。同样，在PAP1存在的情况下，BZR1与LDOX启动子的结合也更强(图7C-D)。结果表明，BZR1与PAP1在G-box基序上的功能相互作用促进了花青素生物合成基因的表达。为进一步研究了BZR1与PAP1的功能互作是否发生在植物细胞中花青素苷生物合成基因的启动子上，作者通过使用GFP-trap和抗myc抗体进行免疫沉淀，富集了TT8和LDOX启动子的PAP1结合区域(图7E)，且BZR1存在于PAP1所属的同一个功能复合体中。通过荧光素酶报告实验，作者发现PAP2与BZR1的相互作用也增强了TT8和LDOX启动子的DNA结合活性(图7F-G)，但与PAP1相比，PAP2的转录活性相对较低。![]()
图7. BZR1与PAP1/2的相互作用增强了TT8和LDOX的表达。(A) PAP1促进BZR1与TT8启动子的结合。(B) TT8启动子驱动的荧光素酶相对活性测定。(C) PAP1促进BZR1与LDOX启动子的结合。(D) LDOX启动子驱动的荧光素酶相对活性测定。(E) PAP1和BZR1共同作用下TT8和LDOX启动子的ChIP-reChIP分析。(F) 和(G) 由TT8启动子和LDOX启动子驱动的荧光素酶相对活性测定。(H) PAP2和BZR1共同作用下TT8和LDOX启动子的ChIP-reChIP分析。
8、先前研究表明，BZR1的Glu37残基对于BZR1的DNA结合是必需的。
为了阐明BZR1在直接调控下游基因表达中的核心作用及其与PAP1的相互作用，作者克隆了缺乏结合DNA能力的BZR1E37D，体外pull - down实验证实，与野生型BZR1相比，BZR1E37D与PAP1具有几乎相似的结合亲和力(图8A)。通过荧光素酶报告实验，发现即使在PAP1存在的情况下，不具有DNA结合活性的BZR1E37D也不能增加LDOX启动子驱动的荧光素酶表达(图8B)。为了进一步研究BZR1在体内是否与MBW复合物发生功能上的相互作用，作者进行了基于TurboID的邻近标记实验，结果显示表明，BZR1与PAP1、TT8和TTG1相互作用(图8C)。![]()
图8. BZR1的DNA结合亲和力在增强花青素生物合成基因表达中起关键作用。(A) Pull Down检测PAP1与野生型BZR1或突变体BZR1E37D的相互作用。(B) BZR1和突变体BZR1E37D植株中PAP1驱动的LDOX启动子的荧光素酶表达活性。(C) TurboID-based proximity labeling assay。验证BZR1与MBW复合体相互作用。
9、BR在低氮条件下对促进花青素积累起关键作用
研究表明，在缺氮条件下BR信号可以调节植物氮的吸收。首先，作者检测了pap1、tt8、ttg1突变体中低氮条件诱导的花青素积累，3个突变体在低氮条件下诱导的花青素含量均低于野生型(图9A)。测定不同氮条件下pap1、tt8、ttg1突变体的根系生长无明显表型差异。接下来，作者检测了BR突变体在不同氮条件下的花青素积累情况。在低氮条件下，与Col-0相比，bzr1-1D和ProBZR1：bzr1-1D-CFP的花青素含量显著增加(图9B)。与Col-0相比，低氮条件下PAP1、DFR和LDOX在bzr1-1D中的表达量升高更为显著，而在Sdet2和bzr-q中的表达量降低(图9D-G)。以上结果表明，BR信号对于低氮条件下花青素生物合成基因的表达和花青素的积累是必需的。![]()
图9. 在低氮条件下，BR信号对花青素积累是必需的。(A)在高氮和低氮条件下，野生型、pap1、tt8和ttg1突变体幼苗芽中花青素水平。(B)和(C)在高氮和低氮条件下，Col-0、bzr1-1D和ProBZR1:bzr1-1D-CFP以及Col-0、Sdet2和bzr-q幼苗芽中的花青素水平。(D-F) 在高氮和低氮条件下PAP1、DFR和LDOX的相对基因表达水平。(G) 在高氮或低氮条件下，BZR1及其同源基因的相对表达水平。
